Patrón de la geometría de las colonias de células madre embrionarias humanas en sustratos compatibles para controlar la mecánica de nivel de tejido

Resumen

Los ligandos de matriz extracelular se pueden patrones en hidrogeles de poliacrilamida para permitir el cultivo de células madre embrionarias humanas en colonias confinadas en sustratos compatibles. Este método se puede combinar con microscopía de fuerza de tracción y ensayos bioquímicos para examinar la interacción entre la geometría del tejido, las fuerzas generadas por células y la especificación del destino.

Resumen

Las células madre embrionarias humanas demuestran una capacidad única para responder a los morfogens in vitro mediante patrones autoorganizadores de especificación del destino celular que corresponden a la formación primaria de la capa germinal durante la embriogénesis. Por lo tanto, estas células representan una poderosa herramienta con la que examinar los mecanismos que impulsan el desarrollo humano temprano. Hemos desarrollado un método para cultivar células madre embrionarias humanas en colonias confinadas en sustratos compatibles que proporciona control sobre la geometría de las colonias y su entorno mecánico con el fin de recapitular los parámetros físicos que embriogénesis de la subestimación. La característica clave de este método es la capacidad de generar hidrogeles de poliacrilamida con patrones definidos de ligando de matriz extracelular en la superficie para promover la unión celular. Esto se logra fabricando plantillas con los patrones geométricos deseados, utilizando estas plantillas para crear patrones de ligando de matriz extracelular en los labios de las cubiertas de vidrio, y transfiriendo estos patrones a hidrogeles de poliacrilamida durante la polimerización. Este método también es compatible con la microscopía de fuerza de tracción, lo que permite al usuario medir y mapear la distribución de las fuerzas generadas por células dentro de las colonias confinadas. En combinación con los ensayos bioquímicos estándar, estas mediciones se pueden utilizar para examinar el papel que desempeñan las señales mecánicas en la especificación del destino y la morfogénesis durante el desarrollo humano temprano.

Introducción

Las células madre embrionarias humanas (HESC) son muy prometedoras para su uso en aplicaciones de medicina regenerativa e ingeniería de tejidos. La naturaleza pluripotente de estas células les da la capacidad de diferenciarse en cualquier tipo de célula adulta. Si bien se han hecho grandes avances en la dirección del destino de los hESC a determinados tipos de células, se ha mantenido muy difícil generar tejidos enteros u órganos de novo^{1,2,3,4, 5}. Esto se debe, en gran parte, a una comprensión limitada de los mecanismos que impulsan la formación de estos tejidos durante el desarrollo humano. Con el fin de colmar este vacío de conocimiento, en los últimos años han surgido una serie de métodos para modelar el embrión temprano y las etapas posteriores de desarrollo con células madre embrionarias^{6,7,8,9 ,10,11,12,13}.

Poco después de la derivación de las primeras líneas¹⁴del hESC, se demostró que los cuerpos embrionarios formados a partir de hESC eran capaces de producir espontáneamente células de las tres capas germinales primarias^6. Sin embargo, debido a la falta inherente de control sobre el tamaño y la morfología de los cuerpos embrionarios, la organización de las capas germinales varió significativamente y no pudo igualar la organización del embrión temprano. Más recientemente, Warmflash y otros desarrollaron un método para confinar colonias de hESC en sustratos de vidrio a través de micropatrones, proporcionando control y consistencia sobre el tamaño y la geometría de las colonias^8. En presencia de BMP4, un importante morógeno en desarrollo temprano, estas colonias confinadas eran capaces de autoorganizar patrones reproducibles de especificación a los destinos que representaban las capas de gérmenes primarios. Aunque esto proporcionó un modelo útil para estudiar los mecanismos por los cuales se establecen las capas primarias de gérmenes, los patrones de especificación del destino no coincidieron exactamente con la organización y la morfogénesis observada durante la embriogénesis^15. Se logró una recapitulación más fiel del desarrollo embrionario temprano mediante la incorporación de hESC en una matriz extracelular tridimensional (ECM) de matrigel^11,proporcionando la evidencia más sólida hasta la fecha de la capacidad de los hESC para autoorganizarse y modelar las primeras etapas de la embriogénesis ex vivo. Sin embargo, este método produce resultados inconsistentes y, por lo tanto, es incompatible con una serie de ensayos que podrían utilizarse para revelar los mecanismos subyacentes de la autoorganización y la especificación del destino.

