Inducir la epilepsia postraumática en un modelo de ratón de lesión cerebral traumática difusa repetitiva

Summary

Este protocolo sistemático describe un nuevo modelo animal de epilepsia postraumática después de una lesión cerebral traumática leve repetitiva. La primera parte detalla los pasos para la inducción de lesiones cerebrales traumáticas usando un modelo de caída de peso modificado. La segunda parte proporciona instrucciones sobre el enfoque quirúrgico para sistemas de adquisición de datos electroencefalográficos monocanal y multicanal.

Abstract

La lesión cerebral traumática (TBI) es una de las principales causas de epilepsia adquirida. La TBI puede resultar en una lesión cerebral focal o difusa. La lesión focal es el resultado de fuerzas mecánicas directas, a veces penetrando a través del cráneo, creando una lesión directa en el tejido cerebral. Estos son visibles durante las imágenes cerebrales como áreas con contusión, laceración y hemorragia. Las lesiones focales inducen la muerte neuronal y la formación de cicatrices gliales y están presentes en el 20% a 25% de todas las personas que incurren en un TBI. Sin embargo, en la mayoría de los casos de TBI, las lesiones son causadas por fuerzas de aceleración-desaceleración y posterior cizallamiento tisular, lo que resulta en daño difuso no focal. Una subpoblación de pacientes con TBI continúa desarrollando epilepsia postraumática (TEP) después de un período de latencia de meses o años. Actualmente, es imposible predecir qué pacientes desarrollarán TEP, y las convulsiones en pacientes con TEP son difíciles de controlar, lo que requiere más investigación. Hasta hace poco, el campo se limitaba a sólo dos modelos animales/roedores con convulsiones post-traumáticas espontáneas validadas, ambos presentando grandes lesiones focales con pérdida masiva de tejido en la corteza y a veces estructuras subcorticales. A diferencia de estos enfoques, se determinó que la TBI difusa inducida mediante un modelo de caída de peso modificado es suficiente para iniciar el desarrollo de convulsiones convulsivas y no convulsivas espontáneas, incluso en ausencia de lesiones focales o pérdida de tejido. Al igual que los pacientes humanos con epilepsia postraumática adquirida, este modelo presenta un período de latencia después de la lesión antes de la aparición de la convulsión. En este protocolo, la comunidad recibirá un nuevo modelo de epilepsia postraumática, detallando cómo inducir TBI difuso no lesional seguido de monitoreo continuo de animales videoelectroencefalográficos a largo plazo en el transcurso de varios meses. Este protocolo detallará el manejo de animales, el procedimiento de caída de peso, la colocación de electrodos para dos sistemas de adquisición y los desafíos frecuentes encontrados durante cada uno de los pasos de la cirugía, el monitoreo postoperatorio y la adquisición de datos.

Introduction

Cada año, TBI afecta a unos 60 millones de personas en todo el mundo. Las personas afectadas tienen un mayor riesgo de desarrollar epilepsia, que puede manifestarse años después de la lesión inicial. Aunque los TBI graves se asocian con un mayor riesgo de epilepsia, incluso la TBI leve aumenta la probabilidad de que un individuo desarrolle epilepsia^1,2,3,4. Todos los TBI se pueden clasificar como focales, difusos o una combinación de ambos. La lesión cerebral difusa, presente en muchos TMI, si no en todos, es el resultado de tejidos cerebrales de diferentes densidades que se cortan entre sí debido a la desaceleración de la aceleración y las fuerzas de rotación. Por definición, la lesión difusa sólo se produce de forma aislada en lesiones cerebrales leves/concusivas no penetrantes, en las que no se pueden ver lesiones cerebrales en las exploraciones por tomografía computarizada⁵.

Actualmente hay dos problemas críticos en el manejo de pacientes que tienen, o están en riesgo de, desarrollar epilepsia post-traumática (TEP). La primera es que una vez que la ETE se ha manifestado, las convulsiones son resistentes a los medicamentos antiepilépticos disponibles (DeA)⁶. En segundo lugar, los DEA son igualmente ineficaces para prevenir la epileptogénesis, y no existen enfoques terapéuticos alternativos eficaces. Para hacer frente a este déficit y encontrar mejores dianas terapéuticas y candidatos para el tratamiento, será necesario explorar nuevos mecanismos celulares y moleculares en la raíz de PTE^6.

Una de las características destacadas de la epilepsia postraumática es el período latente entre el evento traumático inicial y la aparición de convulsiones espontáneas, no provocadas y recurrentes. Los eventos que ocurren dentro de esta ventana temporal son un foco natural para los investigadores, ya que esta ventana de tiempo podría permitir el tratamiento y la prevención de la ETE por completo. Los modelos animales se utilizan más comúnmente para esta investigación porque ofrecen varios beneficios distintos, no menos importante de los cuales es que el monitoreo continuo de pacientes humanos sería a la vez poco práctico y costoso en tales períodos potencialmente largos de tiempo. Además, los mecanismos celulares y moleculares en la raíz de la epileptogénesis sólo se pueden explorar en modelos animales.

