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Aplicaciones de hibridación in situ de ARN viral/ADN de próxima generación en la investigación del virus de inmunodeficiencia humana/virus de inmunodeficiencia de simios

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DOI:

10.3791/60318

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17 de junio de 2020

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1AIDS and Cancer Virus Program, Frederick National Laboratory for Cancer Research, Leidos Biomedical Research Inc., 2Vaccine and Gene Therapy Institute and Oregon National Primate Research Center (ONPRC), Oregon Health and Science University (OHSU)

En este artículo

Resumen

Aquí presentamos un ensayo de hibridación in situ de próxima generación para identificar secuencias específicas de ARN o ADN viral en tejidos embebidos en parafina fijados en formol (FFPE). Este enfoque permite la visualización de copias bajas de ARN y ADN en menos de 24 h con una sensibilidad y especificidad muy altas.

Resumen

La hibridación in situ es una técnica poderosa para identificar secuencias específicas de ARN o ADN dentro de células individuales en secciones de tejido, lo que proporciona información importante sobre los procesos fisiológicos y la patogénesis de la enfermedad. La hibridación in situ (ISH) se ha utilizado durante muchos años para evaluar la ubicación de las células infectadas por virus, pero recientemente se desarrolló un enfoque de ISH de próxima generación con una estrategia de diseño de sonda única que permite la amplificación simultánea de la señal y la supresión de fondo para lograr la visualización de una sola molécula mientras se conserva la morfología del tejido. Esta ISH de próxima generación se basa en un enfoque similar a la PCR ramificada, pero realizada in situ y es más fácil, sensible y reproducible que los métodos clásicos de ISH o los enfoques de PCR in situ para detectar de forma rutinaria ARN o ADN en tejidos embebidos en parafina fijados en formol (FFPE). Durante los últimos años, nuestro laboratorio ha estado aplicando esta plataforma ISH para la detección de células positivas de ARN viral (vDNA) e inmunodeficiencia humana (VIH) e inmunodeficiencia simia (SIV) y/o ADN viral (ADNv) dentro de una multitud de tejidos FFPE. Con este detallado manuscrito técnico, nos gustaría compartir nuestros conocimientos y consejos con todas las personas interesadas en utilizar la ISH de próxima generación en sus investigaciones.

Introducción

ISH es el enfoque experimental utilizado para dirigir y visualizar cadenas complementarias de ADN, ARN o ácido nucleico modificado (es decir, sondas) a secuencias específicas de ADN o ARN dentro de una célula o sección de tejido. La ISH permite la localización y visualización específica de secuencias nucleicas específicas en los tejidos, lo que es importante para comprender el nivel de expresión, la organización, la distribución y las interacciones entre el objetivo y su entorno celular, que es una información valiosa que no se puede obtener con el uso de otras técnicas populares, como la qPCR. Hasta hace poco, la ISH se realizaba comúnmente con un ADN complementario marcado o un ARN complementario (ribosonda). Estas sondas se conjugaron directamente con bases marcadas con radio, fluorescentes o antígenos (por ejemplo, 35S, FITC y digoxigenina) y luego se localizaron y cuantificaron en el tejido mediante enfoques de detección de autorradiografía, microscopía de fluorescencia o inmunohistoquímica, respectivamente. Si bien estas tecnologías in situ siguen siendo enfoques valiosos, existe un amplio margen de mejora para desarrollar enfoques que sean menos laboriosos, más simples, más rápidos, sensibles y específicos.

Un enfoque comercial alternativo de ISH de próxima generación (por ejemplo, ensayo de ARNscope), descrito por primera vez en 2012, para la detección de ARN mensajero del huésped (ARNm) se basa en la PCR ramificada. La detección de ARNm se realiza en células y tejidos FFPE, con una sensibilidad cercana a la visualización de una sola molécula de ARN en células individuales1. La especificidad de este enfoque se logra bajo la condición única de que dos sondas diana de doble Z se unan contiguamente a sus respectivas secuencias complementarias de ARN (o ADN) para que un preamplificador de señal se una secuencialmente a1. Esto permite el inicio de una cascada de amplificación de señal a través de pasos de hibridación posteriores similares al ADN ramificado (ADNb)1,2. Además, este enfoque es notablemente rápido y fácil, con resultados obtenidos en solo 1 día (<8 h), una ventaja significativa en comparación con hasta 4 semanas con técnicas alternativas, incluyendo Radio-ISH 1,2. Esta ISH de próxima generación ha abierto nuevas perspectivas y oportunidades para la investigación del VIH/VIS. Los principales obstáculos para la cura del VIH son los reservorios celulares y tisulares que se establecen durante las primeras etapas de la enfermedad 3,4. El objetivo general de esta técnica es identificar, localizar y, en última instancia, comprender los principales compartimentos tisulares que actúan como reservorio viral y son persistentes dentro de un huésped infectado. Esto, a su vez, ayudará a desarrollar estrategias eficaces de curación contra el VIH.

