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Artículo de método

Aislamiento y cultivo de las neuronas motoras oculomotoras, trocleas y espinales de Islmnprenatal :GFP Ratones transgénicos

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DOI:

10.3791/60440

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12 de noviembre de 2019

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1Department of Neurology, Boston Children's Hospital, 2FM Kirby Neurobiology Center, Boston Children's Hospital, 3Department of Neurology, Harvard Medical School, 4Medical Genetics Training Program, Harvard Medical School, 5Department of Ophthalmology, Boston Children's Hospital, 6Department of Ophthalmology, Harvard Medical School, 7Broad Institute of M.I.T. and Harvard, 8Howard Hughes Medical Institute, 9Department of Neurology, Kokura Memorial Hospital, 10Department of Genetics, Albert Einstein College of Medicine

En este artículo

Resumen

Este trabajo presenta un protocolo para producir cultivos celulares homogéneos de neuronas motoras primarias oculomotoras, trocleas y espinales. Estos cultivos se pueden utilizar para análisis comparativos de las características morfológicas, celulares, moleculares y electrofisiológicas de las neuronas motoras oculares y espinales.

Resumen

Las neuronas oculomotoras (CN3) y las neuronas trocleares (CN4) exhiben una notable resistencia a enfermedades degenerativas de las neuronas motoras como la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) en comparación con las neuronas motoras espinales (SMN). La capacidad de aislar y cultivar CN3 de ratón primario, CN4 y SMN proporcionaría un enfoque para estudiar los mecanismos subyacentes a esta vulnerabilidad selectiva. Hasta la fecha, la mayoría de los protocolos utilizan cultivos celulares heterogéneos, que pueden confundir la interpretación de los resultados experimentales. Para minimizar los problemas asociados con las poblaciones de células mixtas, los cultivos puros son indispensables. Aquí, el primer protocolo describe en detalle cómo purificar y cultivar eficientemente CN3s/CN4s junto con contrapartes SMN de los mismos embriones utilizando embrionarios día 11.5 (E11.5) IslMN:GFP transgénicos embriones de ratón. El protocolo proporciona detalles sobre la disección y disociación tisular, el aislamiento celular basado en FACS y el cultivo in vitro de células de núcleos CN3/CN4 y SMN. Este protocolo añade un novedoso sistema de cultivo CN3/CN4 in vitro a los protocolos existentes y proporciona simultáneamente un cultivo SMN puro para la comparación de especies y edades. Los análisis centrados en las características morfológicas, celulares, moleculares y electrofisiológicas de las neuronas motoras son factibles en este sistema de cultivo. Este protocolo permitirá investigar los mecanismos que definen el desarrollo de neuronas motoras, la vulnerabilidad selectiva y las enfermedades.

Introducción

El cultivo de las neuronas motoras primarias es una poderosa herramienta que permite el estudio del desarrollo neuronal, función, y la susceptibilidad a los estresores exógenos. Los cultivos de neuronas motoras son particularmente útiles para el estudio de enfermedades neurodegenerativas como la esclerosis lateral amiotrófica (ELA)1,2, cuyos mecanismos de enfermedad se entienden incompletamente. Curiosamente, a pesar de la muerte celular significativa de las neuronas motoras espinales (SMN) tanto en pacientes con ELA como en ratones modelo DE ELA, la muerte celular en neuronas oculomotoras (CN3) y las neuronas trocleares (CN4s) son relativamente escasas1,3,4,5,6,7,8,9. Por lo tanto, los análisis comparativos de cultivos puros de CN3s/CN4s y SMN podrían proporcionar pistas importantes sobre los mecanismos subyacentes a la vulnerabilidad relativa. Desafortunadamente, una barrera importante a tales análisis ha sido la incapacidad para cultivar cultivos purificados de estas neuronas motoras.