Dados estos métodos existentes y sus respectivas limitaciones, buscamos desarrollar un método para cultivar reproduciblemente colonias hESC de geometrías definidas en condiciones que modelen el entorno extracelular del embrión temprano. Para lograrlo, utilizamos hidrogeles de poliacrilamida de elasticidad ajustable para controlar las propiedades mecánicas del sustrato. Usando la microscopía de fuerza atómica en embriones de pollo en etapa de gastralación, encontramos que la elasticidad del epiblasto oscilaba entre cientos de pascales y unos pocos kilopascales. Así, nos centramos en la generación de hidrogeles de poliacrilamida con elasticidad en esta gama para servir como sustrato para las colonias de hESC. Modificamos nuestros métodos anteriores para el cultivo de hESC en hidrogeles de poliacrilamida^7,9 para proporcionar un control robusto sobre la geometría de las colonias. Lo logramos modelando primero los ligandos ECM, a saber, matrigel, en los cubredes de vidrio a través de plantillas microfabricadas, como se informó anteriormente¹⁶. A continuación diseñamos una técnica novedosa para transferir el ligando estampado a la superficie de los hidrogeles de poliacrilamida durante la polimerización. El método que describimos aquí implica el uso de fotolitografía para fabricar una oblea de silicio con los patrones geométricos deseados, la creación de sellos de estas características geométricas con polidimetilsiloxano (PDMS), y el uso de estos sellos para generar las plantillas que en última instancia, permitir el patrón de ligando sobre la superficie de los revestimientos de vidrio y transferir a poliacrilamida.

Además de recapitular el entorno mecánico del embrión temprano, el confinamiento de colonias hESC en poliacrilamida permite la medición de fuerzas generadas por células con microscopía de fuerza de tracción (TFM), como se informó en nuestro método anterior^9. En resumen, las cuentas fluorescentes se pueden incrustar en la poliacrilamida y utilizarse como marcadores fiduciarios. Las fuerzas generadas por células se calculan por imágenes del desplazamiento de estas cuentas después de sembrar los heSC en el sustrato estampado. Además, los mapas de fuerza de tracción resultantes pueden combinarse con ensayos tradicionales, como la inmunomancha, para examinar cómo la distribución de las fuerzas generadas por células en colonias de hESC confinadas puede regular o modular la señalización aguas abajo. Esperamos que estos métodos revelen que las fuerzas mecánicas desempeñan un papel crítico en el patrón de la especificación del destino celular durante el desarrollo embrionario temprano que actualmente se pasa por alto.

Protocolo

Todos los métodos descritos aquí relacionados con el uso de hESCs han sido aprobados por el Comité de Investigación de Gametos Humanos, Embriones y Células Madre (GESCR) de la Universidad de California en San Francisco.

1. Preparación de oblea de silicio con características geométricas

1. Cree una fotomáscara con las entidades geométricas deseadas. Utilice el software de dibujo asistido por ordenador para diseñar las características. Para su uso con fotorresistente negativo, haga que las entidades sean opacas y el resto de la máscara transparente.
   NOTA: Para el patrón en los cubreobjetos de 18 mm de diámetro, agrupe las características de cada condición experimental en áreas de 10 x 10 mm para asegurar que las plantillas generadas en el paso 3 encajen en los labios de las cubiertas.
2. Fotorresistente negativo de la capa de giro sobre una oblea de silicio de 100 mm. Utilice la hoja de datos fotorresistente para determinar la velocidad y la longitud del giro para generar un espesor de película de 100-250 m.
   NOTA: El grosor de la película debe ajustarse de modo que la relación de aspecto de la anchura de los patrones con la altura de la plantilla sea lo más cercana posible a 1:1. Sin embargo, recomendamos un espesor mínimo de 100 m, ya que cualquier cosa menos produce plantillas delicadas que se desgarran fácilmente.
3. Procesar el fotorresistente de acuerdo con la hoja de datos del producto. Esto generalmente implica un horneado suave, exposición UV con fotomáscara en un alineador de máscara, post exposición al horno, desarrollo, y hard bake. Como ejemplo, el procedimiento utilizado para procesar las obleas utilizadas en este protocolo se describe en el Cuadro 1.
   NOTA: Tenga cuidado al manipular obleas de silicio, ya que son frágiles. Una vez generadas, las obleas se pueden utilizar repetidamente siempre y cuando no estén dañadas.