En este manuscrito, explicamos en detalle nuestro protocolo ISH dúplex de próxima generación de ARN/ADN múltiple (por ejemplo, RNAscope/DNAscope) y explicamos cómo modificamos el protocolo ISH de ARN existente para optimizar la ISH de próxima generación para nuestras muestras y objetivos específicos. Este protocolo permite la visualización, localización y cuantificación del ARN viral y el ADN viral del VIH/VIS dentro de secciones de tejido de 5 μm. La visualización simultánea de ARNv y ADNv se realiza mediante la combinación de dos conjuntos de sondas personalizadas: un sensor, dirigido a la cadena codificante de ADNv (sonda C1 SIVmac239 Gag-Pol-Sense [416141-C1]), y un antisentido, dirigido a las transcripciones de ARNv (sonda C2 SIVmac239 Vif-Env-Nef-Tar-Anti-Sense [416131-C2]) que cubre diferentes regiones del genoma viral (Tabla 1), utilizando dos canales de visualización diferentes, C1 y C2. En este protocolo, los canales C1 y C2 nos permiten visualizar señales en diferentes colores (es decir, AP en rojo y HRP en marrón) y detectar las sondas con diferentes enfoques. Excluyendo el procesamiento y corte de fijación de tejidos, este ensayo tarda 2 días. Aquí se presenta el protocolo de hibridación in situ de vRNA dúplex y vDNA que se puede realizar en gránulos de células o secciones de tejido.

Protocolo

1. Preparación de secciones y portaobjetos

  1. Recorte los bloques de parafina y use un micrótomo para cortar secciones de 5 +/-1 μm. Monte las secciones o los gránulos de celda en portaobjetos de microscopio cargados en un baño de agua libre de ARNasa a 40-45 °C. Seque al aire los toboganes durante la noche a 37 °C o RT.
    NOTA: Los portaobjetos pueden almacenarse hasta 3 meses a temperatura ambiente (RT) y 6 meses a 4 °C.
  2. Deparafinar portaobjetos FFPE.
    1. Hornee los portaobjetos en un horno seco durante 1 h a 60 °C.
    2. En una campana extractora, llene dos platos de tinción deslizantes con ~200 mL de xileno fresco y dos platos de tinción adicionales con ~200 mL de etanol fresco 100%. Cubra los recipientes con tapas.
    3. Coloque los portaobjetos en una rejilla y sumérjalos en el primer plato que contenga xileno. Incubar durante 5-10 min a RT con agitación.
    4. Coloque los portaobjetos en el segundo plato que contiene xileno e incube durante 5-10 min a RT con agitación.
    5. Coloque inmediatamente los portaobjetos en el plato que contiene etanol al 100%. Incubar los portaobjetos durante 5-10 min en RT con agitación.
    6. Coloque inmediatamente los portaobjetos en el segundo plato que contiene etanol al 100% e incube durante 5-10 min a RT con agitación.
    7. Retire la rejilla del etanol, golpee suavemente el costado de la rejilla para eliminar el exceso de etanol y enjuague con agua sin ARNasa durante 5-15 minutos.

2. Preparación del horno

  1. Encienda el horno de hibridación y ajuste la temperatura a 40 °C.
  2. Coloque un paño o una toalla de papel absorbente resistente en una bandeja y humedece completamente con agua destilada doble para permitir el control de la humedad.
  3. Inserte la bandeja tapada en el horno y cierre la puerta del horno. Caliente la bandeja durante al menos 30 minutos a 40 °C antes de usarla. Mantenga la bandeja en el horno cuando no esté en uso.

3. Recuperación de epítopos inducida por calor

  1. Prepare un tampón de recuperación de objetivos de hibridación ISH a base de citrato 0,5x (10 nmol/L, pH = 6, consulte la tabla de materiales). Lleve a ebullición en un vaso de precipitados en la placa calefactora.
  2. Realice la recuperación de epítopos inducida por calor colocando los portaobjetos en el tampón de recuperación de objetivos en ebullición durante 30 minutos.
  3. Retire los portaobjetos del tampón de recuperación de destino y lávelos inmediatamente con agua bidestilada. Deshidratar en etanol al 100% durante 5 minutos antes del secado al aire.
  4. Una vez que los portaobjetos se hayan secado al aire, aplique un bolígrafo de barrera hidrofóbica para rodear la sección de tejido en el portaobjetos. Asegúrese de permitir que la barrera hidrofóbica se seque completamente al aire.

