Aislamiento y cultivo de las neuronas motoras oculomotoras, trocleas y espinales de Islmnprenatal :GFP Ratones transgénicos

Ryosuke Fujiki; Joun  Y. Lee; Julie  A. Jurgens; Mary  C. Whitman; Elizabeth C. Engle

doi:10.3791/60440

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Aislamiento y cultivo de las neuronas motoras oculomotoras, trocleas y espinales de Isl^mnprenatal :GFP Ratones transgénicos

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DOI:

10.3791/60440

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12 de noviembre de 2019

Ryosuke Fujiki¹^,²^,³^,⁴^,⁹ , Joun Y. Lee¹^,²^,¹⁰ , Julie A. Jurgens¹^,²^,³^,⁷ , Mary C. Whitman²^,⁵^,⁶ , Elizabeth C. Engle¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸

¹Department of Neurology, Boston Children's Hospital, ²FM Kirby Neurobiology Center, Boston Children's Hospital, ³Department of Neurology, Harvard Medical School, ⁴Medical Genetics Training Program, Harvard Medical School, ⁵Department of Ophthalmology, Boston Children's Hospital, ⁶Department of Ophthalmology, Harvard Medical School, ⁷Broad Institute of M.I.T. and Harvard, ⁸Howard Hughes Medical Institute, ⁹Department of Neurology, Kokura Memorial Hospital, ¹⁰Department of Genetics, Albert Einstein College of Medicine

En este artículo

Resumen

Este trabajo presenta un protocolo para producir cultivos celulares homogéneos de neuronas motoras primarias oculomotoras, trocleas y espinales. Estos cultivos se pueden utilizar para análisis comparativos de las características morfológicas, celulares, moleculares y electrofisiológicas de las neuronas motoras oculares y espinales.

Resumen

Las neuronas oculomotoras (CN3) y las neuronas trocleares (CN4) exhiben una notable resistencia a enfermedades degenerativas de las neuronas motoras como la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) en comparación con las neuronas motoras espinales (SMN). La capacidad de aislar y cultivar CN3 de ratón primario, CN4 y SMN proporcionaría un enfoque para estudiar los mecanismos subyacentes a esta vulnerabilidad selectiva. Hasta la fecha, la mayoría de los protocolos utilizan cultivos celulares heterogéneos, que pueden confundir la interpretación de los resultados experimentales. Para minimizar los problemas asociados con las poblaciones de células mixtas, los cultivos puros son indispensables. Aquí, el primer protocolo describe en detalle cómo purificar y cultivar eficientemente CN3s/CN4s junto con contrapartes SMN de los mismos embriones utilizando embrionarios día 11.5 (E11.5) Isl^MN:GFP transgénicos embriones de ratón. El protocolo proporciona detalles sobre la disección y disociación tisular, el aislamiento celular basado en FACS y el cultivo in vitro de células de núcleos CN3/CN4 y SMN. Este protocolo añade un novedoso sistema de cultivo CN3/CN4 in vitro a los protocolos existentes y proporciona simultáneamente un cultivo SMN puro para la comparación de especies y edades. Los análisis centrados en las características morfológicas, celulares, moleculares y electrofisiológicas de las neuronas motoras son factibles en este sistema de cultivo. Este protocolo permitirá investigar los mecanismos que definen el desarrollo de neuronas motoras, la vulnerabilidad selectiva y las enfermedades.

Introducción

El cultivo de las neuronas motoras primarias es una poderosa herramienta que permite el estudio del desarrollo neuronal, función, y la susceptibilidad a los estresores exógenos. Los cultivos de neuronas motoras son particularmente útiles para el estudio de enfermedades neurodegenerativas como la esclerosis lateral amiotrófica (ELA)¹^,², cuyos mecanismos de enfermedad se entienden incompletamente. Curiosamente, a pesar de la muerte celular significativa de las neuronas motoras espinales (SMN) tanto en pacientes con ELA como en ratones modelo DE ELA, la muerte celular en neuronas oculomotoras (CN3) y las neuronas....