2. Preparación de los cubreobjetos

1. Preparación de cubres "top" lavados con ácido
   1. Coloque los tapas de 18 mm de diámetro #1 espesor en una placa de vidrio Petri. El número adecuado de tapas depende del tamaño del plato. Para un plato de 100 mm, prepare 50-100 tapas a la vez. Las cantidades de volumen dadas a través del resto de esta sección corresponden a un plato de 100 mm.
   2. Añadir 20 ml de 1 M HCl a la placa Petri y agitar suavemente el plato para dispersar los labios de las cubiertas. Asegúrese de que todos los labios de las cubiertas estén sumergidos y libere burbujas de aire entre los labios de las cubiertas. Incubar durante la noche a temperatura ambiente con un suave temblor.
      ADVERTENCIA: HCl es ácido y corrosivo. Tenga cuidado y use un Epi apropiado mientras trabaja con HCl.
   3. Decant HCl del plato. Añadir 20 ml de agua ultrapura y lavar con agitación suave durante 10 min. Deseche el agua y repita un total de cinco lavados.
   4. Después de desechar el lavado final, añadir 20 ml de etanol 100% al plato. Con fórceps, retire los labios de las cubiertas individualmente y coloque entre dos trozos de papel de filtro para secar.
   5. Almacene los cubreobjetos secos en un recipiente sellado. Los labios de las cubiertas lavadas con ácido se pueden preparar con antelación y almacenarse durante un mes o más en condiciones libres de polvo.
2. Preparación de los cubreobjetos "inferiores" activados por glutaraldehyde
   NOTA: Consulte los métodos anteriores para obtener más detalles^7,9.
   1. Coloque los tapas de 18 mm de diámetro #1 espesor en una placa Petri.
   2. Añadir 20 ml de 0,2 M HCl a la placa de petri y agitar suavemente el plato para dispersar los labios de las cubiertas. Asegúrese de que todos los labios de las cubiertas estén sumergidos y libere burbujas de aire entre los labios de las cubiertas. Incubar durante la noche a temperatura ambiente con un suave temblor.
   3. Decant HCl del plato. Añadir 20 ml de agua ultrapura y lavar con agitación suave durante 10 min. Deseche el agua y repita un total de cinco lavados.
   4. Después de desechar el lavado final, añadir 20 ml de 0,1 M NaOH y agitar suavemente para dispersar y sumergir los labios de las cubiertas. Incubar a temperatura ambiente con agitación suave durante 1 h.
   5. Decant NaOH del plato. Añadir 20 ml de agua ultrapura y lavar con agitación suave durante 10 min. Deseche el agua y repita un total de cinco lavados.
   6. Después de desechar el lavado final, agregue 20 ml de una dilución de 1:200 de 3-aminopropyltrimethoxysilane en agua ultrapura y agitar suavemente para dispersar y sumergir los labios de las cubiertas. Incubar a temperatura ambiente con agitación suave durante 1 h o durante la noche.
      ADVERTENCIA: 3-aminopropyltrimethoxysilane es inflamable y puede causar irritación de la piel. Manipule con cuidado, use EPI apropiado y deseche los desechos de acuerdo con las regulaciones locales de eliminación.
   7. Decantar la solución diluida de 3-aminopropyltrimethoxysilane del plato. Añadir 20 ml de agua ultrapura y lavar con agitación suave durante 10 min. Deseche el agua y repita un total de al menos cinco lavados. Es fundamental eliminar todos los 3-aminopropyltrimethoxysilane antes de proceder.
   8. Después de desechar el lavado final, añadir 20 ml de una dilución 1:140 de 70% glutaraldehído en solución salina tamponada de fosfato (PBS) y agitar suavemente para dispersar y sumergir los labios de las cubiertas. Incubar a temperatura ambiente con agitación suave durante 1 h o durante la noche.
      ADVERTENCIA: 70% glutaraldehído es tóxico y puede causar irritación de la piel. Manipule con cuidado, use EPI apropiado y deseche los desechos de acuerdo con las regulaciones locales de eliminación.
   9. Decantar la solución diluida de glutaraldehído del plato. Añadir 20 ml de agua ultrapura y lavar con agitación suave durante 10 min. Deseche el agua y repita un total de cinco lavados.
   10. Después de desechar el lavado final, añadir 20 ml de etanol 100%. Con fórceps, retire los labios de las cubiertas individualmente y coloque entre dos trozos de papel de filtro para secar.
   11. Almacene los cubreobjetos secos en un recipiente sellado. Los cubreobjetos activados por glutaraldehyde se pueden preparar con antelación y almacenarse durante un máximo de seis meses.

