Method Article

Producción, cristalización y determinación de la estructura del dominio vinculante iKK de NEMO

DOI:

10.3791/60339

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December 28th, 2019

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Dartmouth College

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Describimos los protocolos para la determinación de la estructura del dominio de unión IKK de NEMO por cristalografía de rayos X. Los métodos incluyen la expresión de proteínas, purificación y caracterización, así como estrategias para la optimización exitosa del cristal y la determinación de la estructura de la proteína en su forma no unida.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NEMO es una proteína de andamiaje que desempeña un papel esencial en la vía NF-B mediante el montaje del complejo IKK con las quinasas IKK y IKK. Tras la activación, el complejo IKK fosforila las moléculas de I-B que conducen a la translocación nuclear NF-B y a la activación de genes diana. La inhibición de la interacción NEMO/IKK es un paradigma terapéutico atractivo para la modulación de la actividad de la vía NF-B, haciendo de NEMO un objetivo para el diseño y el descubrimiento de inhibidores. Para facilitar el proceso de descubrimiento y optimización de los inhibidores NEMO, diseñamos una construcción mejorada del dominio de unión IKK de NEMO que permitiría la determinación de la estructura de la proteína en forma de apo y mientras se unía a inhibidores de peso molecular pequeño. Aquí presentamos la estrategia utilizada para el diseño, expresión y caracterización estructural del dominio de enlace IKK de NEMO. La proteína se expresa en células de E. coli, solubilizadas en condiciones de desnaturalización y purificadas a través de tres pasos cromatográficos. Discutimos los protocolos para la obtención de cristales para la determinación de la estructura y describimos las estrategias de adquisición y análisis de datos. Los protocolos encontrarán una amplia aplicabilidad a la determinación de la estructura de los complejos de NEMO y los inhibidores de moléculas pequeñas.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La vía NF-B se activa en respuesta a una variedad de estímulos, incluyendo citoquinas, productos microbianos y estrés, para regular la expresión de genes diana responsables de la respuesta inflamatoria e inmunitaria, la muerte celular o la supervivencia y proliferación1. Patologías incluyendo enfermedades inflamatorias y autoinmunes y cáncer2,3,4,5 se han correlacionado con la hiperactivación de la vía, que ha hecho de la modulación de la actividad NF-B un objetivo principal para el desarrollo de nuevas terapias6,7.

La vía canónica NF-B, en particular, se distingue de la vía no canónica, responsable de la linfoorganogénesis y la activación de las células B, por la dependencia de la primera de la proteína de andamios NEMO (modulador esencial NF-B8) para el montaje del complejo IKK con las quinasas IKK y IKK. El complejo IKK es responsable de la fosforilación de I-B (inhibidor de la B) que se dirige a su degradación, liberando los dimers NF-B para translocar se translocando al núcleo para la transcripción génica1 y por lo tanto es un objetivo atractivo para el desarrollo de inhibidores para modular la actividad NF-B.

Nuestra investigación se centra en la caracterización de la interacción proteína-proteína entre NEMO e IKK, dirigida a NEMO para el desarrollo de inhibidores de moléculas pequeñas de formación compleja IKK. El dominio de unión mínimo de NEMO, necesario para unir IKK, abarca los residuos 44-111, y su estructura se ha determinado en complejo con un péptido correspondiente a la secuencia 701-7459de IKK. NEMO e IKK forman un paquete de cuatro hélices donde el dimer NEMO acomoda los dos hélices de IKK(701-745) en una ranura abierta alargada con una interfaz de interacción extendida. IKK-(734-742), también conocido como el dominio de unión NEMO (NBD), define el punto caliente más importante para la unión, donde los dos triptófanos esenciales (739,741) entierran profundamente dentro del bolsillo nemo. Los detalles de la estructura compleja pueden ayudar en el diseño basado en la estructura y la optimización de pequeños inhibidores de moléculas dirigidos a NEMO. Al mismo tiempo, es difícil que la unión de una molécula pequeña o péptido recree en NEMO el cambio de conformación completo (es decir, la apertura extensiva del dimer de bobina enrollada NEMO) causada por la unión de la larga IKK(701-745), como se observa en el cristal, y la estructura de NEMO o NEMO unido a un inhibidor de molécula pequeña puede representar un mejor objetivo para el diseño de fármacos basados en la estructura y la optimización de inhibidores.

