La longitud de la fibra neuronal dentro de una estructura tridimensional de una región cerebral es un parámetro confiable para cuantificar la integridad estructural neuronal específica o la degeneración. Este artículo detalla un método de cuantificación estereológica para medir la longitud de la fibra colinérgica dentro del núcleo basalis de Meynert en ratones como ejemplo.
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Artículo de método
Estimación estereológica de la longitud de la fibra colinérgica en el núcleo basalis de Meynert del cerebro del ratón
En este artículo
Resumen
Resumen
La longitud de los axónicos colinérgicos u otros axónicos neuronales en varias regiones cerebrales a menudo se correlacionan con la función específica de la región. La estereología es un método útil para cuantificar los perfiles neuronales de varias estructuras cerebrales. Aquí proporcionamos un protocolo de estereología basado en software para estimar la longitud total de las fibras colinérgicas en el núcleo basalis de Meynert (NBM) del antebrazo basal. El método utiliza una sonda de bola espacial para estimaciones de longitud. Las fibras colinérgicas se visualizan mediante la colina acetiltransferasa (ChAT) inmunomanchado con el líquido rábano peroxidasa-diaminobenzidina (HRP-DAB) sistema de detección. El protocolo de tinción también es válido para la estimación de fibra y número de célula en varias regiones cerebrales utilizando software de estereología. El protocolo de estereología se puede utilizar para la estimación de cualquier perfil lineal como fibras colinoceptivas, fibras dopaminérgicas/catecolaminas, fibras serotonérgicas, procesos de astrocitos o incluso perfiles vasculares.
Introducción
Las estimaciones cuantitativas de longitud y/o densidad de las fibras nerviosas en el cerebro son parámetros importantes de los estudios neuropatológicos. La longitud de los axónicos colinérgicos, dopaminérgicos y serotonérgicos en varias regiones cerebrales a menudo se correlacionan con las funciones específicas de la región. Debido a que la distribución de estos axones es generalmente heterogénea, la estereología basada en el diseño se utiliza para evitar sesgos durante el muestreo. La sonda de bola espacial de estereología ha sido diseñada para proporcionar medidas eficientes y confiables de estructuras similares a líneas como fibras neuronales en una región de int....
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Protocolo
Todos los procedimientos para el uso de estos animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro Médico de Asuntos de Veteranos de Kansas City. Para los experimentos se utilizaron ratones de dieciocho meses de edad que sobreexpresaban la proteína precursora betamiloide mutante sueca (APPswe) y sus camaradas C57/BL6 WT. Los detalles de la cría y el genotipado se dan en He et al.8.
1. Perfusión y procesamiento de tejidos
- Anestetizar ratones utilizando una inyección intraperitoneal con ketamina (100 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg). Apriete los dedos para confirmar la f....
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Resultados
Los resultados representativos se muestran en la Tabla 1 y la Figura 5. El grupo C, que fue decodificado como grupo APPswe (APP), tenía una longitud de fibra significativamente menor(Figura 5B)y densidad de longitud de fibra(Figura 5C)en comparación con sus "littermates" de tipo salvaje (WILD). Los resultados mostraron que no hubo ninguna diferencia significativa en el volumen del N.......
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Discusión
Aquí demostramos un método para estimar la densidad de fibras colinérgicas en el NBM utilizando una sonda de bola espacial (esfera). Esta sonda estima la longitud total de la fibra en la región de interés. La longitud total se puede dividir por el volumen de la región para obtener la densidad de fibra. Para estimar el volumen de la región, se utilizó el método de recuento de puntos Cavalieri. El método de recuento de puntos Cavalieri es un estimador imparcial y eficiente de un volumen de referencia 3D para cualquier regi.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por subvenciones a W.Z.S. del Servicio de Investigación y Desarrollo Médico, El Departamento de Asuntos de Veteranos (Merit Review 1I01 BX001067-01A2), la Asociación de Alzheimer (NPSPAD-11-202149), y recursos del Midwest Biomedical Fundación de Investigación.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Kit ABC | Vector Laboratories | PK6100 | |
| Anticuerpo anti-ChAT | Millipore, MA, EE. UU. | AB144P | |
| Anti-cabra bovina IgG-B | Santacruz Biotechnology | SC-2347 | |
| Suero bovino, adulto | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU | B9433 | |
| Cryostat | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, EE. UU. | ||
| Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU | D5652 | |
| Etilenglicol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU. | 324558 | |
| Glicerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU | G2025 | |
| Peróxido de hidrógeno | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU | H1009 | |
| Immpact-DAB | kit Vector Laboratories | SK4105 | Solución de sustrato de peroxidasa DAB mejorada |
| Ketamina | Westward Pharmaceuticals, NJ, EE. UU. | 0143-9509-01 | |
| Microscopio | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, EE. UU | AF6000 | Equipado con platina motorizada y cámara digital en color IMI-tech |
| Temperatura óptima de corte (O.C.T.) medio de inclusión | Ciencias de la Microscopía Electrónica, PA, EE. UU | . 62550-12 | |
| Paraformaldehído | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU. | P6148 | |
| Medio de montaje por montaje | Electron Microscopy Sciences, PA, EE. UU | . 17986-01 | |
| Software Stereologer | Stereology Resource Center, Inc. St. Petersburg, FL, EE. UU | Stereologer2000 | Instalado en una computadora de escritorio Dell. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU. | T8787 | |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU. | T1503 | Tris base |
| Clorhidrato de Trizma | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU. | T5941 | Clorhidrato de Tris |
| Xilacina | Bayer, Leverkusen, Alemania | Xilenos Rompun | |
| , Grado histológico | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 534056 |
Referencias
- Mouton, P. R., Gokhale, A. M., Ward, N. L., West, M. J. Stereological length estimation using spherical probes. Journal of Microscopy. 206, Pt 1 54-64 (2002).
- Whitehouse, P. J., Price, D. L., Clark, A. W., Long Coyle, J. T., DeLong, M. R. Alzheimer dise....
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Reimpresiones y permisos