Se prefieren modelos animales con convulsiones postraumáticas espontáneas y epilepsia sobre los modelos en los que las convulsiones son inducidas después de TBI por medios menos relevantes fisiológicamente, como por chemoconvulsantes o estimulación eléctrica aguda, crónica o por leña. Los modelos espontáneos de convulsiones postraummáticas prueban cómo TBI modifica la red cerebral saludable que conduce a la epileptogénesis. Los estudios con estimulación adicional después de tAT evalúan cómo la exposición a TBI reduce el umbral de convulsiones y afecta la susceptibilidad a las convulsiones. Las ventajas de los modelos animales con convulsiones inducidas químicamente o con estimulación eléctrica están en el ensayo de los mecanismos específicos de refractoridad a los DEA y la eficacia de los DEA existentes y nuevos. Sin embargo, el grado de pertinencia y traducción de estos datos a los seres humanos puede ser ambiguo⁷ debido a lo siguiente: 1) los mecanismos de incautación pueden ser diferentes de los inducidos por TBI por sí solo; 2) no todos estos modelos conducen a convulsiones espontáneas⁷; 3) las lesiones creadas por el propio agente convulsivo, con la cánula necesaria para su parto, o estimulando la colocación de electrodos en estructuras de profundidad (por ejemplo, el hipocampo o la amígdala) ya pueden causar un aumento de la susceptibilidad a las convulsiones e incluso potenciales de campo epilepciforme del hipocampo^7. Además, algunos agentes convulsivos (es decir, ácido kainic) producen lesiones y esclerosis directas del hipocampo, que no es típica después de la TBI difusa.

Hasta hace poco, sólo existían dos modelos animales de epilepsia postraumática: impacto cortical controlado (CCI, focal) o lesión por percusión fluida (FPI, focal y difusa)⁸. Ambos modelos resultan en lesiones focales grandes junto con pérdida de tejido, hemorragia y gliosis en roedores^8. Estos modelos imitan la epilepsia postraumática inducida por lesiones focales grandes. Un estudio reciente demostró que el TBI difuso repetido (3x) es suficiente para el desarrollo de convulsiones espontáneas y epilepsia en ratones, incluso en ausencia de lesiones focales^9,añadiendo un tercer modelo de ETE de roedores con convulsiones recurrentes espontáneas confirmadas. Este nuevo modelo imita los cambios celulares y moleculares inducidos por la TBI difusa, representando mejor a la población humana con TMI leves y conmovedores. En este modelo, el período latente de tres semanas o más antes de la aparición de la convulsión y la aparición de convulsiones tardías, espontáneas y recurrentes permite investigar las causas profundas de la epileptogénesis postraumática, probar la eficacia de los enfoques preventivos y los nuevos candidatos terapéuticos después de la aparición de la convulsión, y tiene potencial para el desarrollo de biomarcadores de epileptogénesis postraumática porque aproximadamente la mitad de los animales desarrollan epilepsia postraumática.

La elección del modelo animal para el estudio de la epilepsia postraumática depende de la cuestión científica, el tipo de lesión cerebral investigada y qué herramientas se utilizarán para determinar los mecanismos celulares y moleculares subyacentes. En última instancia, cualquier modelo de epilepsia postraumática debe demostrar tanto la aparición de convulsiones espontáneas después de TBI como un período de latencia inicial en un subconjunto de animales TBI, porque no todos los pacientes que incurren en un TBI van a desarrollar epilepsia. Para ello, en este protocolo se utiliza la electroencefalografía (EEG) con adquisición simultánea de vídeo. Comprender los aspectos técnicos detrás del hardware y los enfoques de adquisición de datos es fundamental para una interpretación precisa de los datos. Los aspectos críticos del hardware incluyen el tipo de sistema de grabación, el tipo de electrodos (tornillo o cable de alambre) y el material del que están hechos, la adquisición de vídeo sincronizado (como parte del sistema EEG o de terceros) y las propiedades del sistema informático. Es imperativo establecer los parámetros de adquisición adecuados en cualquier tipo de sistema dependiendo del objetivo del estudio, eventos EEG de interés, método de análisis adicional y sostenibilidad del almacenamiento de datos. Por último, debe tenerse en cuenta el método de configuración de electrodos (montaje), ya que cada uno tiene ventajas y desventajas y afectará a la interpretación de los datos.

Este protocolo detalla cómo utilizar el modelo de caída de peso Marmarou modificado^10,11 para inducir lesiones difusas que resultan en convulsiones espontáneas, no provocadas y recurrentes en ratones, describe enfoques quirúrgicos para adquirir un EEG de vídeo continuo y multicanal y multicanal mediante montaje monopolar, bipolar o mixto.

Protocol

Todos los procedimientos animales descritos en este protocolo se realizaron de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de Virginia Tech y de conformidad con la "Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio" de los Institutos Nacionales de Salud .

1. Protocolo de manipulación de animales

NOTA: Este protocolo está destinado a habituar los animales ordenados de un vendedor a la instalación después de la llegada y condicionarlos a ser manejados por el experimentador. Esto mejora el bienestar animal al reducir el estrés y la ansiedad y simplifica ciertos procedimientos que requieren el manejo de animales, incluyendo la inducción del TBI, la supervisión postoperatoria y la conexión del animal al sistema de adquisición.