Nemo de longitud completa y construcciones de truncamiento más pequeñas que abarcan el dominio de unión IKK han demostrado ser intratables para la determinación de la estructura en la forma no enlazada a través de los métodos10de cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear (NMR), lo que nos llevó a diseñar una versión mejorada del dominio de unión IKK de NEMO. De hecho, NEMO (44-111) en forma no enlazada sólo está parcialmente plegado y se somete a un intercambio conformación y, por lo tanto, nos fijamos para estabilizar su estructura dimerica, pliegue de bobina enrollada y estabilidad, preservando al mismo tiempo la afinidad de unión para IKK. Al anexar tres heptads de secuencias de bobinas enrolladas dimíricas ideales11 en el N-y C-termini de la proteína, y una serie de mutaciones de cuatro puntos, generamos NEMO-EEAA, una construcción totalmente dimerica y doblada en una bobina enrollada, que rescató la afinidad de unión IKK al rango nanomolar como se observó para la longitud completa de NEMO12. Como ventaja adicional, esperábamos que los adaptadores de bobina enrollada (basados en la secuencia GCN4) facilitarían la cristalización y eventualmente ayudarían en la determinación de la estructura de rayos X a través del reemplazo molecular. Los adaptadores de bobina enrollada se han utilizado de manera similar para aumentar la estabilidad, mejorar el comportamiento de la solución y facilitar la cristalización de bobinas recortadas y fragmentos de anticuerpos13,14. NEMO-EEAA se expresa y purifica fácilmente a partir de células de Escherichia. coli con una etiqueta de Histidina escleable, es soluble, doblado en una bobina de bobinado tenue estable y se cristaliza fácilmente, con difracción a 1,9o. La presencia de las regiones ordenadas de bobinas enrolladas de GCN4 podría ayudar adicionalmente a la eliminación gradual de los datos de los cristales de NEMO-EEAA mediante reemplazo molecular utilizando la estructura conocida de GCN415.

Dados los resultados obtenidos con apo-NEMO-EEAA, creemos que los protocolos descritos aquí también podrían aplicarse a la cristalización de NEMO-EEAA en presencia de pequeños péptidos (como el péptido NBD) o inhibidores de moléculas pequeñas, con el objetivo de comprender los requisitos para la inhibición de NEMO y la optimización basada en la estructura de los inhibidores iniciales de plomo a alta afinidad. Dada la plasticidad y la naturaleza dinámica de muchos dominios de bobina sin bobina16,el uso de los adaptadores de bobina enrollada podría encontrar una aplicabilidad más general para ayudar a la determinación estructural.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Diseño de la construcción para cristalografía

  1. Clonar la secuencia de NEMO-EEAA como en la publicación anterior12 en un vector para la expresión en E. coli utilizando el promotor T7, incluyendo una etiqueta de hexa-histidina N-terminal y un sitio de escisión de proteasa.
    NOTA: En este protocolo, utilizamos un vector modificado para incluir una etiqueta N-terminal hexa-histidina y un sitio de escote del Virus etch del Tabaco (TEV)10. Este vector facilita el escote de la etiqueta His para la cristalización de proteínas y deja sólo la extensión corta de los residuos de GSW antes del inicio de la secuencia de proteínas deseada. El vector del que se derivó, y los vectores alternativos se enumeran en la Tabla de materiales. En este protocolo, las modificaciones posteriores a la secuencia original de NEMO(44-111) se introdujeron escalonadamente, como se describió anteriormente10,utilizando mutagénesis dirigida lateralmente. Inicialmente intentamos estabilizar el dimer de bobina enrollada NEMO añadiendo los adaptadores de bobina enrollada ideales (en una longitud de al menos tres heptads) al extremo N-terminal o C-terminal o a ambos. La bobina de doble bobina fue la más prometedora de los ensayos de cristalización anteriores y posteriormente fue modificada introduciendo mutaciones para mejorar la cristalización como se describió anteriormente12.

2. Expresión a gran escala de sus6 etiquetadas NEMO-EEAA

  1. Transforme la construcción en células competentes BL21(DE3). Conservar a -80oC como material de glicerol celular.
  2. Día 1 – Preparar un cultivo de arranque celular. En un matraz Erlenmeyer de 125 ml, añadir 20 ml de solución de caldo estupendo y 20 ml de un stock de 100 mg/ml de ampicilina. Añadir unos pocos microlitros de material de glicerol celular (a partir de -80 oC de almacenamiento de células competentes BL21(DE3) transformadas con vector).
  3. Agitar el cultivo de arranque de 10 ml durante la noche a 37 oC, 220 rpm (aproximadamente 15 h).
  4. Día 2 – Desde el principio, diluir a un OD600 a 0,1 en 250 ml de caldo estupendo. Añadir ampicilina a una concentración final de 100 g/ml. Crecer a un OD600 a 0.8-1.0.
    1. Añadir isopropilo a -D-1-tiogalactopyranoside (IPTG) a 500 m, y crecer durante 4 h a 37 oC.
    2. Medir OD600 de cultivo inducido después de 4 h. La cultura debe alcanzar unaD.O. 600 a 6-10.

