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Artículo de método

Un ensayo celular de reportero de macrófagos para examinar la señalización NF-kB/AP-1 mediada por receptores similares al peaje en capas de proteínas absorbentes en superficies poliméricas

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DOI:

10.3791/60317

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7 de enero de 2020

 ,  , 
1Department of Chemical Engineering, Queen's University

En este artículo

Resumen

Este protocolo proporciona a los investigadores un método rápido e indirecto para medir la actividad del factor de transcripción NF--B/AP-1 dependiente de TLR en una línea celular de macrófagomur en respuesta a una variedad de superficies poliméricas y capas de proteínas adsorbidas que modelan el microambiente de implantes de biomaterial.

Resumen

La persistente respuesta inflamatoria del huésped a un biomaterial implantado, conocido como reacción del cuerpo extraño, es un desafío significativo en el desarrollo e implementación de dispositivos biomédicos y construcciones de ingeniería de tejidos. Los macrófagos, una célula inmune innata, son actores clave en la reacción del cuerpo extraño porque permanecen en el sitio del implante durante la vida útil del dispositivo, y se estudian comúnmente para obtener una comprensión de esta respuesta perjudicial del huésped. Muchos investigadores de biomateriales han demostrado que las capas de proteínas adsorbidas en materiales implantados influyen en el comportamiento de los macrófagos y, posteriormente, afectan la respuesta del huésped. Los métodos de este artículo describen un modelo in vitro utilizando capas de proteínas adsorbidas que contienen moléculas de daño celular en superficies de biomaterial espolimérico para evaluar las respuestas de los macrófagos. Se utilizaron como método rápido para examinar indirectamente la actividad del factor de transcripción NF-B/AP-1 en respuesta a complejas capas de proteínas absorbentes que contienen proteínas sanguíneas y patrones moleculares asociados al daño, como modelo de las complejas capas de proteínas adsorbidas formadas en superficies biomateriales in vivo.

Introducción

La reacción del cuerpo extraño (FBR) es una respuesta crónica del huésped que puede afectar negativamente el rendimiento de un material o dispositivo implantado (por ejemplo, dispositivos de administración de medicamentos, biosensores), a través de la liberación persistente de mediadores inflamatorios y al impedir la integración entre el material implantado y el tejido circundante1. Esta respuesta inmune innata se inicia por el procedimiento de implantación y se caracteriza por la presencia a largo plazo de células inmunitarias innatas y la formación de cápsulas fibrosas alrededor del implante1. En el contexto de las respuestas materiales del huésped, las interacciones entre macrófagos y materiales tienen un impacto significativo en la progresión de la respuesta del huésped y el desarrollo de un FBR1. Los macrófagos son una población de células inmunitarias innatas diversas, reclutadas en el sitio del implante, ya sea de poblaciones de macrófagos residentes en tejidos o de la sangre como macrófagos derivados de monocitos. Comienzan a acumularse en el sitio del implante poco después de la implantación, y en cuestión de días se convierten en la población celular predominante en el microambiente del implante. Los macrófagos adherentes a los materiales, junto con las células gigantes de cuerpo extraño (FBGC) formadas a través de la fusión de macrófagos, pueden persistir en la superficie del material durante la vida útil del implante2,3. En consecuencia, los macrófagos se consideran actores clave en la respuesta del cuerpo extraño debido a sus funciones orquestando los pasos característicos de la FBR: respuesta inflamatoria aguda, remodelación tisular y formación de tejido fibroso1.