Se han descrito muchos protocolos para la purificación de las SMN a partir de modelos animales. La mayoría de estos protocolos utilizan centrifugación de gradiente de densidad10,11,12 y/o p75NTR-técnicas de panoramización de clasificación celular basadas en anticuerpos13,14,15,16. La centrifugación de gradiente de densidad explota el mayor tamaño de las SMN en relación con otras células espinales, mientras que p75NTR es una proteína extracelular expresada exclusivamente por las SMN en la médula espinal. Casi 100% cultivos SMN puros han sido generados por uno o ambos de estos protocolos11,12,14. Sin embargo, estos protocolos no han tenido éxito en generar las culturas CN3/CN4 porque los CN3s/CN4 no expresan elNTRp75, y otros marcadores específicos CN3/CN4 no han sido identificados. También son más pequeños que los SMN y, por lo tanto, son más difíciles de aislar en función del tamaño. En cambio, los estudios in vitro de CN3s o CN4 se han basado endesvincular17,18,19,20,21, explantar17,22,23,24,25,26, y la rebanada27,28 cultivos, que se componen de tipos de células heterogéneas, y no han existido protocolos para el aislamiento y cultura de los CN3 primarios o CN4.

Aquí, se describe un protocolo para la visualización, aislamiento, purificación y cultivo de CN3, CN4 y SMN del mismo día embrionario 11.5 (E11.5) IslMN:GFP ratones transgénicos29 (Figura 1, Figura 2A). IslMN:GFP etiqueta específicamente las neuronas motoras con un GFP farnesylated que se localiza en la membrana celular. Este protocolo permite la comparación de múltiples tipos de neuronas motoras con el fin de dilucidar los mecanismos patológicos en la enfermedad de las neuronas motoras.

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Protocolo

Todos los experimentos que utilizaron animales de laboratorio se realizaron de acuerdo con las directrices de los NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio y con la aprobación del Comité de Cuidado y Uso de Animales del Hospital Infantil de Boston.

1. Configuración de apareamientos cronometrados antes de la disección

  1. Para generar ratones embrionarios prenatales para la cosecha de neuronas motoras, sopesar cada ratón hembra y establecer un apareamiento cronometrado entre ratones adultos IslMN:GFP transgénicos 11,5 días antes del día del aislamiento de la neurona. Con el fin de desarrollar este protocolo, se utilizaron 129S1/C57BL/6J IslMN:GFP ratones, de 2 a 9 meses de edad, y se estableció el apareamiento cronometrado por la noche.
  2. Examine a los ratones hembraen en busca de tapones vaginales a la mañana siguiente. Considere la fecha en la que el enchufe se identifica como día embrionario (E) 0.5.
  3. Pesar ratones hembra y examinar los cachorros mediante ultrasonido (ver Tabla de Materiales)entre E8.5-11. Compruebe si hay signos de apareamiento exitoso.
    1. Confirme el apareamiento exitoso detectando el aumento de peso en ratones hembra (generalmente >1,5 g en E9.5 si hay más de 5 x 6 embriones).
    2. Confirmar visualmente embriones bajo ultrasonido. Los embriones son fácilmente detectables por ultrasonido después de E9.5. Los ultrasonidos se llevan a cabo sólo en las mujeres que han aumentado de peso porque están más a menudo embarazadas que las que no lo hacen.
      NOTA: Los ratones hembras pueden aumentar de peso por razones distintas al embarazo, por lo que el aumento de peso por sí solo no es un indicador confiable del embarazo. La confirmación por ultrasonido evita el sacrificio innecesario de las hembras que no están embarazadas pero no es crucial si no están disponibles.