3. Purificación de sus6 etiquetados NEMO-EEAA

  1. El cultivo de células de giro hacia abajo a 3.800 x g durante 20 min a 4 oC.
  2. Guarde el pellet celular y deseche el medio.
    NOTA: El pellet celular se puede guardar y almacenar a -20 oC en este punto, para su purificación en un momento posterior.
  3. Resuspender las células en 40 ml de tampón de lisis que contienen 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM de imidazol, 2 mM MgCl2, 0,5 mM de fluoruro de fenilmetilnil, 2 mM de dithiothreitol (TDT) y 3 l de benzonase Nucleasa.
    NOTA: La columna de cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizado de níquel (IMAC) utilizada es compatible con tDT de 2 mM. Alternativamente, 0.2 mM tris(2-carboxyethyl)fosfina (TCEP) se puede utilizar.
  4. Divida las células resuspendidas en dos alícuotas de 20-25 ml.
  5. Lijar las células usando prensa francesa (presión aproximada 25.000 psi), repitiendo 2-3 veces para cada alícuota (en la cámara fría).
    NOTA: Alternativamente, las células podrían ser lysed por sonicación (no probado en este protocolo).
  6. Añadir urea al lisado celular a una concentración final de 8 M, permitir incubar en una plataforma de balanceo durante un mínimo de 2 h o hasta la noche. Esto y todos los siguientes pasos de purificación, con la excepción de la diálisis, se pueden realizar a temperatura ambiente.
  7. Día 3 – Transfiera el lysato a tubos ultracentrífugos y equilibre el peso, asegurando que el lysato llene los tubos a por lo menos 3/4 llenos. Girar el lisado a 125.000 x g durante 45 min a 25 oC. Decantar el sobrenadante en un vaso de precipitados de 100 ml para cargarlo en la columna.
    NOTA: La centrifugación a 4oC hará que la urea se estrelle.
  8. En un sistema de cromatografía líquida rápida, retire el etanol de la columna IMAC 5 ml con 25 ml de Ultrapure H2O a 5 ml/min, seguido de 25 ml de tampón de elución que contiene 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 500 mM de imidazol, 2 mM de TDT, pH 8.0, luego 25 mL de tampón de unión que contiene 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM de imidazol, 2 mM dTT, 8 M urea, pH 8.0.
  9. Cargue el sobrenadante incubado de urea a 3 ml/min en la columna IMAC, recogiendo el flujo a través. Lave la columna para volúmenes de 10 columnas con búfer de enlace a 3 ml/min.
  10. Refold NEMO-EEAA construir en columna mediante el lavado de columna con tampón de redoblamiento para 20 volúmenes de columna a 3 mL/min, que contiene 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM imidazol, 2 mM TDT, pH 8.0.
  11. Realizar la elución de gradiente de NEMO-EEAA, de 10 a 500 mM de Imidazol sobre un gradiente de volumen de 12 columnas, recogiendo todo eluido en placa de recolección de fracciones (1 ml de fracciones).
  12. Continúe laución a 500 mM imidazol para dos volúmenes de columna, continuando recogiendo.
  13. Ejecutar dodecilo sulfato de sodio (SDS)- electroforesis de gel de poliacrilamida (PAGE) de fracciones para determinar la presencia de NEMO- EEAA en fracciones de elución.
    NOTA: Utilizamos 10% de acrilamida, búfer MES.
  14. Fracciones de piscina que contienen proteína diana pura.
  15. Mida la concentración de proteínas mediante el ensayo Bradford17.
    NOTA: Esto es necesario para estimar la cantidad de proteasa para el escote de etiquetas.