Los receptores similares a los peajes (TLR) son una familia de receptores de reconocimiento de patrones que son expresados por muchas células inmunitarias, incluyendo macrófagos, y se ha demostrado que juegan un papel importante en la inflamación y la cicatrización de heridas. Además de los ligandos derivados de patógenos, los TLR son capaces de unir moléculas endógenas, conocidas como patrones moleculares asociados al daño (DAPP), que se liberan durante la necrosis celular y activan las vías de señalización inflamatoria que resultan en la producción de citoquinas proinflamatorias4. Nosotros y otros hemos propuesto que el daño incurrido durante los procedimientos de implantación de biomateriales de tejido blando libere a los DAMPs, que luego se adsorbe a las superficies biomateriales además de las proteínas de la sangre y modulalas las interacciones entre células y materiales subsiguientes5,6. Cuando los macrófagos interactúan con la capa de proteína adsorbida en un implante, sus TDR de superficie pueden reconocer los DPR adsorbidas y activar cascadas de señalización proinflamatoria, lo que conduce a la activación del factor de transcripción NF-B y AP-1 y a la producción de citoquinas proinflamatorias. Hemos demostrado anteriormente que los macrófagos murinos han aumentado significativamente la actividad de NF-B/AP-1 y el factor de necrosis tumoral (TNF-- secreción proinflamatoria de citoquinas) en respuesta a las capas de proteína adsorbida que contienen DAMP en una variedad de superficies poliméricas en comparación con superficies con suero o plasma adsorbida solamente (es decir, no hay DAPP presentes), y que esta respuesta está mediada en gran medida por TLR2, mientras que TLR4 desempeña un papel menor5.

La línea celular de macrófagos de reportero NF-B/AP-1utilizadaen este protocolo es un método conveniente para medir la actividad relativa NF--B y AP-1 en macrófagos5,7,8. En combinación con los inhibidores de la vía TLR, esta línea celular es una herramienta útil para investigar la activación de TLR y su papel en la inflamación en respuesta a una variedad de estímulos5,7,8. Las células reporteras son una línea celular modificada similar a un macróforo de ratón que puede producir establemente fosfatasa alcalina embrionaria secreta (SEAP) sobre la activación del factor de transcripción NF-B y AP-19. El ensayo fosfatasa alcalina colorimétrica enzimática(Tabla de materiales) se puede utilizar para cuantificar las cantidades relativas de expresión SEAP como una medida indirecta de la actividad NF-B/AP-1. Como NF-B y AP-1 son aguas abajo de muchas vías de señalización celular, se pueden utilizar anticuerpos e inhibidores neutralizantes dirigidos a TlR específicos (por ejemplo, TLR2) o moléculas de adaptador TLR (por ejemplo, MyD88) para verificar el papel de una vía específica. La metodología descrita en este artículo proporciona un enfoque sencillo y rápido para evaluar la contribución de la señalización TLR en las respuestas de macrófagos murinos a una variedad de superficies poliméricas con capas de proteínas adsorbidas que contienen proteínas de la sangre y DAPP como modelo in vitro de biomateriales implantados.

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Protocolo

1. Preparación de medios y reactivos

  1. Prepare los medios de fibroblastos. Combinar 450 ml del medio águila modificado de Dulbecco (DMEM), 50 ml de suero bovino fetal (FBS) y 5 ml de penicilina/estreptomicina. Conservar a 4oC durante un máximo de 3 meses.
  2. Prepare medios de crecimiento de macrófagos reporteros en alícuotas de 50 ml. Combinar 45 ml de DMEM, 5 ml de FBS, 5 g/ml de reactivo de eliminación de micoplasma(Tabla de materiales)y 200 g/ml de fleomicina D1(Tabla de materiales). Conservar a 4oC durante un máximo de 3 meses.
  3. Prepare los medios de ensayo de macrófagos de reportero en alícuotas de 50 ml. Combinar 45 ml de DMEM, 5 ml de FBS inactivado por calor (HI-FBS), 5 g/ml de reactivo de eliminación de micoplasma y 200 g/ml de fleleomicina D1. Conservar a 4oC durante un máximo de 3 meses.