4. Pretratamiento de proteasas

  1. Coloque los portaobjetos secos en una rejilla de portaobjetos de bloqueo, luego prepare los reactivos de pretratamiento de proteasa (solución de digestión de proteasa, 2,5 μg/mL) diluyéndolos con PBS estéril y frío en una proporción de 1:5. Mezclar bien.
    NOTA: En el kit disponible comercialmente se proporcionan tres reactivos de proteasa diferentes con diferentes concentraciones. Proteasa III (estándar), Proteasa IV (fuerte) y Proteasa Plus (suave). Probar empíricamente el tiempo de digestión y la dilución de la proteasa antes de la implementación en un estudio, ya que las condiciones óptimas variarán según el tipo de tejido, la fijación y el grosor (ver Discusión).
  2. Dispensar la solución de proteasa diluida en portaobjetos para cubrir completamente las secciones de tejido. Incubar inmediatamente los portaobjetos durante 20 min a 40 °C en un horno (preparado en el paso 1.4), asegurándose de que los portaobjetos estén sellados en la bandeja de hibridación húmeda. No permita que las secciones de tejido se sequen durante el resto del protocolo.
  3. Enjuague inmediatamente 3 veces sumergiendo la rejilla deslizante de bloqueo en una bandeja de lavado llena de agua destilada doble.
  4. Realice el bloqueo de peroxidasa endógena dejando caer la solución de peroxidasa sobre cada sección de tejido para cubrirla completamente. Incuba los portaobjetos durante 10 minutos en RT. Una vez hecho esto, enjuague las secciones 3 veces en agua destilada doble.

5. Hibridación de sondas y amplificación de señales

NOTA: Para evitar la evaporación, asegúrese de que la bandeja con humedad controlada selle correctamente para que los tejidos no se sequen durante los pasos de incubación. Vuelva a colocar la cámara de humedad en el horno durante la etapa de lavado para asegurarse de que permanezca a 40 °C.

  1. Mezcle la sonda C2 y la sonda C1 en una proporción de 1:50 pipeteando 1 volumen de sonda C2 por 50 volúmenes de sonda C1 en un tubo, según lo sugerido por el fabricante. Invierta el tubo varias veces. Precaliente la mezcla de la sonda objetivo en un horno a 40 °C durante ~10 min para disolver cualquier precipitación antes de su uso.
    NOTA: Las sondas de objetivo mixto pueden almacenarse a 4 °C durante un máximo de 6 meses.
  2. Retira los toboganes del agua. Enjuague y golpee o agite los portaobjetos para eliminar el exceso de agua de las secciones de tejido. Dispense inmediatamente la sonda en los portaobjetos, asegurándose de que cada sección de tejido esté completamente cubierta sin burbujas de aire. Incubar la mezcla de sonda en la cámara de humedad durante la noche a 40 °C.
  3. Al día siguiente, retire los portaobjetos del horno y colóquelos en la bandeja de lavado que contiene 0,5x tampón de lavado durante 5 min en RT. Repita el paso de lavado una vez más.
  4. Retire los portaobjetos del tampón de lavado. Enjuague y golpee o deslice los portaobjetos para eliminar el exceso de tampón de lavado de las secciones de tejido.
  5. Dispensar comercialmente el reactivo AMP 1 listo para usar (2 nmol/L) en tampón de hibridación B (20% formamida, 5x SSC, 0,3% sulfato de litiododecilo, 10% de sulfato de dextrano, reactivos bloqueantes) en los portaobjetos, asegurando una cobertura completa de la sección de tejido sin burbujas de aire. Incubar durante 30 min a 40 °C en la cámara de humedad. Repita los pasos 1.6.3-1.6.4, realizando el lavado durante 2 minutos cada uno.
  6. Dispense AMP 2 disponible en el mercado. Asegúrese de que la sección de tejido esté completamente cubierta sin burbujas de aire. Incubar los portaobjetos en la cámara de humedad durante 15 minutos a 40 °C. Repita los pasos 5.3-5.4, realizando el lavado durante 2 minutos cada uno.
  7. Dispense AMP 3 disponible en el mercado. Asegúrese de que la sección de tejido esté completamente cubierta sin burbujas de aire. Incubar los portaobjetos en la cámara de humedad durante 30 min a 40 °C. Repita los pasos 5.3-5.4, realizando el lavado durante 2 minutos cada uno.
  8. Dispense AMP 4 disponible en el mercado. Asegúrese de que la sección de tejido esté completamente cubierta sin burbujas de aire. Incubar los portaobjetos en la cámara de humedad durante 15 minutos a 40 °C. Repita los pasos 5.3-5.4, realizando el lavado durante 2 minutos cada uno.
  9. Dispense AMP 5 disponible en el mercado. Asegúrese de que la sección de tejido esté completamente cubierta sin burbujas de aire. Incubar los portaobjetos en la cámara de humedad durante 30 min a 40 °C. Repita los pasos 5.3-5.4, realizando el lavado durante 2 minutos cada uno.
  10. Dispense AMP 6 disponible en el mercado. Asegúrese de que la sección de tejido esté completamente cubierta sin burbujas de aire. Incubar los portaobjetos en la cámara de humedad durante 15 minutos a 40 °C. Repita los pasos 5.3-5.4, realizando el lavado durante 2 minutos cada uno.
  11. Antes de la detección, enjuague los portaobjetos una vez en 1x TBS-Tween 20 (0,05% v/v). Retire los portaobjetos del tampón de lavado, enjuague y golpee o deslice los portaobjetos para eliminar el exceso de tampón de lavado de las secciones de pañuelo. Colóquelo inmediatamente en la bandeja de lavado llena con 1x tampón TBS-Tween.