3. Generación de plantillas para el patrón de ligando ECM

1. Generación de sellos intermedios de polidimetilsiloxano (PDMS)
   1. Combine la base de PDMS con el agente de curado PDMS en una proporción de 10:1, en peso. Homogeneizar.
      NOTA: Para la aplicación inicial de PDMS, prepare aproximadamente 100 g de PDMS para llenar un plato de 100 mm. Para aplicaciones posteriores, quite PDMS solo del centro del plato donde se encuentran las entidades de oblea de silicio y prepare 20-30 g de nuevos PDMS.
   2. Desgasifique la mezcla PDMS en un desecador durante 30-60 min o hasta que se eliminen todas las burbujas de aire.
   3. Coloque la oblea de silicio modificada del paso 1 en un plato de plástico de 100 mm. Vierta lenta y uniformemente la mezcla PDMS sobre la superficie de la oblea. Toque el plato en la superficie de trabajo para liberar cualquier burbuja de aire de la superficie de la oblea.
   4. Desgasifique la mezcla PDMS vertida sobre la oblea durante 10 minutos o hasta que todas las burbujas de aire se eliminen o hayan llegado a la superficie del PDMS.
   5. Hornee el PDMS a 70 oC durante 2 h. Deje enfriar a temperatura ambiente.
   6. Con un cortador de bisturí o caja, corte la sección de PDMS desde el centro del plato que contiene las características geométricas.
   7. Corte el PDMS en cuadrados de aproximadamente 10 x 10 mm, cada uno de los cuales contiene las características para una sola condición experimental. Estos se conocen como "sellos" en los pasos posteriores del protocolo.
2. Generación de losas planas de PDMS
   1. Combine la base de PDMS con el agente de curado PDMS en una proporción de 8:1, en peso. Preparar aproximadamente 20 g por cada plato de 100 mm que se va a utilizar. Homogeneizar.
   2. Desgasifique la mezcla PDMS en un desecador durante 30-60 min o hasta que se eliminen todas las burbujas de aire.
   3. Vierta lenta y uniformemente el PDMS en un plato limpio de 100 mm. Toque el plato en la superficie de trabajo para liberar cualquier burbuja de aire.
   4. Hornee el PDMS a 70 oC durante 2 h. Deje enfriar a temperatura ambiente.
   5. Retire el PDMS del plato. Invierta de tal manera que la superficie del PDMS que estaba en contacto con la parte inferior del plato esté hacia arriba.
   6. Para cada sello generado en el paso 3.1, corte un cuadrado de 15 x 15 mm de PDMS. Estos se conocen como "losas planas" en los pasos posteriores del protocolo.
3. Generación de plantillas
   1. Organice losas planas de PDMS en la tapa de un plato de 150 mm u otra superficie plana para facilitar el manejo. Asegurar un espacio suficiente entre losas (por ejemplo, para un plato de 150 mm, organizar nueve losas planas con un espaciado uniforme).
   2. Invierta cada sello generado en el paso 3.1 en una losa plana de PDMS, de forma que las características del sello estén en contacto con la losa plana de PDMS. Presione suavemente en la parte superior del sello con fórceps para asegurar un contacto uniforme.
   3. Sujete cuidadosamente la tapa que sujeta los pares de sello/losa PDMS en la base del plato, de forma que la tapa descanse en un ángulo. Esto ayuda a la absorción del polímero curable UV en el siguiente paso.
   4. Coloque una pequeña gota de polímero curable UV en la interfaz superior de cada par de sello/losa. El polímero será malvado entre los dos por tensión superficial, asistido por la gravedad.
      NOTA: Muchos polímeros diferentes curables por UV pueden funcionar en este protocolo. Seleccionamos Norland Optical Adhesive 74 para las siguientes propiedades: i) Curado rápido al exponerse a la luz UV, ii) Fácil extracción de sellos PDMS al curar, iii) Adhesión robusta a los cubredes de vidrio con presión manual.
   5. Una vez que el polímero ha sido completamente perverso a través, coloque la tapa con pares de sello / losa plana en la superficie de trabajo. Coloque una pequeña gota de polímero curable UV en cada uno de los tres lados restantes de cada interfaz de sello/losa.
   6. Usando una punta de pipeta de 200 l, conecte las gotas de polímero alrededor de los bordes de la interfaz de sello/losa. Esto crea un borde que mantendrá la solución de ligando en el paso 4.
      NOTA: Tenga cuidado al trabajar el polímero alrededor de los bordes del sello. Si se interrumpe la interfaz de sello/losa, el polímero se mete debajo de las características y la plantilla no se formará correctamente.
   7. Coloque cuidadosamente los pares de sello/losa en una caja de esterilización UV. Utilice el ajuste de potencia estéril "Str" y exponga durante 10 minutos.
   8. Retire los pares de sello/losa de la caja de esterilización UV. Con dos pares de fórceps, retire suavemente el sello PDMS mientras mantiene presionada la losa plana y la plantilla que se formó a partir del polímero curable uvable.
   9. Con fórceps, retire cuidadosamente la plantilla e invierta de tal manera que la superficie que estaba en contacto con la losa plana de PDMS esté mirando hacia arriba.
      NOTA: Las plantillas son delicadas. Tenga cuidado al entregarlos, especialmente al retirarlos inicialmente del PDMS, para que no se rompan.
   10. Vuelva a colocar las plantillas invertidas en una caja de esterilización UV. Utilice el ajuste de alimentación estéril "Str" y exponga durante 3 min.

