Proporcionamos un protocolo para el aislamiento de la microglia de diferentes regiones diseccionadas de un hemisferio cerebral de ratón adulto, seguido de la preparación de la biblioteca semiautomática para la secuenciación profunda de ARN de una sola célula de transcriptomes de longitud completa. Este método ayudará a dilucidar la heterogeneidad funcional de la microglia en salud y enfermedad.
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Artículo de método
Aislamiento de microglia específica de la región del hemisferio cerebral de un ratón adulto para la secuenciación profunda del ARN de una sola célula
En este artículo
Resumen
Resumen
Como macrófagos residentes en el sistema nervioso central, la microglia controla activamente el desarrollo cerebral y la homeostasis, y sus disfunciones pueden impulsar enfermedades humanas. Se han realizado avances considerables para descubrir las firmas moleculares de la microglia homeostática, así como las alteraciones de su expresión génica en respuesta a los estímulos ambientales. Con el advenimiento y la maduración de metodologías genómicas de una sola célula, se reconoce cada vez más que la microglia heterogénea puede subyacen a las diversas funciones que desempeñan en diferentes condiciones de desarrollo y patológicas. La disección adicional de dicha heterogeneidad puede lograrse mediante el aislamiento eficiente de la microglia de una región determinada de interés, seguido de perfiles sensibles de células individuales. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para el aislamiento rápido de la microglia de diferentes regiones cerebrales en un solo hemisferio cerebral de ratón adulto. También demostramos cómo utilizar estas microglia ordenadas para la secuenciación de ARN de una sola célula profunda a base de placas. Discutimos la adaptabilidad de este método a otros escenarios y proporcionamos directrices para mejorar el sistema para adaptarse a estudios a gran escala.
Introducción
Microglia, que representa el 5% al 10% de todas las células neuronales, son macrófagos residentes dispersos por todo el sistema nervioso central (SNC)1. Protegida detrás de la barrera hematoencefálica, la microglia típica en un cerebro adulto sano contiene muchos procesos finos que se extienden y se retraen rápidamente para interactuar con las neuronas y otras células gliales en el parénquima. Microglia también puede adoptar la morfología amoeboides asociada con el aumento de la función fagocítica durante etapas específicas del desarrollo o ante los desafíos inmunológicos en lesiones y enfermedades1,
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Protocolo
Todos los procedimientos que involucran roedores se ajustan a las directrices de la Universidad de Stanford, que cumplen con las leyes y políticas nacionales y estatales. Todos los procedimientos de animales fueron aprobados por el Panel Administrativo de La Universidad de Stanford sobre Cuidado de Animales de Laboratorio.
NOTA: Todas las composiciones de solución y tampón se proporcionan en la Tabla de Materiales.
1. Preparación en el Día del Aislamiento Celular
- Preparar los siguientes reactivos y enfriarlos en hielo: medio A (50 ml), tampón de clasificación de células....
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Resultados
Este protocolo describe un método para aislar y clasificar la microglia de diferentes regiones cerebrales en un hemisferio cerebral perfundido adulto, seguido de scRNA-seq. Utilizamos la douncing para crear una suspensión de una sola célula y también como un primer paso para enriquecer la microglia. Insuficiente o excesivamente douncing reduce el rendimiento. Además, los cerebros adultos del ratón contienen altos niveles de mielina, que también pueden reducir la eficiencia de clasificación y el rendimiento si no se elimi.......