6. Detección de señal de objetivo de canal 1 (C1)

NOTA: Esto se realiza utilizando la fosfatasa alcalina roja y la amplificación rápida de cromógeno rojo 6 de los kits de detección de 2-plex (consulte la tabla de materiales) que contienen marcadores de fosfatasa alcalina y detección cromogénica. Utiliza rojo rápido como sustrato para generar una señal roja.

  1. Prepare la solución de trabajo de rojo rápido (FR) utilizando una dilución 1:60 de Fast RED-B a Fast RED-A. Mezclar bien. Para reducir el precipitado y obtener una señal más limpia, filtre la solución de cromógeno a través de una membrana MCE de 0,45 μm con una jeringa.
    NOTA: Utilice la solución Fast RED-B dentro de los 5 minutos. No lo exponga a la luz solar directa ni a la luz ultravioleta.
  2. Retire los portaobjetos de la TBS-Tween, enjuague y golpee o deslice los portaobjetos para eliminar el exceso de tampón de las secciones de tejido.
  3. Dispense una solución FR mezclada y filtrada en cada sección de tejido, asegurándose de que cada sección esté completamente cubierta. Incubar en RT durante 6-8 min. Observar bajo el microscopio.
  4. Enjuague los portaobjetos en un tampón de lavado de 0,5x 2 veces. Retire los portaobjetos del tampón de lavado, enjuague y golpee o deslice los portaobjetos para eliminar el exceso de tampón de lavado de las secciones de pañuelo.
  5. Dispense AMP 7 disponible en el mercado. Asegúrese de que la sección de tejido esté completamente cubierta sin burbujas de aire. Incubar los portaobjetos en la cámara de humedad durante 10 min a 40 °C. Repita los pasos 5.3-5.4, realizando el lavado durante 2 minutos cada uno.
  6. Dispense AMP 8 disponible en el mercado. Asegúrese de que la sección de tejido esté completamente cubierta sin burbujas de aire. Incubar los portaobjetos en la cámara de humedad durante 15 minutos a 40 °C. Repita los pasos 5.3-5.4, realizando el lavado durante 2 minutos cada uno.
  7. Dispense AMP 9 disponible en el mercado. Asegúrese de que la sección de tejido esté completamente cubierta sin burbujas de aire. Incubar los portaobjetos en la cámara de humedad durante 30 min a 40 °C. Repita los pasos 5.3-5.4, realizando el lavado durante 2 minutos cada uno.
  8. Dispense AMP 10 disponible en el mercado. Asegúrese de que la sección de tejido esté completamente cubierta sin burbujas de aire. Incubar los portaobjetos en la cámara de humedad durante 30 min a 40 °C. Repita los pasos 5.3-5.4, realizando el lavado durante 2 minutos cada uno.

7. Detección de señal de objetivo de canal 2 (C2)

NOTA: Esto se realiza utilizando kits de cromógeno marrón HRP y DAB disponibles en el mercado (consulte la tabla de materiales). La amplificación 10 de la detección 2-plex contiene etiquetas de peroxidasa de rábano picante, y la detección cromogénica se realiza mediante DAB para generar una señal marrón.