1. Cuando muchos animales son recibidos del vendedor, etiqueta de oído y asignarlos al azar a un grupo experimental (TBI) o grupo de control (cirugía falsa) mientras los combina en jaulas de 2 a 5 animales. Los animales de la casa TBI por separado de los animales falsos porque los ratones falsos ocasionalmente actúan agresivamente hacia los ratones que se sometieron a TBI.
2. Manejo del día 1 (24-48 h después del etiquetado del oído): Prepare un gráfico para registrar las etiquetas del oído de los animales, la fecha de nacimiento, las fechas de manipulación, el peso del animal en los días de manipulación, la duración de la manipulación y una sección para comentarios y observaciones.
3. Póntelo suavemente con ambas manos. No agarre al animal por la cola, ya que induce mecanismos de defensa y una respuesta de tensión.
4. Compruebe y registre la etiqueta del animal.
5. Coloque el animal en el recipiente en la báscula de pesas y registre el peso.
6. Póntelo suavemente con ambas manos de nuevo y manéjalo durante 1 min, lo que le permite moverse y explorar dentro de las manos. Realice esto sobre un banco en la sala de procedimientos y tenga cuidado de no dejar caer al animal en el suelo.
7. Después de 1 minuto de manipulación, coloque el animal de nuevo en su jaula.
8. Repita los pasos 1.3-1.7 para los demás animales de la jaula.
9. Manejo del día 2 (al día siguiente): Repita los pasos 1.2-1.5.
10. Póntelo suavemente con ambas manos de nuevo y manéjalo durante 2 minutos, lo que le permite moverse y explorar dentro de las manos. Realice esto sobre un banco en la sala de procedimientos y tenga cuidado de no dejar caer al animal en el suelo.
11. Después de 2 minutos de manejo, coloque el animal de nuevo en su jaula.
12. Repita los pasos 1.10-1.11 para los demás animales de la jaula.
13. Manejo del día 3 (al día siguiente): Repita los pasos 1.2-1.5.
14. Póntelo suavemente con ambas manos de nuevo y manéjalo durante 4 minutos, lo que le permite moverse y explorar dentro de las manos. Realice esto sobre un banco en la sala de procedimientos y tenga cuidado de no dejar caer al animal en el suelo.
15. Después de 4 minutos de manejo, coloque el animal de nuevo en su jaula.
16. Repita los pasos 1.14-1.15 para los demás animales de la jaula.
17. Manejo del día 4 (día de control, 1 semana desde el día de manipulación 1): Repita los pasos 1.2-1.5.
18. Póntelo suavemente con ambas manos de nuevo y manéjalo durante 4 minutos, lo que le permite moverse y explorar dentro de las manos. Realice esto sobre un banco en la sala de procedimientos y tenga cuidado de no dejar caer al animal en el suelo.
19. Después de 4 minutos de manejo, coloque el animal de nuevo en su jaula.
20. Repita los pasos 1.18-1.19 para los otros animales de la jaula.
    NOTA: El día de manejo del control prueba la retención del comportamiento tranquilo después de un protocolo de manejo de tres días.

2. Procedimiento de caída de peso

1. Coloque el ratón en una cámara de inducción. Fije el flujo de oxígeno y vacío tanto a 1 L/min como al nivel de gas isoflurano en 3%-5%. Anestetizar el ratón durante 5 min.
2. Retire el ratón de la cámara de inducción y colóquelo en una almohadilla de espuma. Pruebe la ausencia de una respuesta a un pellizco de dedo del dedo del dedo del dodel o de la cola.
3. Administrar un analgésico (0,1 mg/kg de buprenorfina) por vía subcutánea. Si la cirugía de EEG se realiza ese mismo día, administre la buprenorfina por vía subcutánea en combinación con el carprofeno antiinflamatorio no esteroideo (5 mg/kg).
4. Administrar la solución de lactato de sodio (3 ml por gramo del peso del animal) por vía subcutánea antes o después del último impacto. La solución de lactato de sodio se puede mezclar con los analgésicos para una administración rápida en una sola inyección.
   NOTA: La solución de lactato de sodio contiene una mezcla de cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio y lactato de sodio en agua. Este paso ayuda a reemplazar fluidos y electrolitos, ayudando a la recuperación.
5. Coloque la cabeza del ratón debajo del tubo de caída de peso(Figura 1A)y coloque un disco plano de acero inoxidable (1,3 cm de diámetro, 1 mm de espesor y 880 mg de peso) en el centro de la cabeza, entre la línea de los ojos y las orejas.
   NOTA: Este disco difunde el impacto a través de la superficie del cráneo(Figura 1B).
6. Retire el pasador en el tubo de caída de peso para liberar la varilla de peso de 100 g de una altura de 50 cm. Para inducir la lesión falsa para los ratones de control, retire la varilla de peso del tubo para evitar la liberación accidental del pasador y la caída de peso.
   NOTA: La cabeza del animal debe colocarse plana, de modo que la varilla caiga en toda la superficie del disco.
7. Coloque al animal inconsciente en su espalda para su recuperación en una almohadilla de calentamiento cubierta con una toalla absorbente poliforada estéril. El tiempo de recuperación del reflejo correcto (es decir, el tiempo que tarda el ratón en enderedarse desde su espalda) se puede medir como una lectura del tiempo que pasa inconsciente.
8. Cuando el animal recupere la conciencia, colóquelo en una jaula limpia que haya sido calentada en una almohadilla de calentamiento, con gel de recuperación y algunas piezas de comida humedecida para recuperarse durante 45 minutos. Asegúrese de que haya suficiente basura para que la jaula no se sobrecaliente. Sobrecalentamiento del animal puede resultar un obstáculo tan grande para la recuperación como permitir que el ratón se enfríe demasiado.
9. Después de 45 min, repita los pasos 2.1-2.8 dos veces, omitiendo el paso 2.3 (es decir, la administración de analgésicos y antiinflamatorios).
10. Permita que los animales se recuperen durante 1 x 2 h si se realiza una cirugía de implantación de electrodos EEG el mismo día.