2. Condiciones de disección y preparación de instrumentos

  1. Realizar todo el recubrimiento (excepto la limpieza ácida de los labios de cubierta), la preparación de los medios, la disociación de tejidos (excepto la centrifugación y la incubación), y el trabajo de cultivo en una campana de flujo laminar para asegurar la esterilidad de los medios y las neuronas motoras embrionarias.
  2. Con una cuidadosa atención a la técnica estéril, lleve a cabo la disección de tejido fuera de una campana de flujo laminar con un riesgo mínimo de contaminación.
  3. Esterilice una placa de disección, un par de tijeras microdisseccionantes, un par de fórceps de apósito para el pulgar, dos pares de pinzas Dumont #5, un cuchillo microdisosecante y una cuchara perforada Moria al sumergir en 70% de etanol antes de su uso.

3. Recubrimiento PDL/Laminin de Platos/Coverslips

NOTA: Cultivo disociado de las neuronas motoras primarias en 96 pozos o 24 placas de pozo, dependiendo del número de células necesarias para la aplicación. Las células se pueden fotomente directamente en la placa de cultivo de tejido sin el uso de tapas si los pozos son ópticamente transparentes y los espesores son compatibles con la imagen.

  1. Para aplicaciones que requieren cubreobjetos, prepare los cubredes secados por ácido, esterilizados y secados al aire al menos 2 días antes del aislamiento de la neurona como se describió anteriormente30. Los lotes de coverslips se pueden preparar de esta manera con mucha antelación a los experimentos y se pueden almacenar hasta 6 meses sin afectar a la calidad experimental.
  2. Preparar una solución de trabajo de 20 g/ml de poli D-lisina (PDL) en solución salina tamponada de fosfato (PBS) 2 días antes del aislamiento de la neurona.
    1. Aliquot PDL (1 mg/ml) por adelantado y almacenar a -20 oC como solución de stock.
  3. Cubra la superficie de cada cubreobjetos o el pozo de la placa de cultivo de tejido con suficiente solución de PDL (por ejemplo, 100 ol por poca en 96 placas de pozo o 500 ml por poca en 24 placas de pozo con o sin tapa). Incubar durante la noche a 37oC.
  4. Al día siguiente lavar 3veces con agua esterilizada.
    1. Sellar las placas con película de parafina y guardar las placas lavadas recubiertas de PDL a 4 oC durante un máximo de 1 mes si se secan completamente después del lavado final.
  5. Preparar una solución de trabajo con 10 l de laminina (1,1 x 1,2 mg/ml) en 1,2 ml de PBS.
    1. Poblaciones de laminina aliquot (1,1 x 1,2 mg/ml) con antelación y almacenar a -80 oC.
  6. Cubra la superficie de cada cubreobjetos o bien con suficiente solución laminina para recubrir uniformemente la superficie. Incubar durante al menos 2 h a 37 oC antes de su uso.
    NOTA: Las placas y los labios recubiertos con PDL/lamininse se pueden almacenar hasta 1 semana a 37 oC, pero se prefiere laminina recién recubierta. Retire el laminin directamente antes de enchapar30. No se debe permitir que Laminin se seque. Si las placas deben almacenarse durante más de varias horas, deben envolverse en película de parafina.

4. Preparación de la disección, los medios de cultivo de la neurona motora y las soluciones de disociación

NOTA: Las concentraciones entre paréntesis indican las concentraciones finales de cada reactivo.

