El desarrollo de modelos murinos con genes específicos mutados en pacientes con cáncer de cabeza y cuello es necesario para comprender la neoplasia. Aquí, presentamos un protocolo para la transformación in vitro de células de la lengua murina primaria utilizando un sistema adeno-asociado virus-Cas9 para generar líneas celulares HNC murinas con alteraciones genómicas específicas.
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Artículo de método
In Vitro Establecimiento de una línea celular de cáncer de cabeza y cuello de murine genéticamente diseñada utilizando un sistema de virus Cas9 asociado con Adeno
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
El uso de células epiteliales normales primarias permite inducir reproduciblemente las alteraciones genómicas necesarias para la transformación celular mediante la introducción de mutaciones específicas en oncogenes y genes supresores de tumores, utilizando tecnología de edición del genoma basada en repetición palindrómica corta (CRISPR) en ratones. Esta tecnología nos permite imitar con precisión los cambios genéticos que se producen en los cánceres humanos que utilizan ratones. Al transformar genéticamente las células primarias murinas, podemos estudiar mejor el desarrollo, la progresión, el tratamiento y el diagnóstico del cáncer. En este estudio, utilizamos células epiteliales de lengua de ratón Cas9 inducibles Cre 9 para permitir la edición del genoma utilizando virus asociado al adeno (AAV) in vitro. Específicamente, al alterar KRAS, p53 y APC en células epiteliales normales de la lengua, generamos una línea celular de cáncer de cabeza y cuello murino (HNC) in vitro, que es tumorigénica en ratones singéricos. El método presentado aquí describe en detalle cómo generar líneas celulares HNC con alteraciones genómicas específicas y explica su idoneidad para predecir la progresión del tumor en ratones singéricos. Prevemos que este método prometedor será informativo y útil para estudiar la biología tumoral y la terapia de HNC.
Introducción
La HNC es una neoplasia maligna común en todo el mundo1. El modelado de la génesis de la neoplasia HNC se encuentra actualmente en un punto de inflexión científico2. Si bien se han identificado muchas mutaciones genéticas en HNC2,3,4 (por ejemplo, TP53, PIK3CA, NOTCH1, FAT1 y RAS) las combinaciones específicas de alteraciones genómicas necesarias en concierto para inducir la HNC siguen sin estar claras.
El uso actual de líneas celulares HNC humanas ha ayudado significativamente a dilucidar los mecanis....
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Protocolo
Este estudio fue aprobado por la Universidad Ben Gurion del Comité de Cuidado y Uso de Animales Negev. Los experimentos con animales fueron aprobados por la IACUC (IL.80-12-2015 e IL.29-05-2018(E)). Todos los aspectos de las pruebas con animales, la vivienda y las condiciones ambientales utilizadas en este estudio cumplieron con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio13.
1. Producción de virus asociados a Adeno
- Día 1: Cultivo celular
- Semilla 4 x 10 6 hek293T células por placa de 14,5 cm en 15 ml de DMEM. Preparar 10 placas para la transfección con polietilenimina (PEI) (1....
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Resultados
Uso del sistema AAV para transformar células Cas9 normales
La Figura 1 proporciona un mapa vectorial detallado del plásmido transgénico AAV utilizado en este estudio. La Figura 2 describe el diseño y el funcionamiento del sistema basado en AAV-Cas9. Para producir partículas virales, las células HEK293T se transcusaron con el vector transgén al AAV y otros vectores de empaquetado viral utilizando el método de t.......
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Discusión
Varios métodos se han utilizado previamente para transformar células primarias en cultivo con grados variables de éxito25,26,27,28. La mayoría de estos métodos utilizan células de fibroblastos de ratón para la transformación14,17,18,19 o utilizan carcinógenos como 4-n.......