4. Su6 etiquetas de escote y purificación

  1. Agregue TEV en una relación de peso 1:10 de la proteína TEV:NEMO-EEAA para cleave la etiqueta His6. La proteasa TEV fue purificada en casa.
    NOTA: Optimice la cantidad de TEV, el tiempo y la temperatura necesarios para un escote completo por separado.
    1. Proteasa TEV exprés, mutante S219V18 en células BL21(DE3)-RIL y purificar como se describió anteriormente19. Cultivar brevemente las células como se describe en el paso 2, lyse por francés prensa y purificar utilizando una columna IMAC. Almacene la proteína final en tampón de fosfato sódico de 25 mM, pH 7,8, 150 mM de NaCl, EDTA de 1 mM, TDT de 2 mM y glicerol de 20% v/v.
  2. Dializar la muestra durante la noche (aproximadamente 15 h) en 4 L de 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM TDT, pH 8.0, para permitir el escote y eliminar el exceso de imidazol de la muestra para la posterior purificación.
  3. Día 4 – Retire la muestra de la diálisis. Ejecute un gel SDS-PAGE de la muestra de teV escote para asegurarse de que se ha completado el escote.
  4. En un sistema de cromatografía líquida rápida, retire el etanol de una columna IMAC de 5 ml con 25 ml de Ultrapure H2O a 5 ml/min, seguido de 25 ml de tampón de elución que contiene 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 500 mM de imidazol, 2 mM de TDT, pH 8.0, entonces tampón de unión que contiene 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM imidazol, 2 mM DTT, pH 8.0.
  5. Cargue la columna a 1 ml/min con NEMO-EEAA sin levadura TEV. Nemo-EEAA desaliñado eluirá en el flujo: recoger en una placa de recolección de fracciones de 96 pocillos (1 ml de fracciones). Lavar la columna para cinco volúmenes de columna de 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM imidazole a 1 mL/min, continuando recogiendo en placa de recogida de fracciones.
  6. Elute TEV y desnalado su6-NEMO-EEAA con tres volúmenes de columna de 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 500 mM imidazol, 2 mM DTT, pH 8.0, recolectando elución en un matraz de 50 mL.
  7. Ejecute el gel SDS-PAGE de fracciones de flujo a través para determinar la presencia de NEMO-EEAA.
  8. Fracciones de flujo de piscina que contienen construcción NEMO-EEAA sin levadura, y se concentran utilizando un concentrador de células agitadas a 5 ml. Corte del peso molecular de la membrana (MWCO) a 3 kDa.
  9. Utilizando una membrana de 3 kDa MWCO, dializar la muestra concentrada en 2 L de 20 mM Tris, 100 mM NaCl, 2 mM de TDT, pH 8,0 durante 2 h. Cambie el tampón de diálisis a 2 L de tampón de diálisis fresco para diálisis durante la noche (aproximadamente 15 h), a 4 oC.
  10. Día 5 – Cargar 5 ml de la muestra dializada en una cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) columna de 16 mm x 60 cm (tamaño medio de partícula de 34 m) a 1 ml/min en Tris de 2 mM, 100 mM de NaCl, 2 mM de TDT, pH 8.0. Repita con columnas adicionales dependiendo del volumen de muestra.
  11. Agrupa las fracciones correspondientes a NEMO-EEAA dimerica.
    NOTA: NEMO-EEAA eluye entre 60-65 ml, correspondiente a una proteína de mayor peso molecular, debido a la naturaleza alargada de la bobina de bobinado tenue.
  12. Concentre utilizando un concentrador de células agitadas y una membrana MWCO de 3 kDa a una concentración final de 113 m (1,65 mg/ml).
  13. Alícuota la proteína y guárdela a 4oC (estable durante más de 1 mes).

5. Examen de matriz dispersa

NOTA: El protocolo realiza ensayos de cristalización utilizando pantallas disponibles en el comercio y configurando experimentos de gota sentados utilizando un robot de cristalización. Las imágenes de cristal son recopiladas automáticamente por un imager.