  1. Prepare el medio de disección.
    1. Descongelar el suero de caballo inactivado por calor durante la noche a 4oC, preparar 1 ml de alícuotas y conservara a -20oC. Descongelar alícuotas en RT directamente antes de su uso.
    2. Almacenar b27-suplemento (50x) en 1 mL alícuotas a -20 oC. Descongelar alícuotas en RT inmediatamente antes de su uso. Evite los ciclos de congelación/descongelación.
    3. Conservar el suplemento de glutamina (100x) a 4oC o -20oC. Dividir en alícuotas de 0,5 ml si se almacena a -20 oC.
    4. Conservar penicilina-estreptomicina (10.000 U/ml) en alícuotas de 1 ml a -20 oC. Descongelar alícuotas en RT inmediatamente antes de su uso.
    5. Para hacer el medio de disección, Mezclar 9,4 ml de Hibernate E con 200 l de suero de caballo (2%), 200 l de suplemento de 50x B27 (1x), 100 ml de suplemento de glutamina de 100x (1x) (p. ej., GlutaMAX) y 100 ml de 10.000 U/ml de penicilina-estreptomicina (100 U/ml). Utilice este medio para recoger tejidos diseccionados y hacer la suspensión final de las células disociadas.
    6. Añadir 500 l del medio de disección a tubos de microcentrífuga individuales de 1,7 ml para la recolección de tejido el día antes del aislamiento de la neurona. Preparar un tubo para cada tipo de tejido que se recogerá (por ejemplo, control positivo, control negativo, CN3/CN4, SMN) y almacenar a 4 oC antes del uso.
    7. Combine 49 ml de medios de baja fluorescencia Hibernate E con 1 ml de suplemento B27 (1x) y llene una placa de 24 pocillos con este medio (2 ml/bien) el día antes del aislamiento de la neurona. Utilice este plato para recoger embriones de ratón. Conservar a 4oC antes de su uso.
  2. Preparar el medio de cultivo de neuronas motoras.
    1. Preparar alícuotas de 25 mM 2-mercaptoetanol en el medio L15 de Leibovitz. Conservar a -20oC.
    2. Generar alícuotas de 5 l de 100 g/ml de bdNF, CNTF y GDNF diluidos en agua esterilizada. Conservar a -80 oC y descongelar alícuotas a RT inmediatamente antes de su uso.
    3. Preparar 10 mM de solución de forskoline mediante la adición de 64 l de dimetil sulfóxido (DMSO) a 5 mg (1.0670 M) de forskoline y vórtice bien para disolver completamente. A continuación, agregue agua esterilizada (1.003 ml) a la solución DMSO y al pozo de vórtice. Almacene alícuotas de 12 ml de forskoline de 10 mM a -20 oC y descongelar alícuotas en RT inmediatamente antes de su uso.
    4. Preparar alícuotas de 12 ml de isobutylmethylxantina (IBMX) diluidas en DMSO. Conservar a -20 oC y descongelar alícuotas a RT inmediatamente antes de su uso.
    5. Para hacer medio de cultivo de la neurona motora, mezcle 9,4 ml de medio neurobasal con 200 ml de suero de caballo (2%), 200 ml de suplemento de 50x B27 (1x), 100 ml de suplemento de glutamina de 100x (1x), 100 l de 10.000 U/m: penicilina-estreptomicina (100 U/ml) y 20 ml de 25 mM de 2-mercaptoetanol (50 m), preferiblemente directamente antes de su uso. Este paso se puede realizar hasta 1 día antes del aislamiento de la neurona.
    6. Justo antes del uso, añada 1 l cada uno de 100 g/ml bdNF (10 ng/ml), CNTF (10 ng/ml) y GDNF (10 ng/mL) y 10 l de forskoline de 10 mM (10 m) y 10 ml de 100 mM IBMX (100 mL) al medio de cultivo de neuronas motoras. Precalentar el medio a 37 oC.
  3. Preparar las soluciones de disociación.
    1. Preparar la solución de papaína (20 U/ml de papaína y 0,005% DNase) y una solución inhibidora de la albúmina-ovomucoide (inhibidor de ovomucoide de 1 mg/ml, albúmina de 1mg/ml y 0,005% DNase) siguiendo las instrucciones del fabricante.
    2. Preparar alícuotas de 500 ol de cada una de las soluciones de inhibidor de ovomucoide y papaína y almacenar a -80 oC. Descongelar alícuotas a 37 oC inmediatamente antes de su uso.