  1. Para una detección óptima de la señal DAB, utilice los kits disponibles en el mercado y siga las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales). Observa bajo un microscopio.
    PRECAUCIÓN: El DAB es tóxico. Siga las precauciones y pautas de seguridad adecuadas al manipular y desechar este producto químico.

8. Contratinción y montaje

  1. Contratiñe los portaobjetos con hematoxilina.
    1. Contratiñir los portaobjetos durante 30 s con hematoxilina filtrada al 50% mientras se agitan los portaobjetos. Las diapositivas aparecerán en color morado. Enjuague inmediatamente con agua corriente mientras agita los portaobjetos hacia arriba y hacia abajo hasta que el agua esté clara. Las secciones de tejido permanecerán moradas.
    2. Para obtener un mejor contraste, coloque los portaobjetos contrateñidos en agua destilada saturada con carbonato de litio durante 1 min. Enjuague con abundante agua corriente al menos 3 veces mientras agita los portaobjetos. Use agua destilada doble para el enjuague final.
    3. Debido a que FR es sensible a los solventes orgánicos, los portaobjetos teñidos con FR deberán cubrirse con medio de montaje a base de agua y secarse durante la noche en RT.
  2. Monta las correderas.
    1. Asegúrese de que las secciones de tejido cubiertas con medio de montaje a base de agua estén secas.
    2. Sumerja los portaobjetos en xileno antes de que la cubierta se deslicen con el reactivo de montaje. Asegúrese de evitar o eliminar cualquier burbuja de aire entre el cubreobjetos y la sección de pañuelos y deje secar durante 16 horas en RT.

9. Protocolo de análisis de imágenes cuantitativas para RNAscope utilizando CellProfiler5

  1. Brevemente, asegúrese de que el software separará las tinciones de hematoxilina y FR en imágenes separadas. Identifique y mida los objetos de interés: núcleos, viriones, células positivas y tinción agregada FR positiva. Almacene las mediciones en un archivo CSV y guarde la imagen analizada.
  2. Seleccione la opción "Desmezclar colores", que separa las manchas, dividiendo la región de interés original (ROI) en imágenes separadas de hematoxilina y FR.
  3. Si la hemosiderina, el tatuaje o características similares interfieren con el análisis, agregue un segundo paso de "Desmezclar" con hematoxilina, FR y DAB. Utilice la segunda imagen FR para encontrar los píxeles FR más intensos. Esta segunda imagen se utilizará como mascarilla para la tinción FR verdadera.
  4. Opcionalmente, alise las imágenes manchadas antes de ponerlas en el umbral. Esta es una decisión empírica y no siempre necesaria. Umbral de las imágenes individuales teñidas usando "IdentifyPrimaryObjects" para seleccionar píxeles positivos.
  5. Identificar los tres tipos diferentes de objetos (virión, agregados de viriones, célula productiva).
    1. Asegúrese de que los núcleos sean objetos de 4 a 100 píxeles (px) de diámetro teñidos con hematoxilina. Deglomerar y rellenar los agujeros después de la creación de umbrales. Los objetos "IntenseFastRed" tienen un diámetro de 4 a 100 px e incluyen viriones, células positivas y tinción positiva agregada, como la que se observa en las células dendríticas foliculares (FDC) en los folículos de células B (BCF). Esta imagen se utiliza para filtrar falsos positivos (p. ej., hemosiderina).
    2. Asegúrate de que los positivos pequeños FR sean objetos de 2-12 px de diámetro. Esta medición incluye viriones y células vDNA+. Deseche cualquier objeto fuera de este rango. Deglomerar y rellenar los agujeros después de la creación de umbrales.
    3. Asegúrate de que FR positivos grandes: objetos de 9-100 px de diámetro. Esta medición incluye células vRNA+ positivas y tinción agregada positiva. Deglución después del umbral. El tamaño de los objetos FR positivos pequeños y grandes puede superponerse. Se separarán en un paso posterior.
      NOTA: El software (por ejemplo, Cellprofiler) utiliza píxeles para el tamaño de los objetos, y los que se utilizan aquí se derivan de diapositivas escaneadas a 0,2510 μm/píxel (40x).
  6. Definir y extraer resultados.
    1. Una vez identificados los objetos, defina y extraiga los resultados del número de viriones, las células infectadas productivas y los núcleos.
    2. Identifique los viriones enmascarando FastRedSmallPositives con el objeto IntenseFastRed establecido para eliminar falsos positivos (por ejemplo, hemosiderina).
    3. A continuación, identifique las células positivas y agregue la tinción positiva para FR. Elimine los falsos positivos y los viriones de FastRedLargePositives enmascarándolos con IntenseFastRed y con el conjunto de objetos de virión.
    4. Extraiga las células positivas de los FastRedLargePositives refinados enmascarando de nuevo con Nuclei. Divide los objetos que ya no se tocan y filtra los resultados por área de objeto, eliminando los objetos pequeños (≤6 px). Esto elimina las manchas creadas por el enmascaramiento de la superposición de núcleos. El resultado son las celdas positivas.
    5. Por último, defina los positivos FR agregados. En este paso se usa IdentifyTertiaryObjects, que busca objetos contenidos en un objeto primario más grande. En este caso, el conjunto de objetos FastRedLargePositives refinado es el primario y se restan las celdas positivas.
  7. Cuente el número de viriones y células positivas.
  8. Mida el área positiva agregada y conviértala de píxeles amm 2. Opcionalmente, registre el área ocupada por viriones y celdas positivas en mm2 si el análisis requiere el uso de celdas estándar y tamaños de viriones en lugar de recuentos directos.
  9. Superponga los objetos positivos en la imagen original y guarde el resultado.
    NOTA: Los datos de ISH se informan por el número de viriones por 106 núcleos (células) y el número de células vRNA+ infectadas productivamente por 106 núcleos (células) para una mejor comprensión y para facilitar la comparación con los datos de qPCR, pero los resultados también podrían informarse por área de tejido en mm2.