  1. Utilizando pantallas de matriz dispersa disponibles en el mismo nombre (ver Tabla de Materiales),pipeta de 60 ml de solución de matriz dispersa en cada uno de los 96 pocillos de una placa de cristalización de 2 cámaras gotas para la difusión de vapor de gota (solución de depósito).
  2. Utilizando un establecedor robótico de gotas, dispensar 100 nL de solución proteica a 1,65 mg/ml en una proporción de 1:1 con solución de depósito en gota 1 para un volumen final de 200 nL; a continuación, 66 nL de solución proteica con 134 nL de solución de depósito para un volumen final de 200 nL en gota 2 (1:2 relación).
  3. Selle la placa con cinta de sellado de 3 pulgadas de ancho inmediatamente después de la dosificación.
    NOTA: Las gotas se secarán si se dejan expuestas a la atmósfera durante más de 2-3 min.
  4. Almacene las bandejas en el almacenamiento del imager de cristalización, a 20 oC, comprobando las imágenes recopiladas automáticamente en busca de presencia de cristal, a partir de dos días.
    NOTA: El cribado de cristalización se llevó a cabo en paralelo con la optimización de la construcción. Cristales iniciales formados en las siguientes condiciones (pantallas comerciales enumeradas en la Tabla de Materiales):a) 0,1 M Tris, pH 8,0, 30 % v/v polietilenglicol (PEG) MME 550, ácido poli-glutámico al 5%, polímero de bajo peso molecular 200-400 kDa (PGA -LM); b) 0,1 M Tris, pH 7,8, 20% w/v PEG MME 2k, 5% PGA-LM; c) 0,1 M Tris, pH 7,8, 20% w/v PEG 3350, 5% PGA-LM. Los cristales de la pantalla de matriz dispersa tendrán una uniformidad deficiente de la celosía; por lo tanto, se verán pobres usando imágenes polarizadas cruzadas. Utilice imágenes UV para asegurarse de que los cristales contienen proteínas. El siguiente paso de generación de stock de semillas es necesario para obtener los cristales de calidad de difracción final.

6. Generación de semillas

NOTA: Obtenemos cristales reproduciblemente para la generación de semillas en 0,1 M Tris pH 8.0, 5% PGA-LM, 3,6% p/v PEG 20k. Sin embargo, los cristales mostrarán un gran mosaico y no son adecuados para la recopilación de datos en esta etapa.

  1. Usando un kit para la generación de semillas, prepare el stock de semillas pipeteando toda la gota con cristal presente, y colóquelo en una solución de condición de cristalización de 50 ml en el vial proporcionado.
  2. Vortex el stock de semillas durante 3 min, pulsando 20 s encendido y 10 s apagado.
  3. El stock de semillas diluido en serie en incrementos de 1:10 es de 1:10.000. Conservar todas las diluciones a 4oC, para su uso posterior.

7. Pantallas finas

  1. Diseñe pantallas finas que varían las condiciones para Tris, PGA-LM y PEG. Varia la longitud de PEG para bandejas individuales.
    NOTA: La pantalla fina que produjo el cristal utilizado para la determinación de la estructura de NEMO-EEAA empleó las siguientes condiciones: 0,1 M Tris pH 8; PGA-LM varió de 8 a 0% en las columnas 1-12. Filas A-H examinan diferentes PEGs, con concentraciones que varían en las columnas 1-12 de la siguiente manera. A: PEG 200 (0-40% v/v); B: PEG 400 (0-40% v/v); C: PEG MME 500 (0-40% v/v); D: PEG 1000 (0-30% w/v); E: PEG 3350 (0-30% w/v); F: PEG 6k (0-30% w/v); G: PEG 10k (0-20% w/v); H: PEG 20k (0-20% p/v). El cristal apareció en pozo H4 (5,45% w/v PEG 20k, 5,8% p/v PGA-LM). En este protocolo, se utilizó un manipulador de líquidos constructor de pantalla de cristalografía de proteínas para construir las pantallas.
  2. Semilla una reserva de proteína en una relación de volumen de 1:25 de 1:1,000 dilución de semillas.
    NOTA: La concentración de NEMO-EEAA disminuirá ligeramente, pero los cristales seguirán formendo.
  3. Repita el paso 2 con 1:10.000 dilución de semillas, la misma relación de volumen 1:25.
  4. Utilizando el establecedor de gotas, dispensar 100 nL de solución proteica a 1,65 mg/ml, con 1:1.000 dilución de la semilla en una proporción de 1:1 con solución de depósito en caída 1 para un volumen final de 200 nL. Repita para la caída 2, pero con 1:10,000 dilución de la acción de semillapresente presente.
  5. Selle la placa con cinta de sellado de 3 pulgadas de ancho inmediatamente después de la dosificación.
    NOTA: Las gotas se secarán si se dejan expuestas a la atmósfera durante más de 2-3 min.
  6. Almacene las bandejas en el almacenamiento del imager, a 20 oC, comprobando las imágenes recogidas después de dos días en busca de presencia de cristal.
  7. Compruebe los cristales con el imager de polarizador cruzado para comprobar la uniformidad de la celosía, para seleccionar las condiciones individuales para configurar las siguientes bandejas.

