Aislamiento de células similares a tallos de cultivos esferoides tridimensionales

Resumen

Utilizando células epiteliales de próstata primarias humanas, informamos de un nuevo método libre de biomarcadores de caracterización funcional de células similares a tallos mediante un ensayo de retención de etiquetas basado en esferoides. Se describe un protocolo paso a paso para el etiquetado de celdas 2D BrdU, CFSE o Far Red; formación de esferoides tridimensionales; identificación celular similar a un tallo que retiene la etiqueta por inmunocitoquímica; y aislamiento por FACS.

Resumen

A pesar de los avances en la investigación con células madre adultas, la identificación y el aislamiento de células madre de muestras de tejido sigue siendo un desafío importante. Mientras que las células madre residentes están relativamente inactivas con restricciones de nicho en los tejidos adultos, entran en el ciclo celular en cultivo tridimensional (3D) libre de anclaje y se someten a división celular simétrica y asimétrica, dando lugar tanto al tallo como al progenitor Células. Estos últimos proliferan rápidamente y son la principal población celular en varias etapas del compromiso de linaje, formando esferoides heterogéneos. Usando células epiteliales humanas normales primarias (HPrEC), se desarrolló un ensayo de retención de etiquetas basado en esferoides que permite la identificación y el aislamiento funcional de las células madre que inician los esferoides a una sola resolución celular.

HPrEC o líneas celulares se cultivan bidimensionalmente (2D) con BrdU durante 10 días para permitir su incorporación al ADN de todas las células divisorias, incluidas las células madre auto-renuevas. El lavado comienza tras la transferencia al cultivo 3D durante 5 días, durante los cuales las células madre se autonuevan a través de la división asimétrica e inician la formación de esferoides. Mientras que las células madre hijas relativamente inactivas conservan el ADN parental etiquetado por BrdU, los progenitores hijas proliferan rápidamente, perdiendo la etiqueta BrdU. BrdU se puede sustituir por CFSE o Far Red pro-dyes, que permiten el aislamiento de células madre vivas por FACS. Las características de las células madre se confirman mediante la formación de esferoides in vitro, ensayos de regeneración de tejido in vivo y la documentación de sus divisiones celulares simétricas/asimétricas. Las células madre aisladas que retienen etiquetas pueden ser interrogadas rigurosamente por estudios moleculares y biológicos aguas abajo, incluyendo ARN-seq, ChIP-seq, captura de células únicas, actividad metabólica, perfilado de proteome, inmunocitoquímica, formación de organoides y regeneración de tejido in vivo. Es importante destacar que este enfoque de aislamiento funcional de células madre sin marcadores identifica células similares a los tallos de muestras de cáncer fresco y líneas celulares cancerosas de múltiples órganos, lo que sugiere una amplia aplicabilidad. Se puede utilizar para identificar biomarcadores celulares similares a los tallos del cáncer, productos farmacéuticos de la pantalla dirigidos a células similares a los tallos del cáncer, y descubrir nuevas dianas terapéuticas en los cánceres.

Introducción

La glándula prostática humana contiene epitelio luminal con función secretora y células basales subyacentes junto con un componente inusual de la célula neuroendocrina. Las células epiteliales, en este caso, se generan a partir de una población rara de células madre prostáticas que están relativamente inactivas in vivo y actúan como un sistema de reparación para mantener la homeostasis glandular durante toda la vida¹. A pesar de muchos avances, la identificación y el aislamiento funcional de las células madre prostáticas sigue siendo un desafío importante en el campo. Los biomarcadores de células madre, incluidas las metodologías basadas en mar....

Protocolo

Todas las preparaciones de manipulación celular y medios deben realizarse con técnica aséptica en un gabinete de seguridad biológica de clase II (BSC).

1. Cultivo y mantenimiento de células HPrEC en 2D

1. Recubrir platos de cultivo de 100 mm con 2 ml de solución de fibronectina de 2,5 g/cm² durante la noche a temperatura ambiente (RT). Aspirar la solución y dejar que los platos de cultivo se sequen al aire en el BSC durante 45 minutos.
2. Añadir 9 ml del medio de crecimiento de células epiteliales de próstata (p. ej., PrEGM) a un plato de cultivo de 100 mm recubierto de fibronectina y mantener el plato caliente en u....

Resultados

Las células epiteliales humanas normales primarias se colocan en platos de cultivo recubiertos de fibronectina y el crecimiento celular se mantiene en el cultivo 2D(Figura 1a). Tras la transferencia al cultivo 3D con una matriz de membrana de sótano, las células epiteliales diferenciadas mueren lentamente. Sólo las células madre de próstata pueden sobrevivir en un cultivo libre de anclas y formar esferoides en 5 días(Figura 1b)........