2. Recubrimiento superficies de cultivo celular con poli(metil metacrilato)

  1. Disolver poli(metil metacrilato) (PMMA) en cloroformo a 20 mg/ml (por ejemplo, 100 mg de PMMA en 5 ml de cloroformo) en un vial de centelleo de vidrio de 20 ml. Coloque una barra de agitación magnética en el vial y deje que se revuelva durante al menos 2 horas, hasta que todos los sólidos se disuelvan.
    PRECAUCION: El cloroformo es dañino si se inhala. Asegúrese de usar disolvente en una campana de humos mientras usa guantes de PVA.
  2. Pipetear 400 l de solución de PMMA en el centro de un portaobjetos de microscopio de borosilicato en una capa de centrifugado, y girar a 3000 rpm durante 2 min. Prepare el número de diapositivas necesarias para el ensayo, así como 3 x 5 adicionales para la medición del ángulo de contacto con el agua. Almacene los portaobjetos en una caja limpia (pulverizadas y limpiadas con 70% de etanol) para su uso futuro.
    NOTA: El recubrimiento de espín se utiliza a menudo para depositar un recubrimiento delgado y uniforme en una superficie plana. Un revestimiento de espín gira un sustrato a altas velocidades, utilizando la fuerza centrífuga para extender la solución de recubrimiento sobre la superficie.
    1. Mida el ángulo de contacto del agua en dos posiciones aleatorias en la superficie de los portaobjetos recubiertos adicionales (es decir, no los portaobjetos que se utilizan para el cultivo celular) con un goniómetro para garantizar que la superficie de vidrio esté completamente recubierta con el polímero.
      NOTA: Sólo se debe utilizar agua de la más alta pureza (por ejemplo, vidrio triple destilado) para mediciones de ángulo de contacto con el agua.
  3. En un armario de seguridad biológica (BSC) conecte los pozos pegajosos de 8 cámaras a los portaobjetos recubiertos de PMMA utilizando fórceps estériles y siguiendo la técnica aséptica. Presione firmemente en la parte superior de los pozos pegajosos para asegurarse de que están fuertemente unidos. Incubar los portaobjetos con pozos pegajosos unidos a 37 oC durante la noche para asegurar el sello.
    1. Pruebe el sello de los pozos pegajosos añadiendo 200 ml de agua de grado de cultivo celular (libre de endotoxinas) a cada pocillo. Incubar a temperatura ambiente (RT) durante 60 minutos y asegurar se quede sin fugas antes de proceder. Aspirar el agua, teniendo cuidado de no molestar el recubrimiento de PMMA.
  4. Realice lavados de agua sin endotoxinas añadiendo 300 ml de agua libre de endotoxinas a cada poca y incubando durante 1 h (tres veces), 12 h y 24 horas antes de su uso para eliminar cualquier disolvente restante.
  5. Pruebe la concentración de endotoxinas de las diapositivas que se utilizarán para el cultivo celular. Incubar 200 l de agua reactivo libre de endotoxinas(Tabla de materiales) en un pozo de cada diapositiva durante 1 h. Medir la concentración de endotoxinas en el extracto utilizando un ensayo de endotoxina cromogénica de punto final (Tabla de materiales).
    NOTA: El siguiente protocolo es específico del kit de ensayo de endotoxinas que figura en la Tabla de materiales.
  6. Utilice únicamente agua y consumibles (es decir, puntas de pipeta, tubos de microcentrífuga y placas de pozos) que estén certificados libres de pirógenos (es decir, libres de endotoxinas) para este trabajo. Además, cualquier cristalería utilizada en la preparación de las superficies recubiertas de polímero debe despirarse utilizando esterilización por calor seco (250 oC durante 30 minutos) antes de utilizar10. La medición de la endotoxina en la solución de extracto, como se describe aquí, puede dar lugar a una subestimación de la endotoxina en la superficie del material11,12. En consecuencia, se recomienda que al desarrollar un protocolo de recubrimiento de polímeros, realice la reacción de ensayo de endotoxina (es decir, los pasos 2.5.4-2.5.6 para las muestras de ensayo [agua reactiva] o controles de espiga) directamente dentro de los pozos que contienen la muestra recubierta para asegurarse de que no se introducen inadvertidamente en el sistema fuentes de endotoxinas durante el proceso de recubrimiento.
    1. Lleve todas las muestras de ensayo (es decir, extractos) y los reactivos de ensayo de endotoxinas a RT. Reconstituya el reactivo cromogénico en el tampón de ensayo y la norma de endotoxina en agua reactiva, permita disolverse durante 5 minutos y revuelva suavemente antes de usarlo. Cubra todas las botellas con película de parafina cuando no esté en uso.
    2. Cree una curva de dilución estándar de 5 x 8 puntos del estándar de endotoxina que va desde el límite inferior al límite superior del ensayo mediante la realización de una dilución en serie del estándar de endotoxina en agua reactivo.
    3. Para controlar la mejora o inhibición del ensayo de endotoxina en muestras de prueba, prepare un control positivo (también llamado control de picos o muestra salpicada) diluyendo una cantidad conocida de endotoxina en la solución de muestra de prueba no utilizada.
      NOTA: La concentración del control positivo debe ser la misma concentración que una norma en el centro de la curva estándar. Si la cantidad recuperada del pico de la endotoxina (es decir, la concentración del control positivo menos la concentración de la muestra de ensayo sin pico) está dentro del 50-200% de la concentración nominal del pico de la endotoxina, se puede considerar que la solución de extracción no interfiere significativamente con el ensayo.
    4. Agregue 50 s de estándares, muestras o controles de púas a cada pocto de una placa de 96 pocillos en duplicado o triplicado. Utilice agua reactivo como control negativo.
    5. Añadir 50 ml de reactivo cromogénico a cada pocómetro. Agregue el reactivo rápidamente a todos los pozos. Utilice un temporizador para registrar la cantidad de tiempo que se tarda en agregar reactivo a todos los pozos. Cubra la placa con un sello adhesivo e incubar a 37 oC (el tiempo de incubación depende del lote y se indica en el certificado de análisis incluido en el kit de reactivos cromogénicos). Alternativamente, compruebe la placa cada 15 minutos durante la incubación hasta que se observe el cambio de color en todos los pozos estándar.
    6. Después de la incubación, añadir 25 s l de ácido acético 50% a cada poca (concentración final de 10% ácido acético por poca) para detener la reacción. Añadir ácido acético en el mismo orden en que se añadió el reactivo cromogénico. Lea la absorbancia de la placa utilizando un lector de placas a 405 nm. Aspirar líquido y desechar la placa.
      NOTA: La adición de ácido acético debe tardar el mismo tiempo en añadira a cada uno bien que el reactivo cromogénico (30 s).
  7. Ultravioleta (UV) esteriliza las diapositivas durante 30 minutos antes de los experimentos de cultivo celular.