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Divulgaciones
M.S. forma parte del Consejo Asesor del Instituto de Biociencia, y Menarini Ricerche ha recibido fondos de investigación de Puma Biotechnology, Daiichi-Sankio, Targimmune, Immunomedics y Menarini Ricerche. M.S. también es cofundador de Medendi Medical Travel, y en los últimos 2 años, ha recibido honorarios de Menarini Ricerche y ADC Pharma. Todos los demás autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Queremos agradecer al Dr. Daniel Gitler por proporcionarnos el plásmido pAd Delta 5 Helper. Este trabajo fue financiado por la Israel Science Foundation (ISF, 700/16) (a ME), la Fundación Binacional de Ciencias De Estados Unidos-Israel (BSF, 2017323) (a ME y MS), la Asociación Israelí contra el Cáncer (ICA, 20170024) (a ME), la Israel Cancer Research Foundation (ICRF, 17-1693-RCDA) (a ME) y la Concern Foundation (#7895) (a ME). Beca: la beca Alon a ME y BGU Kreitman becas a SJ y MP.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| fuertes | |||
| Anti ratón HRP Jackson | ImmunoResearch | 115-035-146 | |
| Anti conejo HRP | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | |
| células | mAb de ratón Cas9 | 14697 | |
| Cre | BioLegend | 900901 | |
| Cy3-AffiniPure IgG anti-ratón de cabra | Jackson ImmunoResearch | 115-165-062 | |
| Cy-AffiniIgG anti-conejo de cabra | pura Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | |
| GFP | Santa Cruz Biotechnology | sc-9996 | |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) | Tecnología de señalización celular | 4370 | |
| de señalización celular | monoclonal anti E cadherina de conejo | 3195S | |
| Conejo monoclonal anti-KRT 14 | Abcam | AB-ab181595 | |
| y beta; actina | MP Biomedicals | 691001 | |
| y beta; tecnología | de señalización celular | 9582S | |
| Líneas celulares | |||
| HEK93T | ATCC | CRL-3216 | |
| strong<>Medios de cultivo, productos químicos y reactivos | |||
| Bradford Reactivo | Bio-Rad 30015484 | ||
| BSA | Amresco | 0332-TAM-50G | |
| DAPI fluoromount | Southern Biotech | 0100-20 | |
| DMEM | Industrias Biológicas Israel Beit-Haemek Ltd. | 01-055-1A | |
| ECL (Westar Supernova y Westar Nova 2.0) | Cyanagen | XLS3.0100 y XLS071.0250 | |
| FBS | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 04-127-1A | |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| Heparina - Agarosa | Sigma | H6508 | |
| Aislado II Kit de ADN Genómico Bioline | BIO-52066 | ||
| MgCl2 | Panreac AppliChem | 300283 | |
| NaCl | Bio Lab Ltd | 1903059100 | |
| PBS | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 02-023-1A | |
| PEI | Polysciences | 23966-1 | |
| Solución de estreptococos en pluma | Industrias biológicas Israel Beit-Haemek Ltd. | 03-031-1B | |
| PFA | Santa Cruz Biotechnology | 30525-89-4 | |
| Cóctel de inhibidores de fosfatasa | Biotool | B15001A/B | |
| Cóctel de inhibidores de proteasa | MilliporeSigma | P2714-1BTL | |
| Tampón Tris | MERCK Millipore | 648311-1KG | |
| fuerte>Enzimas | |||
| Benzonase | Sigma | E1014 | |
| Colagenasa IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | |
| DNAse | Thermo Fisher Scientific | 18047019 | |
| Hialuronidasa | MilliporeSigma | H3506 | |
| Tripsina | Industrias Biológicas Israel Beit-Haemek Ltd. | 03-050-1B | |
| Artículos de vidrio | |||
| Cubreobjetos | Bar Naor | BNCB00130RA1 | |
| Deslizadores Bar | Naor | BN9308C | |
| Mouse cepas | |||
| C57BL/6 | Envigo | ||
| B6; 129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J | Jackson labs | 24857 | |
| NOD. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid) | Envigo | ||
| Plasmidios | |||
| AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg Kras sg P53- Kras HDR | Broad Institute of MIT | Amable regalo del Dr. Randall J Platt y el Dr. Joseph Rosenbluh, Broad Institute of MIT y Harvard, Cambridge, MA 02142, EE. UU. | |
| AAV 2/9 vector de cápside | Addgene | 112865 | |
| pAD Delta F5 ayudante | Ben Gurion Universidad del Negev | Proporcionado por el Dr. Daniel Gitler, Departamento de Fisiología y Biología Celular, Facultad de Ciencias de la Salud, y Centro Zlotowski de Neurociencia, Universidad Ben-Gurion del Negev, Beer-Sheva 84105, Israel. | |
| Artículos de plástico | |||
| Amicon-ULTRA filter 100 KDa | Millipore | UFC910024 | |
| 0.22 µ m filtros estériles, 4 mm | Millex | SLGV004SL | |
| 0,45 y micro; m Filtros estériles, 13 mm | Millex | SLHV013SL | |
| Placas de cultivo | Greiner Bio-One | ||
| Tubos Falcon | Greiner Bio-One |
Referencias
- Reyes-Gibby, C. C., et al. Genome-wide association study identifies genes associated with neuropathy in patients with head and neck cancer. Scientific Reports. 8 (1), 8789(2018).
- Riaz, N., Morris, L. G., Lee, W., Chan, T. A.
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Reimpresiones y permisos