Discusión

La citometría de flujo utilizando múltiples marcadores de superficie de células madre es un enfoque comúnmente utilizado para la investigación de células madre a pesar de carecer de especificidad y selectividad^1,5,6. Mientras que la formación de esferoides en un sistema de cultivo 3D es otro método útil para enriquecer la población rara de células madre de células epiteliales primarias, incluyendo HPrEC, los esferoides resultant.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,05% Tripsina-EDTA	Gibco	25300-054
Jeringas de tuberculina de 1 mL	Bectin Dickinson	BD 309625
tubos de microcentrífuga de 1,5 mL, placas de cultivo estériles
100 mm	Corning/Falcon
placa de cultivo de 12 pocillos	Centrífuga Corning/Falcon	353043
de 15 mL tubos	Corning/Falcon	352097
22 x 22 mm cubreobjetos, cuadrado	Corning	284522	para MatTek Plato de cultivo de 35 mm
24 cubreobjetos de 50 mm	Corning	2975245
aguja hipodérmica de 26G x 1,5 pulgadas	Monoject	1188826112
2N HCl
Plato de cultivo de 35 mm con fondo de vidrio cubierta	MatTek Corp	P35G-0-10-C Fondo de	vidrio Nº 0, sin recubrimiento, irradiado
40 µ m colador de células de nylon poro	Corning	352340
5% CO2 incubadora de cultivo, 37 ° Tubos
50 mL Corning	/Falcon	352098
Tubo de fondo redondo de poliestireno de 5 ml con tapón a presión de filtro	Corning	352235	35 y micro; m malla de nylon
Placas de cultivo de 6 pocillos	Corning	353046
portaobjetos de cámara de 8 pocillos	Millipore Sigma	PEZGS0816
Medio de montaje acuoso que contiene DAPI	Vector Laboratories Colorante	fluorescente nuclear	H-1200
Cabina de seguridad biológica, certificado
BrdU de nivel 2 (5-bromo-2'-desoxiuridina)	Sigma-Aldrich	B5002	Solución madre de 1 mM en centrífuga DMSO
para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL	Centrífuga Eppendorf
para tubos de 15 mL	Beckman Coulter		Allegra 6
CFSE (éster de carboxifluoresceína succinimidilo)	Thermo Fisher Scientific	C34554	Solución madre de 5 mM en
citocalasina D	Thermo Fisher Scientific
Dispasa 1U/mL	StemCell Technologies	07923
FACS CellSorter MoFlo XDP	Beckman Coulter	s
Far-Red pro-dye	Thermo Fisher	C34564	5 mM solución madre en DMSO
Fetal Bovine Serum (FBS)
Fibronectina	Sigma-Aldrich	F0895	Para el recubrimiento de placas de cultivo de 100 mm
Microscopio fluorescente con cámara digital a color	Carl Zeiss		Microscopio fluorescente Axioskop 20; Axiocamera digital a color
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Anticuerpo secundario altamente adsorbido cruzado, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher	A-11029
HPrEC (Células epiteliales de próstata humana normales primarias)	Lifeline Cell Technology	FC-0038	Agrupados por 3 donantes de órganos jóvenes (19-21 años) libres de enfermedad; 1 x 105 células/mL; almacenado en nitrógeno líquido
cubitera y hielo
Microsope invertido con cámara
Matrigel, factor de crecimiento bajo, libre de rojo	fenol Corning	356239
Metanol	Corning	A452-4
Anticuerpo anti-BrdU de ratón	Señalización celular	5292S
Anticuerpo IgG de ratón ( control negativo)	Santa Cruz Biotechnology	sc-2025
Suero de cabra normal	Vector Laboratories	S-1000
Solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7.4	Sigma-Aldrich	P5368-10PAK
Pipettores y puntas, varios tamaños
PrEGM (ProstaLife Epithelial Cell Growth Medium)	Lifeline Cell Technology	LL-0041
Yoduro de propidio (PI)	R & D Sistemas	5135/10	10 μ g/mL PI en PBS almacenado a 4 & grados; C en la oscuridad
Pipetas serológicas, varios tamaños
Software para el conteo de esferas y mediciones de
Software: Imágenes 3D con Imaris un software de imágenes con capacidades
Triton X-100	Millipore Sigma	T8787
Baño de agua, 37 ° Imágenes
de pila C z utilizando un microscopio

de 353003 de centrífuga C Forma A DMSO PHZ1063digitaltamañode dibujo de forma libre confocal fluorescente invertido de luz transmitida