3. Recubrimiento superficies de cultivo celular con polidimetilsiloxano

  1. Mezclar el elastómero de polidimetilsiloxano (PDMS) en una relación de peso de 10:1 (base:agente de curado). En un armario de seguridad biológica, pipeta aproximadamente 10 ml de base de polidimetilsiloxano en un tubo estéril. Pesar el tubo y añadir lentamente el agente de curado hasta que se haya añadido un 10%.
    PRECAUCION: Utilice reactivos PDMS en un área bien ventilada y evite el contacto visual con gafas de seguridad.
  2. Mezcle bien el elastómero revolviendo con una punta de pipeta serológica estéril y pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Agregue aproximadamente 200 s de la solución a cada pocal de una placa de 48 pocillos. Incline la placa de pozo lentamente para asegurar una cobertura completa de los pozos con solución de elastómero.
  3. Coloque la placa de pozo con elastómero en un horno al vacío a 50 cmHg, 40 oC. Retire la tapa y la cubierta con una toallita de una sola hoja para evitar que otros residuos caigan en los pozos. Dejar incubar durante al menos 48 h.
    1. Confirme que los pozos están completamente recubiertos a través de inspección visual. Asegúrese de que el elastómero esté completamente curado mediante una proddesción suave con una punta de pipeta estéril antes de retirarlo.
  4. Añadir 300 l de etanol 70% (hecho con etanol absoluto y agua libre de endotoxinas) e incubar a RT durante 1 h. Retire el etanol y realice lavados de agua libres de endotoxinas añadiendo 300 ol de agua libre de endotoxinas a cada pozo e incubando durante 1 h (tres veces), 12 h , y 24 h antes de su uso para eliminar cualquier disolvente restante.
    1. Incubar 200 l de agua libre de endotoxinas en tres pocillos de cada placa durante 1 h. Medir la concentración de endotoxinas de los extractos de agua utilizando un ensayo de endotoxina cromogénica de punto final (pasos 2.5.1-2.5.6).