Resultados

En un manuscrito anterior 2,6,7,8,9,10,11, informamos que las plataformas ISH de próxima generación que detectan vRNA o vDNA se pueden combinar, utilizando sondas de detección (vDNA) dirigidas a la porción 5' gag-pol del genoma SIV/VIH y sondas antisentido (vRNA) dirigidas a genes en la mitad 3' del genoma (vif, vpx, vpr, tat, env y nef), así como el elemento TAR en el genoma 5' (Tabla 1). Este enfoque distingue las células transcripcionalmente activas (vRNA+, vDNA+) de las células infectadas transcripcionalmente inactivas (supuestamente latentes) o las células que albergan provirus transcripcionalmente incompetentes (vRNA-, vDNA+) en la misma sección tisular2 (Figura 1).

figure-results-1
Figura 1: Detección de ARN viral y ADNv en la misma sección de tejido. Combinación de ensayo de hibridación de ARN (rojo) e hibridación de ADN (marrón) en un ganglio linfático RM infectado agudamente por SIV, lo que demuestra la capacidad de detectar vRNA y vDNA en la misma sección de tejido y proporciona un enfoque potente para identificar células vDNA+ vRNA- transcripcionalmente silenciosas in situ. Esta figura ha sido modificada de Deleage C. et al.2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Conjuntos de sondas de ARN/ADN de plex único
NombreCatálogo ACD #Número de ZZDescripción
SIVmac239 (Anti-Sentido)31281183Selección de sonda antisentido dentro de 1251-9420 pb de D01065.1 (gag, pol, vif, vpx, vpr, tat, env y nef)
SIVmac239 (Sentido)31407183Sonda de detección dirigida a la hebra inversa dentro de 1251-9420 pb de D01065.1 (gag, pol, vif, vpx, vpr, tat, env y nef)
V-VIH1-Clado A (Anti-Sentido)41610180Selección de sonda antisentido dentro de 879-7629 pb del consenso del clado A del VIH-1 (gag, pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, env y nef)
V-VIH1-Clado A (Sentido)42634180Sonda de detección dirigida a la cadena inversa dentro de 879-7629 pb del consenso del clado A del VIH-1 (gag, pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, env y nef)
V-VIH1-Clado B (Anti-Sentido)41611178Selección de sonda antisentido dentro de 854-8291 pb de AF324493.2, VIH-1 Clado B NL4-3 (gag, pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, env y nef)
V-VIH1-Clado B (Sentido)42553178Sonda de detección dirigida a la cadena inversa dentro de 854-8291 pb de AF324493.2, VIH-1 Clado B NL4-3 (gag, pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, env y nef)
V-VIH1-Clado D (Anti-Sentido)41612176Selección de sonda antisentido dentro de 894-7697 pb del consenso del clado D del VIH-1 (gag, pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, env, nef)
V-HIV1-Clado D (Sentido)42635176Sonda de detección dirigida a la cadena inversa dentro de 894-7697 pb del consenso del clado D del VIH-1 (gag, pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, env, nef)
Conjuntos de sondas de ARN/ADN multiplex
NombreCatálogo ACD #Número de ZZDescripción
V-SIVmac239-gag-pol-Sense-C1416141-C140Sonda de detección dirigida a la hebra inversa dentro de 1251-4093bp de D01065.1 (mordaza y pol)
V-SIVmac239-vif-env-nef-tar-C2 (Anti-sentido)416131-C247Orientación de la sonda antisentido dentro de 5381-10257 bp de D01065.1 (vif, vpx, vpr, tat, env, nef y el elemento TAR)
V-VIH1-Clade_B-gag-pol-sense-C1444051-C140Sonda de detección dirigida a la hebra inversa dentro de 854-3940 pb de AF324493.2, VIH-1 Clado B NL4-3 (mordaza y pol)
V-HIV1-Clade_B-vif-vpr-tat-rev-vpu-env-nef-tar-C2 (Antisentido)444061-C240Sonda antisentido dirigida dentro de 5042-9673bp de AF324493.2, VIH-1 Clado B NL4-3 (vif, vpr, tat, env, nef y el elemento TAR)
V-VIH1-Clade_C-gag-pol-sense-C1444021-C148Sonda de detección dirigida a la hebra inversa dentro de 888-5032 pb de la secuencia de consenso del clado C del VIH-1 (mordaza y pol)
V-HIV1-Clade_C-vif-vpr- rev-vpu-env-nef-tar-C2 (Antisentido)444041-C249Selección de sonda antisentido dentro de 5078-9698 pb de la secuencia de consenso del clado C del VIH-1 (vif, vpr, tat, env, nef y el elemento TAR)
V-VIH1-Clade_AE-gag-pol-sense-C1444011-C155Sonda de detección dirigida a la cadena inversa dentro de 890-4812 pb de AF259954.1, clado VIH-1 AE (mordaza y pol)
V-HIV1-Clade_AE-vif-vpr-tat-rev-vpu-env-nef-tar-C2 (Antisentido)444031-C257Selección de sonda antisentido dirigida dentro de 5052-9694 pb de AF259954.1, clado VIH-1 AE (vif, vpr, tat, env, nef y el elemento TAR)