3. Preparación quirúrgica de campo para la implantación de electrodos EEG

NOTA: Autoclave las herramientas quirúrgicas y tornillos antes de la cirugía. Limpie los guantes quirúrgicos rociando y frotando con 70% de etanol antes y después de tocar al animal, materiales no estériles, y entre el manejo de los animales. Esterilice las herramientas quirúrgicas durante 2 x 3 minutos en el esterilizador de cuentas (ver Tabla de Materiales)entre animales. Cambie la cortina estéril antes de colocar un nuevo animal en el aparato estereotáctico. Asegúrese de que el campo quirúrgico contiene todos los componentes necesarios para la cirugía(Figura 2). La ausencia de un procedimiento quirúrgico invasivo para inducir el TBI en este modelo tiene varias ventajas: 1) la implantación de los electrodos es flexible y se puede realizar el mismo día que TBI o después de un período de tiempo definido; 2) el tiempo de recuperación del animal es más rápido; 3) el cráneo permanece intacto, lo que permite una mayor superficie y flexibilidad para implantar electrodos.

1. Anestetizar el ratón en 3% - 5% de gas isoflurano en una cámara de inducción durante 5 min.
2. Transfiera el ratón de la cámara de inducción al aparato estereotáctico y colóquelo en una cortina estéril en una almohadilla de calentamiento con gas isoflurano y tubos de vacío conectados al cono de la nariz.
3. Mantener la temperatura corporal a 37 oC en el transcurso de la cirugía. Coloque el sensor de temperatura para que entre en contacto con el pecho o la pared abdominal del ratón.
4. Fije la cabeza del animal en su lugar usando las barras de la oreja.
5. Mantener la anestesia en 1.5%-3.5% isoflurano o en 60 respiraciones/min en el plano quirúrgico (sin respuesta al pellizco de la dedo del día o la cola).
6. Aplique una pomada en los ojos del animal para mantenerlos lubricados durante toda la cirugía.
7. Administrar una mezcla de analgésicos (0,1 mg/kg de buprenorfina) y el fármaco antiinflamatorio no esteroideo (5 mg/kg de carprofeno) en una sola inyección por vía subcutánea a menos que el TBI se haya realizado antes durante el día, en cuyo caso el animal ya recibió analgésicos y antiinflamatorios.
   NOTA: La buprenorfina debe administrarse de nuevo si el tiempo entre la primera cirugía de colocación de TBI y EEG supera los 8 h o si el animal presenta signos de dolor 8 h después de la primera administración, pero debe administrarse sin la adición de carprofeno.
8. Administrar la solución de lactato sódico (3 ml por gramo del peso del animal) por vía subcutánea para reemplazar líquidos y electrolitos en el animal.
   NOTA: Si la cirugía se realiza inmediatamente después del TBI, este paso tiene que ser cronometrado correctamente. La solución de lactato de sodio se debe administrar cada 2 h mientras el animal se somete a los procedimientos y una vez después de la cirugía, 2 h de la inyección previa.
9. Retire el cabello del cuero cabelludo con una crema para depilación.
10. Antes de hacer la incisión, desinfectar la piel del cuero cabelludo con solución antiséptica quirúrgica de povidona-yodo y 70% de etanol en hisopos alternos con gasas estériles en un movimiento circular 3x (20 s por solución cada vez).
11. Usando un bisturí, haz una incisión rostral-caudal en la línea media del cuero cabelludo desde justo por encima de los ojos hasta la parte posterior de la cabeza. Este método de apertura del cuero cabelludo se prefiere sobre cortar el cuero cabelludo, ya que las aletas de la piel se pueden sellar sobre o alrededor de la tapa EEG proporcionando más estabilidad.
    NOTA: Al preparar el cráneo para la implantación de la culata 3-EEG, se requiere cortar el cuero cabelludo, ya que el tamaño del soporte para la cabeza no permitirá el cierre de las aletas de la piel sobre el soporte para la cabeza.
12. Expanda el área de incisión aplicando pequeños hemostats en los bordes abiertos de la piel. Si se produce algún sangrado después de la incisión, límpielo con una gasa o hisopo de algodón estéril.
13. Retire suavemente el periosteo (es decir, la membrana delgada sobre el hueso craneal) con una cuchilla de bisturí. Si se produce algún sangrado durante este paso, presione en el sitio de sangrado con un hisopo de algodón estéril hasta que se detenga.
14. Use hisopos de algodón estériles para limpiar el cráneo con peróxido de hidrógeno, pero evite tocar el tejido blando que rodea el área craneal expuesta. Repita este paso hasta que el cráneo se limpie de cualquier tejido blando y tenga un aspecto blanquecino.
15. Seque el cráneo con una gasa estéril o un hisopo de algodón.
    NOTA: Los pasos 3.12 a 3.15 son importantes para la fijación adecuada de los electrodos y el cemento dental. Cualquier tejido blando, sangrado no cauterizado y escombros pueden causar infección, fijación inestable de la suma de la cabeza, señal distorsionada o ausente, y pérdida del implante dentro de varios días o semanas después de la cirugía.