4. Patrón de ligando ECM en cubretapas

1. Prensa de plantillas sobre los cubreobjetos lavados con ácido
   1. Coloque un cubreobjetos lavado sin ácido para cada plantilla en una pieza limpia de película de laboratorio.
   2. Usando fórceps, coloque cuidadosamente cada plantilla, plana hacia abajo, en una cubierta lavada con ácido. Coloque de tal forma que las entidades estén centradas en el cubreobjetos.
   3. Coloque una pequeña pieza de película de laboratorio encima de cada plantilla. Presione firmemente y uniformemente la plantilla para crear un fuerte contacto entre la plantilla y la cubierta.
      NOTA: ¡Este es un paso crítico! Presione firmemente y a través de toda la superficie de la plantilla. Si no se crea suficiente contacto, la solución de ligando se filtrará entre la plantilla y los cubreobjetos y el patrón fallará. OPCIONAL: Para confirmar el contacto suficiente entre la plantilla y el cubreobjetos, pipeta de 100 ml de agua estéril ultrapura sobre la superficie de cada plantilla e incubar a temperatura ambiente. Después de 1 h, compruebe si hay fugas. Aspirar agua de plantillas unidas con éxito y proceder.
2. Limpieza plasmática de la superficie de los cubreobjetos stenciled para aumentar la hidrofilicidad
   1. Coloque los cubreobjetos con plantillas en un limpiador de plasma. Aplicar plasma de alta potencia durante 30 s.
3. Preparación de la solución de ligando ECM
   NOTA: Todos los pasos posteriores deben completarse en condiciones estériles, si es posible.
   1. Colocar en hielo una solución estéril de 100 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 8.0. Una vez enfriado, añadir matrigel y colágeno para alcanzar concentraciones de 225 g/ml y 25 g/ml, respectivamente. OPCIONAL: Para la solución de problemas o para la visualización de ligandos, incluya un ligando con etiqueta fluorescente en la solución de ligando.
      1. NOTA: Se pueden utilizar diferentes ligandos ECM con este método. Para diferentes ligandos, se puede requerir una optimización adicional para determinar la concentración ideal, el tiempo de incubación y la temperatura de incubación. Consulte la sección de discusión para obtener más información.
   2. Pipetear la solución de ligando en la superficie de cada plantilla. Para plantillas hechas de sellos cuadrados de 10 x 10 mm, aplique 100 ml por plantilla.
   3. Compruebe si hay burbujas de aire en las funciones de la galería de símbolos. Si es necesario, utilice fórceps de punta fina o una punta de pipeta de 2 ml para eliminar las burbujas de aire de las entidades.
      NOTA: ¡Este es un paso crítico! Si las burbujas de aire permanecen atrapadas en la superficie del cubreobjetos, el ligando no se adsorbe a la superficie y el patrón resultante estará incompleto.
   4. Colocar los cubreobjetos con ligando en un plato, envolver con película de laboratorio e incubar a 4 oC durante la noche.

