Fabricación e implementación de una plataforma de microscopía de fuerza de tracción sin referencia

Summary

Este protocolo proporciona instrucciones para implementar litografía multifotópica para fabricar matrices tridimensionales de marcadores fiduciarios fluorescentes incrustados en hidrogeles basados en poli(etilenglicol) para su uso como microscopía de fuerza de tracción libre de referencia y de tracción para su uso como microscopía de fuerza de tracción libre de referencia Plataformas. Usando estas instrucciones, la medición de la tensión de material 3D y el cálculo de las tracciones celulares se simplificaparan para promover mediciones de fuerza de tracción de alto rendimiento.

Abstract

La cuantificación de la deformación del material inducida por células proporciona información útil sobre cómo las células detectan y responden a las propiedades físicas de su microambiente. Si bien existen muchos enfoques para medir la tensión de material inducida por las células, aquí proporcionamos una metodología para monitorear la tensión con resolución submicrones de una manera libre de referencia. Mediante un proceso de patrón fotolitográfico activado por dos fotones, demostramos cómo generar sustratos sintéticos mecánica y bioactivamente ajustables que contienen matrices incrustadas de marcadores fiduciarios fluorescentes para medir fácilmente tridimensionales ( 3D) perfiles de deformación del material en respuesta a las tracciones superficiales. Usando estos sustratos, los perfiles de tensión celular se pueden mapear usando una sola pila de imágenes 3D de una celda de interés. Nuestro objetivo con esta metodología es hacer de la microscopía de fuerza de tracción una herramienta más accesible y fácil de implementar para los investigadores que estudian los procesos de mecanotransducción celular, especialmente los recién llegados al campo.

Introduction

La microscopía de fuerza de tracción (TFM) es el proceso de aproximación de las tracciones celulares utilizando campos de desplazamiento interpolados de marcadores fiduciarios generados por una célula adherente y contráctil. Usando TFM, la influencia de las señales mecánicas en el entorno extracelular en procesos celulares importantes como la proliferación, diferenciación y migración se puede investigar^{1,2,3,4 ,5,6,7,}

Protocol

1. Fotopolimerización de un hidrogel base PEGDA

1. Reactivos de recolección
   1. Recoger el litio fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato (LAP), 3,4 kDa de poli(etileno) diacrilato de glicol (PEGDA), pirrolidona de n-vinilo (NVP), AlexaFluor 488 etiquetado PEGDA (PEG-488), AlexaFluor 633 etiquetado PEGDA (PEG-633) y péptido RGDS PEGylated ( PEG-RGDS) de sus respectivos congeladores y llevar cada uno a temperatura ambiente.
   2. En tubos de microcentrífuga ámbar separados, mida 3 mg de LAP, 10 mg de PEGDA, 5 mg de PEG-488, 20 mg de PEG-633 y 6 mg de péptido RGDS.
2. Preparación de la solución prepolímero

Results

A lo largo del protocolo, hay una serie de puntos de control que proporcionan retroalimentación para evaluar la calidad del procedimiento de patrón. Para proporcionar información sobre cómo evaluar el progreso en cada uno de estos puntos de control, proporcionamos resultados representativos de un experimento real. Los resultados ponen de relieve la aplicación de este protocolo realizado en un hidrogel fotopatrón preparado para el análisis DeMF de células endoteliales de venas umbilicales humanas (HUVEC). Los resultados i.......

Discussion

El objetivo de este protocolo es proporcionar un flujo de trabajo que alivie gran parte de la dificultad asociada con la generación y análisis de datos TFM. Una vez preparados, los hidrogeles fotopatrónidos son fáciles de usar, lo que requiere sólo el conocimiento de las prácticas estándar de cultivo de tejidos y la microscopía de fluorescencia. El aspecto libre de referencia permite la navegación despreocupada en hidrogeles cargados de células y elimina los engorrosos pasos de procesamiento de imágenes, como el registro.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Filtro de jeringa Acrodisc, 0.2 μ m Membrana Supor, baja unión a proteínas	Pall	PN 4602	Permite el filtrado de soluciones de macrómeros antes de la síntesis de gel base y los pasos de litografía posteriores.
Los cubreobjetos de acrilato-silano funcionalizados #1.5	in-house	in-house	Acrilatos permiten la unión del hidrogel base a la superficie del vidrio para inmovilizar los hidrogeles. Ver referencia: 21-24
Axio-Observer Z1 con	Zeiss	con módulo de iluminación estructurada utilizado para capturar imágenes para TFM.
Chameleon Vision ii	Coherent Inc.		Equipado con microscopio de barrido láser utilizado para litografía multifotónica.
Cinta de doble capa, 9500 piezas, 6.0 milésimas de pulgada	3M		Une cubreobjetos funcionalizados de acrilato-silano a placas de Petri.
Flexmark90 PFW Liner	FLEXcon FLX000620		Permite el revestimiento de cinta de doble capa, lo que permite la alimentación de cinta en el plotter.
LSM-880	Zeiss		utilizado para litografía multifotónica.
MATLAB	Mathworks	R2018a Ejecuta	scripts personalizados para generar instrucciones de litografía para microscopio y para el análisis de datos TFM.
Modelo SC Plotter	USCutter	SC631E	Corta la cinta de doble capa en anillos para unir los cubreobjetos a las placas de Petri.
Objetivo C-Apochromat 40x/1.20 W Corr M27	Zeiss		Equipado tanto en microscopio de campo amplio como en microscopio de barrido láser para ser utilizado tanto en litografía como en TFM.
PEG-AF633	in-house	in-house	Variante de acrilato PEG marcado con fluoróforos para la creación de marcadores de referencia. Ver referencia: 21
PEG-DA	em>in-house	in-house	Material base para hidrogeles. Ver referencia: 21
PEG-RGDS	em>in-house	em<>in-house	RGDS para promover la adhesión celular. Ver referencia: 21
Placas de Petri	CELLTREAT 229638		Se cortan agujeros de 8 mm en el centro de cada placa con una broca de extracción de muestras para colocar hidrogeles base.
Sylgard 184 Kit de elastómero de silicona	Dow Corning	3097358-1004	Para crear espaciadores para controlar el espesor del hidrogel base (también conocido como PDMS).
Jeringa, Leur-Lok, 1 mL	BD	309628	Permite el filtrado de soluciones de macrómeros antes de la síntesis de gel base y los pasos de litografía posteriores.
Lámpara UV	UVP	Blak-Ray® B-100AP	Polimeriza el hidrogel base.
1-vinilo-2-pirrolidinona (NVP)	Sigma-Aldrich	V3409-5G	Acelerante de radicales y comonómero. Mejora la incorporación de fluoróforos pegilados durante la litografía.