Tabla 1: Lista de sondas para dirigirse al vRNA y vDNA del VIH-1 y VIS.

Discusión

La hibridación in situ es un ensayo meticuloso que requiere rigor y conocimientos básicos de química de ácidos nucleicos, biología celular e histología para poder adaptar cada paso crítico para localizar un objetivo en un entorno bien conservado. En esta discusión, nos gustaría resaltar los pasos críticos en los que la resolución de problemas es crucial para obtener resultados precisos e interpretables.

La fijación y el procesamiento de los tejidos son fundamentales y deben abordarse desde el principio para asegurarse de que el ensayo pueda producir los mejores resultados. El fijador de PFA tamponado neutro (4% recién preparado) es óptimo para el ensayo dúplex. Sin embargo, el ensayo también se puede realizar en tejidos congelados (OCT) con las condiciones adecuadas de fijación posterior a la criosección.

El pretratamiento de las secciones de tejido es un paso crucial. Hay dos pasos de pretratamiento en este ensayo: el primero es una recuperación de epítopos inducida por calor (HIER). Este paso es importante para la reversión de los enlaces cruzados del puente de metileno y la restauración de las estructuras de las proteínas, que es necesaria en los tejidos fijos. La eficacia de este tratamiento depende del tiempo, la temperatura, el tipo de tampón de recuperación y el pH. El segundo pretratamiento es una recuperación de epítopos inducida por proteasa (PIER). Este paso escinde los péptidos, exponiendo el antígeno o los nucleótidos, y utiliza enzimas como la proteinasa K, la tripsina y la pepsina. Se trata de un paso extremadamente sensible que podría dañar tanto la morfología del tejido como el objetivo de interés. La concentración de la enzima, así como el tiempo y la temperatura de incubación son críticos en este proceso. La sobredigestión conduce a una mala demarcación de los núcleos y a la dificultad en los pasos de cuantificación. Es fundamental encontrar un equilibrio entre el acceso óptimo a la diana de ARN/ADN y las condiciones previas al tratamiento que no dañen el tejido o la diana de interés. Cada tipo de tejido tiene un nivel diferente de sensibilidad a cada uno de estos pretratamientos y cada parámetro (concentración de enzimas, tiempo, temperatura) debe ser probado empíricamente.

La rigurosidad del tampón de lavado se basa en tres parámetros principales: temperatura, concentración de sales y detergente, y tiempo. El tampón de lavado es un tampón de citrato de sodio salino (SSC), y la concentración de sal dentro del tampón controla la rigurosidad durante los pasos de lavado. En su protocolo, ACD aconseja utilizar el tampón de lavado a una concentración final de 0,1x SSC, 0,03% de dodecil sulfato de litio. Mientras trabajábamos en el ADNscope y la optimización de multiplex, determinamos que el uso del tampón de lavado a una concentración final de 0,05x SSC nos dio mejores resultados para visualizar la señal de ADN y ayudó considerablemente a reducir la hibridación inespecífica fuera del objetivo resultante de la incubación nocturna de la sonda de detección.