8. Generación de cristales para la recopilación de datos

  1. Diseñe pantallas de una sola condición alrededor de Tris, PGA-LM y PEG que produjeron cristales uniformes analizados por imágenes polarizadas cruzadas, y los cristales más grandes posibles.
    NOTA: Los cristales de estas condiciones son de forma irregular, en su mayoría láminas delgadas rectangulares. Es clave seleccionar una condición donde los bordes del cristal estén bien definidos y tengan el mayor espesor posible.
  2. Hacer 20 ml de condición de cristalización a mano.
  3. Usando un pipeteador multicanal, dispensar 60 l por pocto en una placa de cristalización de 2 pozos de cámara de caída y 96 pozos para la difusión de vapor de gota en función de la salida de asiento.
  4. Prepare el stock de semillas como se describe en el paso 6.2.
  5. Dispensar la proteína como se describe en el paso 6.3.
  6. Selle la placa con cinta de sellado de 3 pulgadas de ancho inmediatamente después de la dosificación.
    NOTA: Las gotas se secarán si se dejan expuestas a la atmósfera durante más de 2-3 min.
  7. Almacene las bandejas en el imager a 20 oC y compruebe la presencia de cristales en las imágenes todos los días.
  8. Compruebe las imágenes polarizadas cruzadas de los cristales para comprobar la uniformidad de la celosía, para seleccionar cristales para la recopilación de datos.

9. Determinación del crio-protector

  1. Para probar los crioprotectores, cree soluciones de stock correspondientes a las condiciones de cristalización pero que contengan una concentración 30%, 20%, 10% y 5% mayor de cada componente. La adición del volumen crio-protector dará lugar a una concentración final de componentes que es lo mismo que las condiciones de cristalización.
    NOTA: Para probar un crio-protector a una concentración del 30% en volumen para una condición de cristalización Tris de 0,1 M, comience con una solución de stock de 0.143 M Tris, antes de agregar el crio-protector.
  2. A partir de un kit de crio-reactivos, cree 10 l de muestra para la prueba de crio-protector mezclando un 30% por volumen de condición crioamericana en el 70% de la solución de material de condición de cristalización, para una concentración final de 30% crio-protector en condiciones de cristalización originales. Homogeneizar.
    1. Con una pipeta de 10 l, tome 5 ml de solución de prueba protegida contra la crioya y sumerja la punta del pipeteo en nitrógeno líquido. Si se observa hielo, deseche.
    2. Pruebe todos los crioprotectores al 30%. Para las soluciones exitosas, repita el proceso al 20%, luego al 10% y al 5% de crio-protector.
    3. Utilizando la exitosa solución crio-protecnte con el menor porcentaje de crio-protector, agregue 0,5 ml de solución en una gota de prueba con cristales presentes. Observar bajo el microscopio, cronometrando cuánto tiempo dura el cristal en la condición, si no es indefinido.
      NOTA: Estos cristales son solo para prueba y se descartarán. Para NEMO-EEAA, 12% 1,2-propanediol es la solución crio-protectora óptima. El 12% representa la dilución que experimentará la solución crio-protectora cuando se añada a la gota de cristal de aproximadamente 100 nL, para una concentración final aproximada de 1,2-propanediol del 10%.

10. Bucle de cristal

  1. Cristales de bucle 1-2 días antes del envío al sincrotrón.
    NOTA: Los cristales tendrán aproximadamente 60-100 m de diámetro: los bucles de 0,05 – 0,10 mm son ideales para bucles.
  2. Corta la cinta desde la parte superior del pozo.
  3. Añadir 0,5 l de solución de cristalización que contenga 12% 1,2-propanediol crio-protector directamente al pozo.
    NOTA: La concentración final de 1,2-propanediol es ahora de aproximadamente el 10%, debido a la dilución por 100 nL de solución de gota (reducción aproximada del volumen de caída desde 200 nL iniciales, debido a la difusión del vapor).
  4. Vaa el cristal del pozo.
    NOTA: Los cristales a menudo crecen en la parte inferior del pozo, pero se desalojan con un suave empujón del bucle. Una vez desalojado, bucle.
  5. Almacene el cristal que contiene criobucles en discos sumergidos en líquido N2.
  6. Almacene estos discos en líquido N2 en el matraz Dewar hasta que estén listos para su envío para la difracción de rayos X en el sincrotrón.