5. Disección ventral del cerebro medio y de la médula espinal

NOTA: Realice todos los pasos siguientes, excepto los pasos 5.1.1-5.1.3 y 5.1.5-5.1.6 bajo un estereomicroscopio de disección de fluorescencia. El tiempo total de disección por experimento suele ser de 3 a 5 h, dependiendo de la competencia en la técnica de disección y el número de neuronas motoras necesarias para cada experimento.

  1. Disección ventral del cerebro medio
    1. Eutanasia un ratón embarazada aproximadamente 11,5 días después de la fertilización por gas de dióxido de carbono y luxación cervical.
    2. Rocíe bien el abdomen con etanol y retire el útero con tijeras microdissezantes estériles y fórceps de apósito para el pulgar. Lave el útero brevemente en PBS estéril, luego transfiera a la placa de disección llena de PBS estéril preenfriado.
    3. Retire los embriones positivos islMN:GFPcuidadosamente del útero usando tijeras microdissección estériles, fórceps de apósito para el pulgar y pinzas Dumont #5 en PBS estéril helada bajo la luz brillante del microscopio. Usando una cuchara estéril Moria mini perforada, transfiera cada embrión a un pozo separado de una placa de 24 pozos llena de medio de fluorescencia baja Hibernate-E pretallado complementado con 1x B27. Mantenga el plato de 24 pozos en hielo.
    4. Transfiera un embrión a una placa de disección estéril y cúbralo completamente con la solución de sal equilibrada (HBSS) de Hank estéril en frío.
    5. Asegúrese de que los pasos de disección se realizan bajo la iluminación de isotiocianato de fluoresceína (FITC) del microscopio. Con pinzas, retire la cola y la cara del embrión sin dañar el cerebro medio(Figura 2Ba). Coloque el embrión propenso con las extremidades entretrás y la cola apuntando hacia la parte delantera del microscopio, hacia el dessector (indicado por un asterisco, Figura 2Bb).
    6. Usando pinzas, la hendidura abre el techo del cuarto ventrículo para generar una pequeña abertura. Utilice esta abertura para enganchar pinzas en el espacio creado entre el cuarto ventrículo y su techo. Diseccionar a lo largo de la superficie dorsal del embrión rostral a la corteza y lateral a la placa del suelo y la columna del motor(Figura 2Ca,b). Abra el tejido diseccionado de una manera abierta para revelar los núcleos CN3 y CN4 positivos de GFP.
      NOTA: Ahora se expondrá un pequeño trozo de tejido del cerebro medio ventral que contiene mesenquima, CN3 y CN4.
    7. Separe cuidadosamente el cerebro medio ventral del embrión y retire el tejido meningeal usando pinzas y un cuchillo microdiselante. Diseccionar los núcleos bilaterales CN3 y CN4 positivos de GFP lejos de la placa del suelo y otros tejidos circundantes GFP negativos utilizando pinzas y un cuchillo microdisocete(Figura 2D). Maximizar el número de neuronas motoras gFP positivas en el tejido extirpado, pero evitar tocarlas o dañarlas.
    8. Si se desea una colección de núcleos CN3 y CN4 separados, corte a lo largo de la línea media de estos dos núcleos (línea de puntos amarilla en la Figura 2D). Con una pipeta P1000, recoja el tejido ventral diseccionador del cerebro medio con un HBSS mínimo y colóquelo en un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml etiquetado lleno de medio de disección (ver paso 4.1.5). Conservar en hielo hasta la disociación.
    9. Continúe agrupando los cerebros medios ventrales de embriones adicionales en el mismo tubo hasta que el número total cumpla con el requisito experimental (consulte el paso 8 para conocer los números celulares ideales).