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Discusión
Microglia interactúa activamente con otros tipos de células en el SNC, y son muy sensibles a los estímulos ambientales. Con el fin de minimizar las respuestas inflamatorias y los cambios aberrantes en su expresión génica durante el proceso de aislamiento, este protocolo se ha simplificado a partir de un método publicado previamente9,y ahora es adecuado aislar la microglia de múltiples regiones de un solo hemisferio cerebral de ratón en paralelo. Los tejidos y reactivos se mantienen a temperatura f.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a Mariko L. Bennett, Liana Nicole Bonanno y Spyros Darmanis por su ayuda durante el desarrollo de este protocolo. También agradecemos el Stanford Shared FACS Facility, particularmente Meredith Weglarz y Lisa Nichols; Yen Tran, Michael Eckart de Stanford Protein y Nucleic Acid Facility (PAN) por su gran apoyo al rodaje. Este trabajo está financiado por la Fundación JPB y la Fundación Vincent J. Coates.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 5 M Betaína | Sigma-Aldrich | Cat# B0300-5VL | |
| 10 mM dNTP | mix Thermo Fisher Scientific | Cat# R0192 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15575020 | |
| 10X Hanks' Solución salina equilibrada | Thermo Fisher Scientific | Cat# 14185-052 | |
| 1 M HEPES | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15630080 | |
| 1X KAPA HIFI Hotstart Master Mix | Kapa Biosciences | Cat# KK2602 | |
| 5 mL Tubo de poliestireno de fondo redondo, con tapa de filtro de celdas | Corning | Cat# 352235 | |
| AATI, kit de análisis de fragmentos NGS de alta sensibilidad (1 bp – 6.000 pb) | Analítica Avanzada | Cat# DNF-474-1000 | |
| Albúmina Suero Bovino | Sigma Aldrich | Cat# A8806 | |
| DNasa I | Worthington | Cat# LS002007 | Solución de trabajo: 12500 unidades/ml |
| DTT, Grado Molecular | Promega | Cat# P1171 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Thermo Fisher Scientific | Cat# 4456740 | |
| Suero Fetal Bovino | Thermo Fisher Scientific | Cat# 10437-028 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set A (96 índices) | Illumina | Cat# FC-131-2001 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set B (96 índices) | Illumina | Cat# FC-131-2002 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set C (96 índices) | Illumina | Cat# FC-131-2003 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set D (96 índices) | Illumina | Cat# FC-131-2004 | |
| Lambda Exonucleasa (5 U/μ l) | New England BioLabs | Cat# M0262S | |
| Ratón Fc bloque | BD Pharmingen | Cat# 553142 | |
| Cuentas de eliminación de mielina | Miltenyl Biotec | Cat# 130-096-433 | |
| Nextera XT Kit de preparación de muestras de ADN | Illumina | Cat# FC-131-1096 | |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 ciclos) | Illumina | Cat# 20024907 | |
| PBS ( 10X), pH 7.4 | Thermo Fisher | Scientific Cat# 70011044 | |
| PCRClean DX perlas | Aline Biosciences | Cat# C-1003-50 | |
| Yoduro de propidio | Thermo Fisher Scientific | Cat# P3566 | Tinción: 1:1000 |
| Qubit dsDNA HS Kit de ensayo | Thermal Fisher Scientific | Cat# Q32851 | |
| Rata monoclonal anti ratón/humano CD11b, Violeta Brillante 421 (clon M1/70) | BioLegend | Gato# 101236; RRID: AB_11203704 | Tinción: 1:300 |
| Rata monoclonal anti ratón CD45, PE/Cy7 (clon 30-F11) | Thermo Fisher Scientific | Cat# 25-0451-82; RRID: AB_469625 | Tinción: |
| Inhibidor de RNasa recombinante | Takara Bio | Cat# 2313B | |
| SMARTScribe Transcriptasa inversa (100 U/μ l) | Clontech | Cat # 639538 | Contiene 5x tampón |
| >de primera cadena | |||
| 0.1 μ M ISPCR Oligo: 5' - AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGT-3' | (Picelli et al., 2014) | ||
| Oligo-dT30VN cebador: 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTACT 30 VN-3' | (Picelli et al., 2014) | ||
| TSO 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTACATrGrG+G-3' ("r" es para ribobases y "+" es para una base LNA) | 2014) | ||
| Solutions | |||
| FACS | Receta: 1% FBS filtrado estérilmente, 2 mM EDTA, 25 mM HEPES en 1X tampón | ||
| PBS MCS | Receta: 0,5% BSA filtrado estérilmente, 2 mM EDTA en 1X PBS | ||
| Medium A | Receta: 15 mM HEPES, 0,5% de glucosa en 1X HBSS sin fenol rojo | ||
| Placas | |||
| Microplacas de PCR Rigi-Plate de 384 pocillos, Axygen Scientific | VWR | 89005-556 | |
| Placas de PCR rígidas de 96 pocillos | Bio-Rad | HSP9631 | |
| Others | |||
| Pinzas Dumont #55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Homogeneizador de onzas, 2 ml | Wheaton | ||
| Columna de agotamiento | grande Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| Columna de selección grande | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Separador QuadroMACS | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RNAzap | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Colador (70 μ m) | Falcon | 352350 | |
| Equipo | |||
| BD FACSAria II | BD Biosciences | http://www.bdbiosciences.com/ | |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
| Analizador de fragmentos | Agilent | 5300 | |
| Mosquito HTS robot de pipeteo de nanolitros | TTP Labtech | https://www.ttplabtech.com/ | |
| Qubit 4 Fluorímetro | Thermo Fisher Scientific | Q33226 |
Referencias
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
- Li, Q., et al. Developmental Heterogeneity of Microglia and Brain Myeloid Cells Revealed by Deep Singl....
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Reimpresiones y permisos