4. Superficies de cultivo celular de recubrimiento con poli fluorado (tetrafluoroetileno)

  1. Hacer una solución de 1 mg/ml de polifluorado (tetrafluoroetileno) (fPTFE) (por ejemplo, añadir 10 mg de fPTFE a 10 ml de disolvente fluorado [Tabla de materiales]) en un vial de centelleo de vidrio de 20 ml. Coloque una barra de agitación magnética en el vial y deje que se revuelva durante al menos 24 horas, hasta que todos los sólidos se disuelvan.
  2. Añadir aproximadamente 150 l de la solución de polímero a cada pocal de una placa de 48 pocillos de poliestireno (es decir, no el cultivo tisular tratado). Incline la placa de pozo lentamente para asegurar una cobertura completa de todos los pozos con solución de polímero. Vuelva a colocar la tapa.
    1. Para garantizar un recubrimiento eficaz de fPTFE de los pozos, los revestimientos de vidrio deben revestirse en fPTFE y utilizarse para la medición del ángulo de contacto del agua (paso 4.3.1). Coloque los labios de las cubiertas dentro de los pocillos de una placa de 24 pocillos. Añadir aproximadamente 400 l de la solución de polímero a cada pocal que contenga un cubreobjetos. Empuje los labios de las cubiertas hacia abajo usando fórceps estériles, asegurándose de que estén completamente cubiertos de solución de polímero, y cubra la placa del pozo con una tapa.
  3. Coloque la placa de pozo con solución de polímero y/o cubiertas en un horno al vacío a 50 cmHg, 40 oC. Retire la tapa y la cubierta con una toallita de una sola hoja para evitar que otros residuos caigan en los pozos. Dejar incubar durante al menos 48 h.
    1. Mida el ángulo de contacto con el agua de los revestimientos recubiertos de fPTFE con un goniómetro para garantizar un recubrimiento eficaz.
      NOTA: Sólo se debe utilizar agua de la más alta pureza (por ejemplo, vidrio triple destilado) para mediciones de ángulo de contacto con el agua.
  4. Añadir 300 l de etanol 70% (hecho con etanol absoluto y agua libre de endotoxinas) e incubar a RT durante 1 h. Retire el etanol y realice lavados de agua libres de endotoxinas añadiendo 300 ol de agua libre de endotoxinas a cada pozo e incubando durante 1 h (tres veces), 12 h , y 24 h antes de su uso para eliminar cualquier disolvente restante.
    1. Incubar 200 l de agua libre de endotoxinas en tres pozos de cada placa durante 1 h. Medir la concentración de endotoxinas de extractos de agua utilizando un ensayo de endotoxina cromogénica de punto final (pasos 2.5.1 a 2.5.6).
  5. LOS rayos UV esterilizan las placas de pozo durante 30 minutos antes de los experimentos de cultivo celular.