      NOTA: Se recomienda una colección agrupada de al menos 10 cerebros medios ventrales que produzcan aproximadamente 1 x 104 neuronas motoras CN3/CN4 porque los tejidos están sujetos a estrés durante la disociación y clasificación.
  2. Disección de la médula espinal ventral
    1. Mantenga el embrión propenso con la cabeza hacia la parte delantera del microscopio, hacia el dessector. Sostenga el embrión con un par de pinzas e inserte la punta de las otras pinzas en la parte caudal sin abrir del cuarto ventrículo.
    2. Abra el resto del cerebro trasero y la médula espinal dorsalmente sobre toda la extensión rostrocaudal del embrión. Abrir cortando el tejido dorsal, comenzando desde el cuarto ventrículo y trabajando hacia el canal central de la médula espinal caudal utilizando los fórceps como tijeras(Figura 2Ca,b). Tenga cuidado de no tocar o dañar la médula espinal ventral durante este procedimiento.
    3. Sostenga el embrión con un par de pinzas y pellizque la solapa del tejido dorsal a cada lado con el otro par de pinzas(Figura 2Ea,b).
      NOTA: Los tejidos dorsales extirpados contienen piel dorsal, mesenquime, ganglios de raíz dorsal (DRG), cerebro dorsal posterior y médula espinal. Retire la mayor cantidad posible de estos tejidos sin dañar los núcleos SMN, ya que son adhesivos y pueden atrapar SMN durante el filtrado o causar obstrucciones durante la clasificación de FACS.
    4. Retire la médula espinal ventral con el cuchillo de microdisección para perforar directamente debajo del SMN gFP positivo. Levante la médula espinal ventral con movimientos similares a la sierra en ambos lados(Figura 2Fa,b). Cortar la médula espinal ventral flotante transversalmente sobre C1, donde se proyecta el primer cuerno anterior GFP positivo(Figura 2G). Además, corte transversalmente en el límite superior de la extremidad inferior(Figura 2G). Retire la porción cervical (C1)-lumbar (L2-L3) de la médula espinal ventral después de este procedimiento.
    5. Coloque el lado dorsal de la médula espinal ventral hacia arriba y sostenga presionando el tejido GFP negativo entre las columnas SMN positivas de GFP con un par de pinzas. Retire el mesenquima unido restante, los DRG y la médula espinal dorsal recortando ambos lados de la columna SMN gFP-positiva con el cuchillo de microdisección(Figura 2H). Tenga cuidado de maximizar las neuronas motoras gFP positivas sin dañarlas.
    6. Con una pipeta P1000, recoja el tejido de la médula espinal ventral diseccionado con un HBSS mínimo y colóquelo en el tubo de microcentrífuga de 1,7 ml con etiqueta SMN lleno de medio de disección. Conservar en hielo hasta la disociación. Continúe agrupando las médulas espinales ventrales de embriones adicionales en el mismo tubo hasta que el número total cumpla con los requisitos experimentales.
      NOTA: Se recomienda recoger al menos tres médulas ulares ventrales que produzcan aproximadamente 2,1 x 104 SMN porque los tejidos están sujetos a estrés durante la disociación y clasificación.
    7. Recoger las neuronas motoras faciales y las extremidades de los embriones de ratón IslMN:GFP como controles GFP positivos y GFP-negativos para la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), respectivamente. Las extremidades son GFP negativas porque los axons positivos de GFP de las SMN aún no se han extendido a las extremidades a esta edad embrionaria.