4. Colocación de electrodos

1. Implante el único soporte para la cabeza del canal EEG (1EEG).
   NOTA: Las abreviaturas en las coordenadas estereotácticas representan relaciones espaciales y especifican la distancia en milímetros del objetivo desde el bregma en una orientación dada en la cabeza del animal: anterior-posterior (AP) y medial-lateral (ML). Dorsal-ventral no es aplicable en este protocolo porque todos los electrodos se colocan en el espacio epidural en lugar de en una cierta estructura dentro del cerebro (Figura 3). Vin+ es un electrodo activo y Vin- es su electrodo de referencia.
   1. Utilice un taladro de alta velocidad con una broca de acero (0,5 mm, redondo, 1/4 pulg.) a 5.000 a 6.000 cartuchos por minuto (rpm) para crear seis orificios de rebaba (tres para tornillos de estabilidad y tres para electrodos) utilizando las coordenadas estereotácticas proporcionadas¹². Para los dos tornillos anteriores: AP + 1,5 mm, ML a 1,5 mm; para el tornillo posterior: AP -5,2 mm, ML -1,5 mm; para el electrodo de tierra: AP -5,2 mm, ML a +1,5 mm; para los electrodos de grabación: AP -2,3 mm, ML a 2,7 mm, con Vin+ a la derecha y Vin- a la izquierda.
   2. Añadir tres tornillos para una mayor estabilidad de la etapa de la cabeza. Con un destornillador, gire los tornillos de 1 x 1,5 x cada uno para que se fijen de forma estable en el cráneo.
      NOTA: Colocar los tornillos más profundo dañará el cerebro.
   3. Inserte el soporte de cabeza 1EEG en un brazo de soporte estereotáctico y coloque el soporte para la cabeza de modo que los tres electrodos se encuentren a lo largo de la línea media craneal. En esta configuración, el electrodo de tierra y su respectiva abertura en la parte superior del soporte de cabeza está en la parte posterior, el electrodo Vin+ en el centro y el electrodo Vin- en la parte delantera. Se puede hacer una marca en el soporte para la cabeza con un marcador permanente.
   4. Doble cada electrodo 90o de modo que el extremo de cada cable se incline hacia abajo y se coloque por encima del orificio de rebaba correspondiente. A continuación, mida la longitud de 1 mm de la parte del cable que ahora es perpendicular al orificio de rebaba y recorte el exceso(Figura 3). Esto asegurará la colocación epidural de los electrodos. Los electrodos apenas deben tocar la superficie de la dura mater.
   5. Baje el soporte para la cabeza y ajuste los tres electrodos para que coincidan con el orificio de rebaba respectivo. Para la grabación epidural, los electrodos deben colocarse por encima o apenas tocar la dura mater.
   6. Preparar cemento dental para su aplicación mezclando una cucharada de polvo con varias gotas de disolvente. Use una espátula de mezcla y revuelva hasta que la mezcla final sea similar a una, pegajosa pero maleable, y lo suficientemente rígida como para condensarse adecuadamente cuando se coloque sobre el cráneo del animal.
   7. Aplique la mezcla de cemento dental cubriendo todos los tornillos y electrodos y espere 3 x 5 minutos para que se solidifique. Asegúrese de no cubrir el pedestal de plástico con cemento dental, ya que hará imposible conectar al animal con el conmutador con una atada.
   8. Suelte los hemostats que sostienen las aletas de la piel y cierre la incisión conectando las aletas de la piel alrededor del pedestal de plástico. Aplique varias gotas de adhesivo tisular (ver Tabla de Materiales)para sellar las aletas de la piel.
   9. Aplique antiséptico de clorhexidina en el área alrededor del implante para evitar la infección. Si el animal está bajo anestesia durante más de 2 horas después de la inyección previa de solución de lactato sódico, administrada durante la inducción de TBI, administre otra inyección por vía subcutánea. Para mantener una hidratación adecuada del animal, repita la inyección cada 2 h que el animal pasa bajo anestesia.
   10. Después de la cirugía, administrar una inyección final de solución de lactato sódico 2 h después de la inyección anterior. Si la cirugía es inferior a 2 h de largo, administre la dosis final de recuperación de la solución de lactato de sodio 2 h de la primera inyección.
   11. Retire al animal del aparato estereotáctico y mida el peso del animal después de la cirugía de EEG como referencia para el monitoreo futuro. Debido al implante, el peso del animal será mayor que antes de la cirugía.
   12. Coloque el animal en una jaula limpia en una almohadilla de calentamiento caliente para su recuperación.
2. Implante los dos canales EEG y uno EMG (2EEG/1EMG) para el montaje en cabeza.
   1. Utilice el bregma como punto de referencia para la colocación del soporte para la cabeza. Aplique una pequeña cantidad de adhesivo tisú (ver Tabla de materiales)en la parte inferior del soporte para cabeza 2EEG/1EMG, evitando los cuatro orificios de tornillo y coloque el soporte para cabeza 2EEG/1EMG en la superficie del cráneo.
      NOTA: No hay coordenadas específicas para la colocación de este soporte para la cabeza. El soporte para cabeza es de 8 mm de largo y 5 mm de ancho, que cubre la mayor parte de la superficie craneal. La colocación del soporte de la cabeza con su borde frontal de 3,0 mm antes del bregma es óptima y proporciona una buena calidad de la señal. La colocación manual rápida es necesaria antes de que se cure la gota de adhesivo tisular. Deje esperar aproximadamente 5 minutos para que el pegamento tisular se cure por completo.
   2. Utilice una aguja estéril de 23 G para crear orificios piloto para los tornillos a través de las cuatro aberturas en el soporte para la cabeza. Para lograr esto, empuje suavemente la aguja y gire lentamente hasta que la punta de la aguja penetre en el cráneo sin dañar el cerebro. Retire cualquier sangrado de los orificios piloto con un hisopo de algodón estéril.
   3. Inserte el 0,10 en los tornillos de los orificios piloto y gírelos hasta que cada uno esté fijado en el cráneo. Esto puede ser hasta la mitad de la longitud del tornillo, pero no la longitud completa, ya que esto dañaría la dura mater y la corteza. Si el soporte de cabeza está colocado de modo que haya un espacio entre la superficie del cráneo y el extremo posterior del soporte para la cabeza, utilice dos tornillos 0,12 en la parte posterior.
   4. Haga una pequeña abertura en los lados de la bolsa de doble paquete epoxi de dos componentes (plata-epoxi). Toma una espátula de doble cara y usa cada lado para sacar una cantidad pequeña e igual de cada componente de la bolsa y mezclarlos. Utilice sólo una pequeña cantidad suficiente para una sola cirugía, ya que la mezcla se solidifica dentro de 20 min. Selle los lados de la bolsa para evitar el secado.
      NOTA: El epoxi plateado permite un contacto eléctrico adecuado entre el tornillo y el soporte para la cabeza y mejora la estabilidad de los tornillos.