5. Hacer lisado a partir de células 3T3

  1. Cultivar células 3T3 en múltiples matraces T150 a 70% de confluencia. Para separar las células, aspirar medios, lavar la superficie con 5 ml de PBS y aspirar PBS. Añadir 5 ml de enzima de disociación celular recombinante libre de origen animal(Tabla de materiales)e incubar a 37 oC durante 3 x 5 min.
  2. Separe las células inclinando suavemente el matraz hacia adelante y hacia atrás. Añadir 5 ml de PBS para neutralizar la enzima recombinante utilizada para la disociación celular. Transfiera las células separadas de los matraces a un tubo centrífugo y mezcle a través de pipeteo. Realice un recuento de células vivas utilizando un hemocitómetro y un tinte de viabilidad celular.
    NOTA: Se seleccionó una enzima disociación celular que puede ser neutralizada a través de la dilución en PBS para evitar la introducción de proteínas a base de suero en la preparación de lisato. Si se utiliza tripsina para disociar las células, debe neutralizarse con una solución que contenga suero, y se debe realizar un lavado adicional de PBS para reducir la cantidad de proteínas séricas transportadas a la preparación de lisado.
  3. Centrifugar las células a 200 x g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en el volumen original (es decir, 10 ml x número de matraces) de PBS para lavar cualquier medio restante. Repetir.
  4. Centrifugar las células de nuevo a 200 x g durante 5 min y aspirar el sobrenadante. Agregue el volumen de PBS necesario para lograr una concentración celular final de 1 x 106 células/ml. Colocar la solución celular en un congelador de -80 oC hasta que la muestra esté completamente congelada (al menos 2 h).
  5. Descongelar la solución celular en un baño de agua a 37 oC. Una vez descongelado completamente, vuelva a colocar la solución en el congelador de -80 oC hasta que esté totalmente congelada. Repita para un total de 3 ciclos de congelación-descongelación.
  6. Realizar un ensayo de ácido micro bicininicónico (BCA) en el lisado celular en una variedad de diluciones (por ejemplo, 1/100, 1/200, 1/500, 1/1000) para determinar la concentración de proteínas. Diluir el lisado celular a una concentración proteica de 468,75 g/ml, alícuota y almacenar a -80 oC para su uso futuro.
    NOTA: La concentración final de proteína en una placa de 48 pocillos es de 125 g/cm2 (basada en la superficie de un pozo, 0,75 cm2).
  7. Realizar una mancha occidental para evaluar la presencia de DPP en el lisato (por ejemplo, proteína de choque térmico 60 [HSP60], caja de grupo de alta movilidad 1 [HMGB1]) cargando 40 x 60 g de proteína de lisado en el búfer de carga en un gel de poliacrilamida de 1,5 mm de espesor y 10% y siga la blotdemida occidental estándar en un gel de poliacrilamida occidental de 1,5 mm de espesor y siga la blota occidental estándar y siga la blota occidental estándar en un gel de poliacrilamida occidental estándar y siga la blot western estándar Procedimientos.

6. Evaluación del efecto de las capas de proteínas absorbidas y los receptores similares al peaje en la actividad NF-B de los macrófagos

NOTA: Para obtener un esquema del flujo de trabajo experimental y el diseño de placas, consulte la Figura 1A y la Figura suplementaria 1, respectivamente.