La elección del enfoque de detección, el cromógeno (rojo o marrón) frente a la fluorescencia, debe pensarse en función del tipo de tejido y el objetivo antes de comenzar el ensayo. El enfoque cromogénico rojo dará un buen contraste, porque el rojo no se encuentra naturalmente en los tejidos. El cromógeno marrón dará resultados similares al cromógeno rojo. Sin embargo, es importante tener en cuenta que algunos productos de degradación de la sangre presentes en el tejido tienen un color similar, y la tinta del tatuaje será difícil de separar de la señal marrón durante la cuantificación. Un enfoque de detección de fluorescencia permitirá una clara distinción de diferentes marcadores celulares y la multiplexación ofrecerá un ensayo perfecto para el fenotipo de las células que albergan vRNA y/o vDNA.

Son necesarios múltiples controles para garantizar la especificidad de las sondas y la calidad del ensayo. Cada sonda de nuevo diseño debe probarse en tejidos de control positivos y negativos conocidos o en gránulos de células. A menudo generamos plásmidos que contienen nuestra secuencia objetivo y realizamos la transfección en líneas celulares para generar controles positivos. Para cada corrida añadimos un tejido negativo conocido (VIH o SIV negativo), un control sin sonda que contenga solo el diluyente de la sonda y un control tratado con RNasa para garantizar la calidad y especificidad del ensayo.

La cuantificación es un paso extremadamente importante y debe realizarse utilizando las herramientas y el algoritmo adecuados en función de la pregunta formulada. En este manuscrito presentamos un software de análisis de imágenes (por ejemplo, Cellprofiler), que elegimos después de evaluar múltiples opciones. Estimamos que este software era el mejor para nuestras necesidades, pero existen numerosos programas de software de análisis de imágenes que podrían utilizarse.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este proyecto ha sido financiado en su totalidad con fondos federales del Instituto Nacional del Cáncer, Institutos Nacionales de Salud, bajo el Contrato No. HHSN261200800001E y por el Centro Nacional de Investigación de Primates de Oregón (NIH, por sus siglas en inglés) P51OD011092 (J.D.E). El contenido de esta publicación no refleja necesariamente los puntos de vista o las políticas del Departamento de Salud y Servicios Humanos, ni la mención de nombres comerciales, productos comerciales u organizaciones implica el respaldo del Gobierno de los EE. UU. El dúplex se desarrolló con la ayuda de Advanced Cell Diagnostics.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Sistema de hibridación ACD HybEZII (110 V) con sistema ACD EZ-Batch SlidesACD321710Horno de hibridación
CAT HematoxylinBiocare médicoCATHE-GALcolorstain
Clear-MountELECTRON MICROSCOPY SCIENCES17985-15reactivo de montaje para cromógeno rojo
Immpact DAB PeroxidasaKit VectorSK-4105Se utiliza para revelar HRP - DAB (marrón) para reemplazar el DAB que viene en el kit ACD
carbonato de litioFisher chemicalL119-500solución azulada
paraformaldehídoELECTRÓNICA MICROSCOPY SCIENCES15714-Spara la fijación de tejidos (4%)
PBSlife technology14190-136
Permount Medio de montajeThermoFisher ScientificSP15-100regaent de montaje para cromógeno marrón
Prolong GoldThermoFisher ScientificP36930regaent de montaje para
ribonucleasas12091039ThermoFisher Scientificpara el tratamiento de ARNasa en el protocolo de ADNascopio
ribonucleasas T1RocheR1003para el tratamiento de ARNasa en el protocolo DNAscope
RNAscope 2.5, reactivo de detección 2-plexACD322430Kit marrón y rojo de detección de cromógeno
RNAscope Target RetrievalReactivos ACD322000tampón de recuperación
SuperFrost Plus Portaobjetos de vidrio ThermoFisherScientific12-550-17
TBSBOSTON BIOPRODUCTSBM-301-4Lpara lavados
TSA Plus Kit de paleta de fluorescencia (Cy3, Cy5, TMR, Fluoresceína)Perkin elmerNEL760001KTHRP Detección de fluorescencia
Tween 20SIGMAP1379-1Lpara lavados
XYLENE 20LTThermoFisher ScientificAC422680200
de fluorescencia Un

Referencias

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