6. Disociación de tejidos

NOTA: El tiempo total de disociación suele ser de 1,5 h por experimento.

  1. Alícuotas cálidas de la solución de papaína e inhibidor de albúmina-ovomucoide a 37 oC 30 min antes de la disociación.
  2. Espíe brevemente los tejidos microdiseccionados a baja velocidad.
  3. Con una pipeta P100, retire cuidadosamente la mayor hibernación E posible sin aspirar tejidos.
    NOTA: Asegúrese de eliminar toda Hibernación E residual después de este paso para evitar reducir la eficacia de la disociación de papaína en el siguiente paso.
  4. Añadir el volumen adecuado de solución de papaína(Tabla 1) a cada uno de los tubos de microcentrífuga de 1,7 ml que contienen las muestras de tejido microdiseccionado.
    NOTA: El volumen adecuado de papaína para la disociación se determinó con el fin de maximizar la disociación efectiva mientras se minimiza el estrés en las células.
  5. Triturar suavemente 8x con una pipeta P200. Realizar todos los pasos de trituración suavemente para preservar la viabilidad de la neurona motora.
  6. Incubar los tubos que contienen los tejidos durante 30 min a 37 oC, agitando con el dedo parpadeando 10 veces cada 10 min. Triturar suavemente cada suspensión 8veces con una pipeta P200 después de la incubación. Gire las células a 300 x g durante 5 min.
  7. Para garantizar la eficacia de la inhibición de los ovomucoides en el siguiente paso, utilice una pipeta P1000 para extraer y desechar tanto sobrenadante como sea posible sin aspirar los tejidos.
  8. Resuspenda los gránulos en el volumen adecuado de solución inhibidora de albúmina-ovomucoide(Tabla 1) triturando suavemente 8x con una pipeta P200.
  9. Espere 2 minutos para permitir que las piezas restantes de tejido no disociizado se asienten en la parte inferior del tubo.
  10. Recoger tanto sobrenadante como sea posible sin aspirar tejidos no disociados usando una pipeta P200. Transfiera el sobrenadante a tubos de microcentrífuga frescos de 1,7 ml.
  11. Si algunos trozos de tejido permanecen sin disociarse después del paso 6.10, repita los pasos 6.8 a 6.10 para los tejidos no disociados que permanecen en los tubos de microcentrífuga originales de 1,7 ml para maximizar el rendimiento final de las células disociadas y minimizar la tensión en las células disociado previamente, contenido en el sobrenadante del paso 6.10.
  12. Gire las células a 300 x g durante 5 min. Retire y deseche cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta P1000.
  13. Resuspenda el pellet en el volumen adecuado de medio de disección(Tabla 1) pipeteando 8 veces utilizando una pipeta P1000. Se determinó el volumen adecuado de suspensión final para que la densidad celular no exceda de 107 células/ml, lo que puede bloquear el flujo de la máquina de citometría de flujo, pero también para que las células no se diluyan excesivamente, lo que resulta en una velocidad de clasificación lenta.
  14. Filtrar las suspensiones a través de coladores celulares de 70 m para eliminar cualquier grumos grandes o tejido no digerido. Transfiera las suspensiones en tubos de ensayo de poliestireno de fondo redondo de 5 ml y guárdelas en hielo hasta que sea necesario.

7. Clasificación celular activada por fluorescencia (FACS)

NOTA: Este protocolo fue optimizado utilizando un clasificador FACS equipado con un láser violeta de 15 mw 405 nm, un láser azul de 100 mw 488 nm, un láser naranja de 75 mw 594 nm y un láser rojo de 40 mw 640 nm. Las células se clasificaron como líquido de vaina en PBS estéril en condiciones asépticas a través de una boquilla de 100 m. Con el fin de minimizar la tensión celular, el caudal se estableció en una presión de muestra de 1 a 3, de tal manera que se adquirió un máximo de 1.000 a 4.000 eventos por segundo. El tiempo total de FACS suele ser de 1 a 2 h por experimento.