  1. Cultiva los macrófagos de reportero en un matraz de tamaño adecuado a un 70% de confluencia. Aspirar medios, lavar la superficie con PBS y aspirar PBS. Añadir la enzima de disociación de células recombinantes e incubar a 37oC durante 8 min.
  2. Separe las células tocando firmemente los lados del matraz. Inactivar la enzima disociación celular recombinante añadiendo un volumen igual de medios de crecimiento (que contiene 10% FBS). Realice un recuento de células vivas utilizando un hemocitómetro y un tinte de viabilidad celular.
    NOTA: La viabilidad esperada para los macrófagos del reportero después de una incubación de 8 minutos en la enzima de disociación celular es del 90%.
  3. Células centrífugas a 200 x g durante 5 min. Aspirate sobrenadant y resuspenden en volumen original de PBS para lavar las células. Centrifugar de nuevo y resuspender las células a 7,3 x 105 células/ml en medios de ensayo (que contienen FBS inactivado por calor).
  4. Separe la suspensión celular en 3 tubos diferentes: inhibidor TLR4, anti-TLR2 y sin tratar. Incubar células con 1 inhibidor de TLR4 g/ml durante 60 min a RT o con 50 g/ml anti-TLR2 durante 30 min a RT.
  5. Añadir 200 ml de lisato, 10% FBS, 10% plasma de ratón comercial(Tabla de materiales),o una mezcla de las soluciones proteicas a una placa de 48 pocillos (o equivalente) y permitir que la proteína se absorba a 37 oC durante el tiempo deseado (es decir, 30 min, 60 min o 24 h). Aspirar las soluciones proteicas de los pozos, utilizando una pipeta Pasteur fresca para cada solución proteica, y lavar superficies con 250 ml de PBS durante 5 min. Repita el proceso para un total de 3 lavados.
    NOTA: Es posible que este paso deba iniciarse antes en el protocolo en función del tiempo de adsorción deseado. Ajuste el protocolo en consecuencia.
  6. Después del período de incubación con el inhibidor TLR4 o anti-TLR2, las células de pipeta se resuspenden. Añadir 200 l de solución celular a cada poca.
  7. Para la condición de control positivo TLR2, agregue Pam3CSK4 a una concentración final de 150 ng/mL. Para la condición de control positivo TLR4, agregue lipopolisacárido (LPS) a una concentración final de 1,5 g/ml. Incubar células a 37oC durante 20 h.
  8. Muestre 20 ml de sobrenadante de cada pocal y placa en duplicado en una placa de 96 pocillos. Incluya tres pozos de medios de ensayo de 20 l como control de fondo. Añadir 200 ol de reactivo de ensayo de reportero SEAP a cada pozo. Cubrir la placa con un sello adhesivo e incubar durante 2,5 h a 37 oC.
    NOTA: El tiempo de incubación puede variar dependiendo de las condiciones experimentales, y debe optimizarse para una fuerte diferencia en la absorción entre los pozos de control positivos y negativos.
    1. Transfiera el resto del sobrenadante a un tubo de 1,5 ml (por poca). Centrífuga a 1.000 x g durante 10 minutos para peletizar cualquier escombro. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 ml y guárdelo a -80 oC. Analizar el sobrenadante para detectar la presencia de citoquinas proinflamatorias (p. ej., TNF-, interleucina 6) a través del ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).
  9. Retire el sello de la placa adhesiva. Lea la absorbancia de la placa utilizando un lector de placas a 635 nm. Aspirar líquido y desechar la placa.

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Resultados

Se probaron métodos de limpieza para las superficies recubiertas de polímero para garantizar que no hubiera interrupción del recubrimiento, lo que se vería como un cambio en el ángulo de contacto del agua a un revestimiento de vidrio sin recubrimiento(Figura 2). Se encontró que el remojo de los portaobjetos recubiertos con PMMA en etanol 70% durante 1 h elimina el recubrimiento de PMMA(Figura 2, panel izquierdo), probablemente debido a la solubilidad de PMMA en ...