5. Transferencia de ligando al gel de poliacrilamida

1. Extracción de la solución de ligando y la plantilla de cada cubreobjetos
   1. Aspirar la solución de ligando de la superficie de una plantilla. La solución de ligand puede recogerse y almacenarse a 4 oC y reutilizarse durante un mes.
   2. Usando fórceps, sumerja brevemente la cubierta con la plantilla en un plato que contenga PBS estéril para lavar.
   3. Sumerja brevemente la cubierta con la plantilla en un segundo plato de PBS estéril para lavar.
   4. Retire la plantilla de la superficie del cubreobjetos. Tenga cuidado de no romper la cubierta.
   5. Sumerja brevemente la cubierta en un plato que contenga agua estéril ultrapura para eliminar las sales de los lavados PBS. Toque el borde de la cubierta a una delicada limpieza de tareas para eliminar el exceso de agua.
   6. Seque el cubreobjetos bajo un gas inerte, como nitrógeno. Marque la parte inferior de la cubierta para realizar un seguimiento de la orientación desde este punto hacia adelante. Tenga cuidado de mantener el lado estampado hacia arriba.
   7. Repita los pasos 5.1.1 a 5.1.6 para cada cubreobjetos con plantilla.
2. Fabricación de hidrogeles de poliacrilamida con cubres estampados
   NOTA: Consulte los métodos anteriores para obtener más detalles^7,9 Esteilizar todos los portagorras, tubos y espaciadores utilizados para hacer geles de poliacrilamida lavando con 10% de lejía durante la noche, enlinando con agua al menos cinco veces para eliminar la lejía, y lavar brevemente en 70% de etanol. Coloque todas las piezas en toallitas de tarea delicadas en un gabinete de bioseguridad estéril para secar antes de su uso.
   1. Preparar la solución de poliacrilamida para obtener la elasticidad deseada del hidrogel (Tabla 2). Mezclar todos los componentes excepto las microesferas fluorescentes y el persulfato de potasio (PPS).
      NOTA: Prepare 1% solución de persulfato de potasio fresca cada vez.
   2. Desgasifique la solución de poliacrilamida, microesferas y PPS en tubos separados al vacío durante 30 minutos.
   3. Para cada cubreobjetos estampados, prepare un revestimiento "inferior" activado por glutaraldehyde con un espaciador (18 mm de diámetro exterior, 14 mm de diámetro interior) colocado en la parte superior.
   4. Después de la desgasificación, sonicar brevemente las microesferas y añadir el volumen adecuado a la solución de poliacrilamida. Mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo, teniendo cuidado de no introducir burbujas de aire. Brevemente sonicado.
   5. Añada el volumen adecuado de PPS a la solución de poliacrilamida. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para mezclar la solución, teniendo cuidado de no introducir burbujas de aire.
      NOTA: Después de añadir PPS, trabaje rápidamente para completar los pasos 5.2.6 a 5.2.11 antes de polimerizar la poliacrilamida.
   6. Pipetear 75-150 l (dependiendo del grosor del espaciador) al centro de cada cubreobjetos activados por glutaraldehído.
   7. Usando fórceps, coloque una cubierta con patrón en cada cubredes activada por glutaraldehído con poliacrilamida y espaciador, de modo que el ligando estampado se enfrente a la solución de poliacrilamida. Si se añadió suficiente solución de poliacrilamida, la tensión superficial absorberá la poliacrilamida entre los dos revestimientos y no habrá burbujas de aire.
   8. Recoja cada "sándwich" de poliacrilamida y toque cuidadosamente el lado de una delicada toallita de tarea para eliminar el exceso de solución de poliacrilamida.
   9. Coloque cuidadosamente cada "sándwich" de poliacrilamida en un soporte de tapa con roscas que sean compatibles con tubos cónicos de 15 ml. La orientación debe ser tal que la parte inferior de la cubierta de glutaraldehído esté en contacto con la parte inferior del soporte de la tapa, y el cubreobjetos estampado está en la parte superior.
   10. Atornille un tubo cónico-inferior de 15 ml en cada soporte de la tapa para mantener los "sándwiches" de poliacrilamida en su lugar. Los tubos deben estar apretados para evitar fugas, pero tenga cuidado de no apretar y romper demasiado los labios de las cubiertas.
   11. Centrifugar los "sándwiches" de poliacrilamida en los tubos de los cubos oscilantes a 200 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Retire los tubos de la centrífuga y colóquelos en bastidores de tubos para mantener la orientación durante 50 minutos adicionales para garantizar una polimerización completa. Mantener cubierto con papel de aluminio para evitar el blanqueo de microesferas fluorescentes.
       NOTA: La centrifugación es fundamental cuando se utiliza este método para realizar TFM. La fuerza centrífuga mueve todas las microesferas a un solo plano, que en última instancia estará justo debajo de la superficie del hidrogel. Esto es ideal para crear imágenes de desplazamientos de microesferas que se utilizan para calcular tensiones de tracción generadas por células. Si no se realiza la MFT, las microesferas se pueden dejar fuera de la solución de poliacrilamida y la polimerización puede ocurrir en el banco sin centrifugación.
   12. Retire los "sándwiches" de poliacrilamida polimerizados de los tubos y sumerja en PBS en un plato de 100 mm. Envolver en película de laboratorio e incubar durante 3 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4oC.
3. Preparación de geles estampados para la sembración de células
   1. Utilice un bisturí y fórceps para eliminar cuidadosamente el cubreobjetos estampados y el espaciador del "sándwich" de poliacrilamida mientras permanece sumergido en PBS. El ligando estampado se habrá transferido a la poliacrilamida durante la polimerización y permanecerá después de retirar el cubreobjetos. El gel de poliacrilamida permanecerá unido a la cubierta activada por glutaraldehído.
      NOTA: ¡Este es un paso crítico! La poliacrilamida debe sumergirse en PBS mientras se retira el cubreobjetos o se destruirán los patrones de ligando.
   2. Coloque cada cubreobjetos con poliacrilamida estampada en un soporte de tapa. Coloque una junta (18 mm de diámetro exterior, 14 mm de diámetro interior) en la parte superior de la cubierta y alrededor de la poliacrilamida, donde se encontraba el espaciador. Atornille un tubo de fondo cónico de 15 mm aserrado en el soporte de la tapa, formando un pozo con la poliacrilamida estampada en la parte inferior. Estos conjuntos encajan en los pocillos de una placa estándar de 12 pocillos para facilitar su manipulación.
   3. Lave cada gel añadiendo 500 sl de PBS al conjunto del pozo. Incubar durante 10 min a temperatura ambiente con suave agitación. Retire el PBS y repita dos veces durante un total de tres lavados.
   4. Después del lavado final de PBS, añadir 500 éL de medios knockout-DMEM a los geles e incubar a 37 oC durante la noche. Los geles se pueden mantener a 37 oC con medios hasta 5 días antes de la sembración de células.
   5. El día antes de la sembración de células, reemplace knockout-DMEM para medios KSR completos e incubar a 37 oC durante la noche.