   5. Aplique una pequeña cantidad de esta mezcla entre el cabezal de tornillo y el orificio del tornillo, luego apriete cada tornillo hasta que su cabeza se apoye en la base del implante. Asegúrese de que no haya plata-epoxi haciendo contacto entre los dos tornillos porque cada tornillo sirve como un electrodo individual y, para asegurar una señal precisa, no debe hacer contacto con el otro tornillo.
   6. Si la mezcla de plata y epoxi se extravío, hay una ventana de tiempo de un segundo para sacar cuidadosamente el exceso para separar la conexión. Dobla cuidadosamente ambos cables EMG desde el borde posterior del soporte para la cabeza para seguir el contorno de la cabeza y el cuello del animal, y luego insertarlos en los músculos nucales.
   7. Preparar cemento dental para su aplicación mezclando una cucharada de polvo con varias gotas de disolvente. Use una espátula de mezcla y revuelva hasta que la mezcla final sea similar a una, pegajosa pero maleable, y lo suficientemente rígida como para condensarse adecuadamente cuando se coloque sobre el cráneo del animal.
   8. Aplique la mezcla de cemento dental que cubra todo el soporte para la cabeza evitando cubrir los seis orificios de los pines, ya que esto hará imposible conectar el preamplificador. Espere 3 x 5 minutos para que el cemento se solidifique. Asegúrese de que la piel no esté sellada al soporte para la cabeza con cemento dental.
   9. Suelte los hemostats que sostienen las aletas de la piel y cierre la incisión conectando las aletas de la piel alrededor del pedestal de plástico. Aplique varias gotas de adhesivo tisular para sellar las aletas de la piel.
      NOTA: Si la incisión cutánea se hizo más tiempo para permitir el enderezamiento de los cables EMG, la piel se puede sellar con adhesivo tisular o suturar. Por lo general, es suficiente sellar la piel con adhesivo tisular. Sin embargo, si durante la supervisión postoperatoria se observa la apertura de la incisión, se recomiendan suturas en su lugar.
   10. Aplique antiséptico de clorhexidina en el área alrededor del implante para evitar la infección. Administrar la solución de lactato sódico (3 ml por gramo del peso del animal) por vía subcutánea para reemplazar líquidos y electrolitos si el animal está bajo anestesia durante más de 2 horas después de la inyección anterior.
   11. Retire al animal del aparato estereotáctico y mida el peso del animal después de la cirugía de EEG como referencia para el monitoreo futuro. Debido al implante, el peso del animal será mayor que antes de la cirugía.
   12. Coloque el animal en una jaula limpia sobre una almohadilla de calentamiento caliente, con gel de recuperación y algunas piezas de comida humedecida para su recuperación.
3. Implante un soporte para la cabeza de tres canales EEG (3EEG).
   1. Utilice taladro de alta velocidad con una broca de acero (0,5 mm, redondo, 1/4) a 5.000 a 6.000 rpm para crear seis orificios de rebaba (tres para tornillos de estabilidad y tres para electrodos) utilizando las coordenadas estereotácticas proporcionadas¹². Para la referencia en tierra y común para EEG1 y EEG2: AP a 5,2 mm, ML a 1,5 mm; para EEG1 y EEG2: AP -3,0 mm, ML a 3,0 mm; para EEG3 independiente: AP -1,4 mm, ML a 1,5 mm.
   2. Coloque los seis electrodos de tornillo en los orificios de la rebaba.
      NOTA: Colocar los tornillos más profundos creará un daño significativo al cerebro. Los electrodos de tornillo proporcionan una mejor estabilidad del soporte para la cabeza.
   3. Preparar cemento dental para su aplicación mezclando una cucharada de polvo con varias gotas de disolvente. Use una espátula de mezcla y revuelva hasta que la mezcla final sea similar a una, pegajosa pero maleable, y lo suficientemente rígida como para condensarse adecuadamente cuando se coloque sobre el cráneo del animal.
   4. Aplique la mezcla de cemento dental que cubra toda la superficie expuesta del cráneo y cada electrodo de tornillo. Asegúrese de que la piel no esté sellada al soporte para la cabeza con cemento dental. Espere 1 x 2 minutos para que el cemento se solidifique ligeramente. No hay necesidad de esperar hasta la plena solidificación antes de continuar con el siguiente paso.
   5. Encienda el soldador para calentarlo. Coloque el soporte de cabeza 3EEG en un brazo de soporte estereotáctico.
      NOTA: Coloque el soporte para la cabeza de modo que las seis posiciones del cable de alambre coincidan con la posición de los cables de cada electrodo de tornillo.
   6. Baje el soporte para la cabeza para que su parte ventral se apoye en la parte superior del cemento dental.
   7. Gire el cable de cada cable de cada uno de los electrodos de tornillo con el cable de alambre correspondiente del soporte para cabeza.
      NOTA: La torsión de los cables incorrectos hará que la interpretación de datos sea complicada o imposible.
   8. Recorte cuidadosamente el exceso de alambre con tijeras. Soldar cada par de cable retorcido para una conducción de señal adecuada.
      NOTA: Cada par de cables debe hacer contacto con otro par, de lo contrario la calidad de la señal y la interpretación de los datos se verán comprometidas.
   9. Doblar cada par de cables soldados alrededor del soporte para la cabeza, evitando el contacto entre cada par.
      NOTA: Si los cables no se recortan lo suficientemente corto puede ser difícil doblarlos alrededor del soporte de cabeza sin tocar otro cable. En este caso, doblar un par primero, cubrirlo con la mezcla de cemento dental, esperar 1 s 2 minutos para solidificar, a continuación, proceder con el siguiente par de la misma manera.
   10. Termine de cubrir todo el alambre con cemento dental dejando sólo la parte negra de la montura de la cabeza expuesta.
       NOTA: Tenga cuidado de no aplicar ningún polvo o mezcla de cemento dental en la parte superior de la parte expuesta del soporte para la cabeza, ya que cualquier residuo o cemento en los agujeros bloqueará el contacto y conducirá a la ausencia de señal o al ruido.
   11. Suelte los hemostats sosteniendo las aletas de la piel. Aplique antiséptico de clorhexidina en el área alrededor del implante para evitar la infección.
   12. Administrar la solución de lactato sódico (3 ml por gramo del peso del animal) por vía subcutánea para reemplazar líquidos y electrolitos si el animal ha estado bajo anestesia durante más de 2 horas después de la inyección anterior.
   13. Retire al animal del aparato estereotáctico y mida el peso del animal después de la cirugía de EEG como referencia para el monitoreo futuro. Debido al implante, el peso del animal será mayor que antes de la cirugía.
   14. Coloque el animal en una jaula limpia sobre una almohadilla de calentamiento caliente, con gel de recuperación y algunas piezas de comida humedecida para su recuperación.
       NOTA: El peróxido de hidrógeno ayuda a eliminar el tejido blando restante del cráneo.