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Discusión

Un enfoque principal de nuestro laboratorio es la respuesta del huésped a los implantes de tejido blando biomaterial sólido, y en particular cómo el daño celular incurrido durante el procedimiento de implantación afecta la respuesta del huésped. El trabajo presentado aquí describe experimentos preliminares utilizando una línea celular de macrófagos de reportero y un lisato celular que contiene DAMP generado in vitro, para investigar la influencia de las moléculas liberadas durante el daño celular (es decir, de la cirugía...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores agradecen la financiación operativa de Canadian Institutes of Health Research Project (PTJ 162251), el Comité asesor de investigación del Senado de la Universidad de Queen y el apoyo a la infraestructura de la Fundación Canadiense para la Innovación del Fondo de Liderazgo john Evan (Proyecto 34137) y el Fondo de Investigación de Ontario del Ministerio de Investigación e Innovación (Proyecto 34137). L.A.M. fue apoyado por una beca R. Samuel McLaughlin de la Universidad de La Reina, un Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá Canadian Graduate Scholarship's Award y una Beca de Posgrado de Ontario. Los autores quieren agradecer al Dr. Myron Szewczuk por su generoso don de la línea celular de los macrófagos de reportero NF-B/AP-1 y a los doctores Michael Blennerhassett y Sandra Lourenssen por el uso de su sistema de imágenes de gel y lector de placas.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Reactivos de cultivo celular
anti-ratón/humano CD282 (TLR2)Biolegend121802
CLI-095 (inhibidor de TLR4)InvivogenTLRL-CLI95
C57 complemento plasma K2 EDTA 10ml, grado innovador Origen estadounidenseInnovativeResearchIGMSC57-K2 EDTA-Compl-10mlPlasma de ratón
Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM)Sigma AldrichD6429-500ML
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS)Fisher Scientific 14190250Sin calcio, sin magnesio
Suero fetal bovino (FBS), grado de investigaciónWisent98150
LPS-EKInvivogenTLRL-EKLPSLipopolisacárido de Escherichia coli K12
NIH/3T3 fibroblastosATCCCRL-1658
Pam3CSK4Invivogentlrl-pmsLipopéptido triacilado sintético - ligando TLR1/2
Penicilina/estreptomicinaSigma AldrichP4333-100ML
PlasmocinaInvivogenANT-MPPReactivo de eliminación de micoplasmas
RAW-Células azulesInvivogenraw-spNF-κ Línea celular de macrófagos reporteros B/AP-1
Solución de azul de tripano, 0,4 %Fisher Scientific15250061
Enzima expresa TrypLE (1X)Fisher Scientific12604021enzima de disociación celular recombinante libre de origen animal
ZeocinInvivogenANT-ZN-1
Kits y ensayos
Placas prerrevestidas de ELISA, placa prerrevestida de ratón IL-6BiolegendB213022
ELISA, TNF-y alfa de ratón;BiolegendB220233
Endotoxina (Escherichia coli) - Endotoxina estándar de control (CSE)Asociados de Cape Cope Inc.E0005-5Endotoxina para curva estándar en ensayo de endotoxinas cromogénicas
Agua LAL, 100 mLAssociates of Cape Cope Inc.WP1001Utilizado con ensayo de endotoxinas cromogénicas
Ensayo de proteínas Micro BCAFisher ScientificPI23235
Limulus amebocyto lisado (LAL) Kit de prueba de endotoxinaspirocromáticas Associates of Cape Cope Inc.C1500-5Reactivo de ensayo de endotoxinas cromogénicas
Medio de detección de fosfatasa alcalina QUANTI-Blue Ensayo de fosfatasaRep-qb2Invivogenmedir indirectamente NF-κ B/AP-1 actividad
Reactivos de recubrimiento polimérico
Chloroform, anhidroSigma Aldrich288306-1L
Alcohol etílico anhidroAlcoholes comercialesP006EAANSigma: Alcohol reactivo, anhidro, 676829-1L
Pinzas rectas de punta fina cónica FisherScientific16-100-113
Disolvente fluorado FC-40Sigma AldrichF9755-100MLDisolvente fluorado para fPTFE
Agua de grado de cultivo celular (libre de endotoxinas)Fisher Scientific
Poli(metacrilato de metilo) (PMMA)Sigma Aldrich182230-25G
Sylgard 184 kit de elastómeroFisher Scientific
Teflón-AF (fPTFE)Sigma Aldrich469610-1GPoly[4,5-difluoro-2,2-bis(trifluorometil)-1,3-dioxole-co-tetrafluoroetileno]
Consumibles
Juntas de placas adhesivasFisher ScientificAB-0580
Microtubos Axygen, 1,5mL Fisher Scientific14-222-155
Viales de centelleo de vidrio de borosilicato, con tapas de polipropileno blancoFisher Scientific03-337-4
Placa transparente PS de 48 pocillosFisher Scientific08-772-52
Placa transparente TCPS de 96 pocillosFisher Scientific08-772-2C
Placa transparente TCPS de 48 pocillosFisher Scientific08-772-1C
Cubreobjetos, círculosFisher Scientific12-545-81
Matraces tratados para cultivo de tejidos Falcon, T25Fisher Scientific10-126-10
sticky-Slide 8 WellIbidi80828
Portaobjetos de microscopio SuperfrostFisher Scientific12-550-15
Matraces tratados para cultivo de tejidos, T150Fisher Scientific08-772-48
alcalina para SH30529LS 50822180

Referencias

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