11. Recopilación de datos

  1. Recopile datos de difracción de rayos X. En este protocolo, utilice AMX beamline (ID: 17-ID-1), National Synchrotron Light Source II.
    NOTA: Los datos se recopilaron en el sitio, pero se pueden recopilar de forma remota. Recopile datos en la región del cristal que mostraron uniformidad de celosía en imágenes polarizadas cruzadas. Coloque los cristales en el bucle de modo que la recopilación de datos no implique regiones "pobres" del cristal mientras el cristal gira en el goniómetro. Los datos que proporcionaban la mejor resolución provenían de la colección en el borde de una extensión de un cristal de aproximadamente 5 x 5 m de tamaño. Utilice el rastering para identificar las mejores áreas del cristal para recopilar20.

12. Procesamiento de datos de rayos X

  1. Procesar el conjunto de datos a la resolución más alta recopilada (1,8o) con el programa XDS IDXREF para determinar el grupo de espacio, la celda de la unidad y el contenido solvente.
  2. Integre datos utilizando el programa XDS INTEGRATE.
  3. Procesar intensidades escaladas desde el programa XDS XSCALE utilizando STARANISO Server, utilizando la media de corte de I/I de 1.2 para la superficie de límite de difracción para los datos.
    NOTA: Los datos no se cortarán en el iplipsoide verdadero. Conserve todos los datos por encima del límite de I/-I de 1,2. Las estadísticas sobre los datos calculados para la integridad esférica serán deficientes, debido al truncamiento no esférico. La integridad elíptica fue del 88% con las resoluciones más altas de: 1,88o, 2,10o y 2,55o a lo largo del eje a*, b* y c, respectivamente.

13. Solución de estructura

  1. Utilice la estructura de rayos X de GCN4 (PDB: 4DMD)15 como modelo de búsqueda para el reemplazo molecular utilizando MRage21 en PHENIX22. La estructura 4DMD se definió en MRage como un "conjunto", y la solución MRage construyó con éxito la parte de la estructura correspondiente al adaptador de bobina enrollada N-terminal de NEMO-EEAA, homólogo al modelo de búsqueda, para ambas cadenas en el dimer.
    NOTA: Desactive la corrección de anisotropía en PHASER o los datos se reducirán aún más.
  2. Utilice rondas sucesivas de Autobuild23 en PHENIX y construcción manual (usando mapas 2Fo-Fc y Fo-Fc, en Coot24) para construir el resto de la estructura.
  3. Construir manualmente los residuos que aún faltan en el modelo basado en mapas 2Fo-Fc y Fo-Fc, utilizando Coot24.
    NOTA: La última etapa consistió en la construcción de los 4 residuos de la terminal N y 4 residuos de terminal C para cada monómero. La colocación de la cadena lateral también se ajustó manualmente según sea necesario.
  4. Calcular un mapa de omisión compuesto utilizando PHENIX y una omisión del 10% de la estructura.

14. Refinamiento de la estructura

  1. Refinar las estructuras con PHENIX Refine. Ejecute los refinamientos iniciales contra los pesos de disolvente a granel y estereoquímica, relajando las restricciones RMSbond y RMSangle a 0.01 y 1.0, respectivamente. Continúe con el refinamiento de factores B individuales, parámetros TLS y ocupaciones.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Clonación, expresión y purificación del dominio iKK vinculante de NEMO.
El protocolo seguido en este estudio para obtener la secuencia final de NEMO-EEAA(Figura 1A),que produjo cristales de calidad de difracción, implicó la expresión y caracterización de todas las construcciones intermedias, incluyendo la adición de los adaptadores de bobina enrollada en N- y C-terminus, las mutaciones C76A, C95S y las mutaciones E56A, E57A. La Figura...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los intentos de cristalización de NEMO en forma no enlazada no tuvieron éxito, incluidos los intentos de usar la proteína de longitud completa y varias construcciones de truncamiento que abarcan el dominio de unión IKK. Nuestra caracterización biofísica del dominio iKK-unión de NEMO (residuos 44-111) por dicroísmo circular, espectroscopia de RMN y anisotropía de fluorescencia indicó que la construcción, aunque capaz de unir IKK, existía en un estado de intercambio conformación, no adecuado para la cristalización