5. Conectar animales al sistema de adquisición

1. Covasos al animal con ambas manos para retirarlo de la jaula de adquisición y transferirlo a un área limpia con una superficie plana, como una Estación de Transferencia de Animales (ATS).
2. Agarre suavemente el ratón por la piel de su espalda. No agarre sin el animal por la cola, ya que esto causa angustia.
3. Identifique la abertura en el soporte de cabeza EEG correspondiente al electrodo de tierra y haga coincidir el pasador respectivo de la amarre para una conexión adecuada.
   NOTA: La conexión inversa de la atada desde el conmutador con el reposacabezas del animal dará como resultado una lectura diferente de los electrodos y las formas de onda potencialmente distorsionadas.
4. Devuelva el animal a la jaula de adquisición y conecte el otro extremo de la amarre (Sistema EEG 1) o preamplificador (Sistema EEG 2) al conmutador.
   NOTA: Cuando conecte el preamplificador (EEG System 2) a la amarre del conmutador, haga coincidir las marcas blancas en los extremos de ambas ataduras. La conexión inversa resultará en daños permanentes del amplificador y requiere reparaciones por parte del fabricante, que son costosas.
5. Gire suavemente la atela que conecta el animal al conmutador para asegurarse de que el mecanismo funciona correctamente y el animal puede moverse libremente.

6. Ajustes de adquisición de datos EEG

1. Establezca los parámetros de adquisición de EEG System 1.
   1. Ajuste la frecuencia de muestreo a 500 Hz; 5.000 dólares; modo Norma 35 Hz; LPN apagado. Ajuste el filtro de paso alto a 0,5 Hz.
      NOTA: 100 Hz (paso bajo) está incorporado y no requiere entrada manual.
2. Establezca los parámetros de adquisición de EEG System 2.
   1. Ajuste la frecuencia de muestreo a 600 Hz; ganancia de preamplificador 100; ganancia 1 (EEG1,2). Ajuste el filtro de paso bajo a 100 Hz.
      NOTA: 1 Hz (paso alto) está incorporado y no requiere entrada manual.