6. Cultoring hESCs en geles estampados

NOTA: Si planea fijar muestras para inmunomanchar después del MFT, tome imágenes de posiciones de microesfera sin tensión antes de la sembración de células. En este caso, el ligando etiquetado fluorescentemente debe utilizarse en el paso 4.3.1 para que las ubicaciones eventuales de las celdas se conozcan antes de la sembración y se puedan crear imágenes de microesferas en esas regiones.

1. Mantener los cultivos hESC en stock y los cultivos secundarios libres de comedero preparados en placas recubiertas de matrigel en medios KSR acondicionados antes de la siembra en geles de poliacrilamida estampados como se describió anteriormente⁹.
   NOTA: Generar medios KSR condicionados mediante el cultivo de fibroblastos embrionarios de ratón irradiados en medios KSR complementados con factor de crecimiento de fibroblastobásico básico de 4 ng/ml (bFGF). Recoger y reemplazar medios cada 24 h.
2. Aspirar los medios de comunicación de los HESC. Lávese brevemente con medios knockout-DMEM. Añadir 0.05% trypsin-EDTA suplementado con 10 M Y27632 (inhibidor de Rho quinasa) e incubar a 37 oC durante 5-10 min.
3. Agregue medios con suero para inhibir la trippsina. Aspirar suavemente los medios y la pipeta sobre el plato para eliminar las células. Continúe pipeteando suavemente para eliminar todas las células y disociar los racimos de células a células individuales.
4. Recoger la suspensión celular y centrifugar a 200 x g durante 3 min.
5. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en un volumen equivalente de medios KSR para lavar. Centrífuga a 200 x g durante 3 min.
6. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en medios KSR acondicionados complementados con 10 ng/ml bFGF y 10 M Y27632.
7. Cuente las células con un hemocitómetro y ajuste la suspensión celular a una concentración de 300.000 células por ml. Pipetear 500 l de la suspensión celular en cada gel estampado (150.000 células por gel).
8. 3 h después de la sembrada, utilice una pipeta para aspirar cuidadosamente el medio de cada gel y reemplazarlo con medios KSR acondicionados frescos complementados con 10 ng/ml bFGF y 10 M Y27632. Esto elimina el exceso de células que no se adhirieron a las regiones con patrones de la poliacrilamida.
   NOTA: ¡Este es un paso crítico! En esta etapa las células se adhiren libremente al ligando estampado. Tenga mucho cuidado al intercambiar medios para no separar las celdas. Se debe tener el mismo cuidado con cada uno de los intercambios de medios en los pasos posteriores.
9. 24 h después de la sembrada, utilice una pipeta para aspirar cuidadosamente el medio e intercambiar por medios KSR acondicionados complementados con 10 ng/mL bFGF y 5 M Y27632.
10. 48 h después de la sembración, utilice una pipeta para aspirar cuidadosamente el medio e intercambiar por medios KSR acondicionados complementados con 10 ng/mL bFGF. Esto elimina el inhibidor de Rho quinasa de los medios de comunicación y los experimentos pueden comenzar al día siguiente, 72 h después de la sembración.

7. Realización de TFM

1. Cuando lo desee, realice el MFT como se describió anteriormente⁹ en las condiciones experimentales deseadas.
2. Si se tomaron imágenes de microesferas sin tensión antes de sembrar las células, fije las células después de tomar posiciones de microesfera estresadas y realice inmunomanchas para determinar la localización de proteínas de interés en relación con regiones de fuerzas de tracción altas y bajas.