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no declaran intereses en competencia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos al Profesor D. Madden, por muchas discusiones útiles a lo largo de este proyecto. Agradecemos al profesor D. Bolon por el regalo del plásmido que contiene la bobina enrollada GCN4 optimizada. Agradecemos al Dr. B. Guo por los plásmidos NEMO. Agradecemos a Christina R. Arnoldy, Tamar Basiashvili y Amy E. Kennedy por demostrar el procedimiento. Agradecemos a la Instalación Básica de Cristalografía BioMT y a los departamentos de Química y De Bioquímica y Biología Celular de Dartmouth por el uso del equipo de cristalografía y el personal de BioMT por su apoyo. Esta investigación utilizó la línea de haz AMX de la National Synchrotron Light Source II, una Oficina de Usuarios de Ciencias del Departamento de Energía de los Estados Unidos (DOE) operada para la Oficina de Ciencia del DOE por el Laboratorio Nacional Brookhaven bajo el Contrato No. DE-SC0012704. Agradecemos al personal de NSLS II por su apoyo. Este trabajo fue financiado por las subvenciones NIH R03AR066130, R01GM133844, R35GM128663 y P20GM113132, y una subvención Munck-Pfefferkorn Novel and Interactive.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
20% p/v γ-PGA (forma Na+, LM)Dimensiones molecularesMD2-100-150Para la cristalización de pantalla fina de NEMO-EEAA
3,5 kDa MWCO Membrana de diálisisSpectra/Por132724Para la diálisis eliminación de imidazol
Amicon Stirred Cell MilliposeSigmaUFSC 05001Para la concentración de proteínas
Cloruro de amonioMillipore SigmaG8270Para el marcaje mínimo de medios
Benzonase nucleasaMillipore Sigma9025-65-4Para la digestión de ácido nucleico
BL21-CodonPlus (DE3)-RIL Células competentesAgilent TechnologiesModelo: 230245Expresión de TEV
CryoProHampton ResearchHR2-073Kit de crioprotectores
D-Glucosa (Dextrosa)Millipore SigmaA9434Para Etiquetado de medios mínimos
Difco Caldo EstréficoThermoFisherDF043817Para el crecimiento del cultivo
Dithiothreitol > 99%GoldbioDTT25Para la reducción de disulfuros
E. coli: Rosetta 2 (DE3)Novagen71400-3Expresión de NEMO-EEAA
FORMULATORFormulatrixsin etiquetar Manipulador de líquidos/constructor de pantallas
HCl & ndash; Solución de 1,0 MHampton ResearchHR2-581Para la cristalización de malla fina de NEMO-EEAA
HiLoad 16/600 Superdex 75 pgGE Healthcare 28989333Para la purificación por exclusión de tamaño
HisTrap HP Columna de 5 mLGE Healthcare17524802Para la purificación de NEMO-EEAA
HT 96 MIDASmarcados con His Dimensiones molecularesMD1-59Para el cribado de matriz dispersa de NEMO-EEAA
HT 96 DimensionesmolecularesMD1-46Para el cribado de matriz dispersa de NEMO-EEAA
ImidazolThermoFisher288-32-4Para elución de la columna His-trap
Isopropil-beta-D-tiogalactósidoGoldbioI2481C5Para la inducción de cultivos
Placa de cristalización MRC2 HamptonResearchHR3-083 Placa decristalización
NT8 - Incubadora de gotasFormulatrixCristalización
pET-16bMillipore Sigma69662Para la clonación de NEMO-EEAA
pET-45bMillipore Sigma71327Para la clonación de NEMO-EEAA
Fluoruro de fenilmetilsulfoniloThermoFisher36978Para la inhibición de proteasas
Botella de policarbonato para uso en rotor ultracentrífuga tipo 45 TiBeckmann Coulter339160Botella ultracentrífuga
Polietilenglicol 20,000Hampton ResearchHR2-609Para la cristalización de pantalla fina de NEMO-EEAA
pRK793 (TEV)AddgenePlasmid 8827Para la producción de TEV
QuikChange XL IIAgilent Technologies200522mutagénesis dirigida al sitio
Ensamblaje de tapas requerido:Beckmann Coulter355623Ultracenttrifuge Tapa de botella
ROCK IMAGERFormulatrix Cristalización Imager
Seed Bead KitHampton ResearchHR2-320 Generación desemillas
Cloruro de sodio ≥ 99%Millipore SigmaS9888Para la amortiguación de soluciones de purificación
TCEP (Clorhidrato de fosfina Tris (2-Carboxietilo)GoldbioTCEP1Agente reductor
The Berkeley ScreenRigakuMD15-BerekelyPara el cribado de matriz dispersa de NEMO-EEAA
The PGA ScreenMolecular DimensionsMD1-50Para la cristalización de cribado fino de NEMO-EEAA
Tris – Solución de 1,0 MHampton ResearchHR2-589Para la cristalización de pantalla fina de NEMO-EEAA
Ultrapure Tris Buffer (polvo Thermofisher15504020Para la amortiguación de soluciones de purificación
UreaThermoFisher29700Para la desnaturalización de NEMO-EEAA
morfas

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