7. Configuración de adquisición de datos de vídeo

1. Establezca los parámetros de adquisición para eEG System 1.
   NOTA: Se necesita un sistema de adquisición de vídeo de terceros para obtener datos de vídeo simultáneos.
   1. Establezca la velocidad de fotogramas entre 15 (mínimo recomendado) y 30 (máximo disponible) para obtener una calidad de vídeo adecuada. Establezca la resolución en 640 x 640 píxeles. Establezca el tipo de compresión en H.264H.
2. Establezca los parámetros de adquisición para EEG System 2.
   NOTA: Este sistema EEG ofrece un sistema de vídeo y un software que sincronizan los datos de vídeo y EEG en un solo archivo para un máximo de cuatro animales (consulte La Tabla de materiales).
   1. Establezca la velocidad de fotogramas entre 15 (mínimo recomendado) y 30 (máximo disponible) para obtener una calidad de vídeo adecuada. Establezca la resolución en 640 x 480 píxeles. Establezca el tipo de compresión en el formato de archivo WebM.

Results

El protocolo descrito aquí describe el método de inducción de una lesión difusa de forma aislada (por ejemplo, en ausencia de una lesión focal) utilizando un modelo de ratón de TBI difuso repetitivo(Figura 1). La Figura 1A representa el dispositivo de caída de peso y sus componentes(Figura 1A, a1-a5) utilizados para la inducción de TBI en este modelo y pasos cruciales durante el procedimiento

Discussion

A diferencia de los modelos CCI y FPI que inducen lesiones focales o difusas, el modelo de TBI difuso repetitivo descrito en este protocolo permite la inducción de lesiones difusas en ausencia de lesión cerebral focal y no requiere aberturas del cuero cabelludo o craneal y la inflamación asociada. Un beneficio adicional de la ausencia de craneectomía en este modelo es que permite no sólo implantar los electrodos para la grabación crónica continua del EEG, sino también la creación de una ventana craneal adelgazada del crá...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tornillo de 0,10"	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8209	Acero inoxidable de 0,10 pulgadas de largo
Tornillo de 0,10"	Pinnacle Technology Inc., KS, EE. UU	. 8403	0,10 pulgadas de largo con cable presoldado
Tornillo de 0,12"	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8212	0,12 pulgadas
	de largo Invitro1 (subsidiaria de Plastics One), VA, EE. UU	. MS333/8-A/SPC	3 electrodos de alambre de platino iridio aislados individualmente con teflón (retorcidos o sin retorcer, 0,005 pulgadas de diámetro) que se extienden por debajo del pedestal de plástico roscado
2EEG/1EMG montaje en la cabeza	Pinnacle Technology Inc., KS, EE. UU.	8201	canales 2EEG/1EMG
peróxido de hidrógeno al 3%	Farmacia
	Pinnacle Technology Inc., KS, EE. UU.	8235-SM-C	Conector personalizado de 6 pines para canales 3EEG
Buprenorfina	Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, EE. UU	. 060969
Buprenorfina	Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, EE. UU.	060969
C57BL/6	Harlan/Envigo Laboratories Inc		macho, 12-16 semanas de edad
Ratones C57BL/6	The Jackson Laboratory		macho, 12-16 semanas viejo
Carprofeno	Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, EE. UU		. 026357 NOTA: este medicamento se agrega durante la caída de peso solo si la implantación del electrodo estereotáctico se realizará el mismo día
Antiséptico			Farmacia
Kit de cemento dental y solvente	Stoelting Co., EE. UU	51459
Taladro	Foredom	HP4-917
Broca	Meisinger USA, LLC, EE. UU	HM1-005-HP	0.5 mm, Redonda, 1/4, Acero
Esterilizador seco	Cellpoint Scientific, EE. UU		Germinador 500
Sistema de EEG 1	Biopac Systems, CA, EE. UU
Sistema 2	Pinnacle Technology Inc., KS, EE. UU
. Etanol ≥ 70%	VWR, EE. UU.	71001-652	KOPTEC USP, Grado de biotecnología (140 pruebas)
Ungüento para los ojos	Pro Labs Ltd, EE. UU.		Puralube Ungüento Veterinario Lubricante ocular estéril disponible en tiendas en línea generales y farmacias
Fluriso líquido para anestesia inhalatoria	MWI Veterinary Supply Co., EE. UU
Producto de depilación	Church & Dwight Co., Inc., EE. UU
Nair crema Isoflurano	MWI Veterinary Supply Co., EE. UU.	502017
Solución quirúrgica de povidona yodada	Purdue Products, EE. UU.	004677	Betadine
Rimadyl/Carprofen	Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, EE. UU	. 026357
Tienda			soldadura
Harware Soldador	Weller, EE. UU.	Punta WP35	ST7, 0,8 mm
Disco			Hecho a medida
Bastoncillos de algodón estériles
Almohadillas de gasa estériles	Fisher Scientific, EE. UU.	22362178
Almohadillas estériles de toallas absorbentes con forro de polietileno	Cardinal Health, EE. UU.	3520
Adhesivo para tejidos	3M Animal Care Products, EE. UU.	1469SB