Resultados

El principal reto a superar al intentar cultivar hESCs en colonias de geometría controlada en sustratos compatibles es generar un patrón homogéneo de ECM-ligand en la superficie del sustrato. La estrategia presentada en este método consiste primero en generar el patrón deseado en la superficie de un revestimiento de vidrio y luego transferir ese patrón a la superficie de un hidrogel de poliacrilamida durante la polimerización del gel(Figura 1 A

Discusión

Para simplificar un protocolo largo y detallado, este método consta de tres etapas críticas: 1) generar patrones de ligando ECM en cubiertas de vidrio, 2) transferir los patrones a hidrogeles de poliacrilamida durante la polimerización del gel, y 3) sembrar hESC en el hidrogel estampado. Hay pasos críticos que deben ser considerados en cada una de estas tres etapas. Con el fin de generar patrones de alta fidelidad en las cubiertas de vidrio, la plantilla debe ser firmemente presionada sobre la cubierta para evitar la fug...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0.05% Tripsina	Gibco 25300054
placa de Petri de vidrio de 100 mm	Fisher Scientific	08-747B
Placa de Petri de plástico de 100 mm	Fisher Scientific	FB0875712
15 mL tubos de fondo cónico	Corning	352095
150 mm placa de Petri de plástico	Fisher Scientific	FB0875714
18 mm Cubreobjetos de diámetro #1	Thermo Scientific	18CIR-1
2% bisacrilamida	Bio-Rad	161-0142
3-aminopropiltrimetoxisilano	ACROS Organics	313251000
40% acrilamida	Bio-Rad	161-0140
Papel de aluminio	Fisher Scientific	01-213-100
Factor básico de crecimiento de fibroblastos	Sigma-Aldrich	F0291
Bleach	Clorox	N/A
Centrífuga con cubos oscilantes	Eppendorf	22623508	Modelo: 5804 R
Colágeno	Corning
Desecador	Fisher Scientific	08-642-7
Etanol	Fisher Scientific AC615095000
Fetal suero bovino	Gibco	16000044
Microesferas fluorescentes Pinzas	Thermo Scientific	F8821
(para cubreobjetos)	Pinzas Fisher Scientific	16-100-122
(para obleas)	Fisher Scientific	17-467-328
Soportes de gel	N/A	N/A	Los soportes de gel están impresos en 3D personalizados, dibujos CAD disponibles bajo pedido
Glutaraldehído	Fisher Scientific	50-261-94
HEPES	Thermo Scientific	J16926A1
Placa calefactora	Fisher Scientific	HP88854100
Ácido clorhídrico	Fisher Scientific	A144S-500
Alcohol isopropílico	Fisher Scientific	A416-500
Kimwipes (toallitas delicadas para tareas)	Kimberly-Clark Professional	34120
Knockout suero de repuesto	Gibco	10828028
Knockout-DMEM	Gibco	10829018
Alineador de mascarillas (para fotolitografía)	Karl Suss America, Inc.	Karl Suss MJB3 Alineador
Matrigel	Corning	354277
Microscopio para fuerza de tracción	Nikon	N/A	Modelo: Eclipse TE200 U
Platina de posicionamiento motorizada	Prior Scientific	N/A	Modelo: HLD117
Gas nitrógeno	Airgas	NI 250
Norland adhesivo óptico 74 (polímero curable UV)	Norland Productos	NOA 74
Oven	Thermo Scientific	PR305225G
Parafilm (película de laboratorio)	Fisher Scientific	13-374-12
PDMS (Sylgard 184)	Fisher Scientific	NC9285739
Photomask	CAD/Art Services, Inc.	N/A	Las fotomascarillas se fabrican a medida. Dibujo CAD para nuestros diseños disponible a pedido
Limpiador de plasma	Fisher Scientific	NC9332171
Plástico para junta	Marian Chicago	HT6135
Plástico para espaciador	TAP Plastics	N/A Lámina	policarbonato, .01 pulgada
de espesor Cloruro de potasio (para hacer PBS)	Fisher Scientific	P217-500
Fosfato de potasio monobásico (para la fabricación de PBS)	Fisher Scientific	P285-500
Persulfato de potasio	ACROS Organics 424185000
Bisturí	Fisher Scientific	14-840-00
Oblea de silicio	Microscopía electrónica Sciences	71893-06	Tipo P, 3 pulgadas, obleas de silicio
Cloruro de sodio (para la fabricación de PBS)	Fisher Scientific	S271-1
Hidróxido de sodio	Fisher Scientific	S318-100
Fosfato de sodio dibásico dihidratado (para hacer PBS)	Fisher Scientific	S472-500
SU8-3050	Fotorresistente MicroChem	SU8-3000
SU8-Revelador	MicroChem	Y020100
TEMED	Bio-Rad	161-0800
caja de esterilización UV	Bio-Rad	N/	A Bio-Rad GS Gene Linker UV
Chamber Y27632 (inhibidor de la Rho quinasa)	StemCell Technologies	72304