  1. Configure voltajes para la dispersión hacia adelante y lateral para que la población celular se pueda visualizar correctamente. La configuración de voltajes adecuados para la clasificación de celdas es compleja y requiere un operador FACS experimentado.
  2. Para distinguir diferentes poblaciones de celdas, trace las celdas en función del tamaño determinado por el área de dispersión hacia delante (FSC-A) frente a la complejidad interna determinada por el área de dispersión lateral (SSC-A). Dibuje una puerta alrededor de las células vivas como se indica en la Figura 3Aa y la Figura Ba para excluir escombros y células muertas. Agrupe las celdas dentro de la región cerrada como población 1 (P1).
  3. Para excluir grumos de celda y dobletes, trace las celdas P1 a continuación en función de la anchura de dispersión lateral (SSC-W) frente a la SSC-A. Gate the population of single cells as population 2 (P2)(Figura 3Ab y Figura Bb).
  4. Trazar celdas P2 basadas en la Anchura de Dispersión Adelante (FSC-W) frente al FSC-A y gatear la población de células individuales como población 3 (P3)(Figura 3Ac y Figura Bc).
    NOTA: El uso de dos puertas consecutivas en 7.3 y 7.4 excluye los grupos y dobletes celulares (fsc-W alto y alto FSC-A).
  5. Células de la puerta P3 basadas en GFP versus alophycocyanin (APC). El canal APC detecta la autofluorescencia. La captura en este canal evita la captura de células autofluorescentes. Utilice celdas GFP negativas para ajustar el voltaje de los canales fluorescentes FITC/GFP. Idealmente, las puertas de posición para estas poblaciones celulares alrededor de 102. Seleccione los umbrales de compuerta para la población positiva de GFP 4 (P4) individualmente para cada tipo de neurona motora(Figura 3Anuncio y Figura Bd).
    NOTA: Fije la puerta GFP mucho más alta para los SMN que para los CN3s/CN4s para obtener una cultura pura(Figura 3Ad y Figura Bd). Una puerta GFP inferior para los cultivos SMN conduce a la contaminación de los cultivos por la glia y las neuronas no motoras. Esto es probable porque hay expresión de GFP de bajo nivel en algunas neuronas glia y no motor debido a un promotor con fugas. El porcentaje de células gFP positivas en comparación con las células totales es típicamente 0.5-1.5% para CN3s/CN4s y 1.5-2.5% para las SMN. Si la disección fue exitosa, estos números se pueden utilizar como punto de referencia para determinar la posición apropiada para la puerta gFP positiva(Figura 3Ae y Figura Ser).
  6. Realice FACS de acuerdo con el protocolo del fabricante. Recoger las células P4 en tubos de microcentrífuga frescos de 1,7 ml llenos de 500 ml de medio de cultivo de neuronas motoras. Conservar en hielo hasta que esté enchapado.
    NOTA: Aunque las celdas se pueden clasificar directamente en los pozos, esto resulta en un número desigual de celdas por pozo. Ordene las células en tubos de microcentrífuga de 1,75 ml y luego placa manualmente para lograr una distribución de chapado más uniforme.

8. Cultivo de neuronas motoras primarias purificadas

  1. Diluir suspensiones CN3/CN4 y SMN aisladas por FACS con medio de cultivo de neuronas motoras precalentado a 37 oC a densidades de 5 x 103 y 1 x 104 células/ml, respectivamente.
    NOTA: Un embrión E11.5 produce aproximadamente 1 x 103 CN3/CN4 y 7 x 103 SMN. Sin embargo, estos rendimientos dependen en gran medida de la pureza de los tejidos diseccionados, la minuciosidad de la disociación celular y el umbral adecuado de las puertas GFP durante el FACS.
  2. Transfiera 96 placas de pozos precubiertas con PDL y laminina desde la incubadora de cultivo de tejido de 37oC a la campana de flujo laminar y aspire la minin a cada pocal. Use platos y tapas inmediatamente sin lavarse.
  3. Añadir 200 s de suspensiones CN3/CN4 y SMN diluidas en cada pocal de 96 placas de pozores recubiertas de PDL/laminin. Las densidades de celda final deben ser 1 x 103 y 2 x 103 celdas/bien para CN3/CN4 y SMN, respectivamente.
    NOTA: La densidad inicial de chapado de las SMN en 96 placas de pozos (2 x 103 células/pozo) es el doble que la de CN3s/CN4s (1 x 103 células/pozo) con el fin de obtener números y densidades de neuronas motoras finales similares a 2 y 9 días in vitro (DIV) (4 x 6 x 102 y 2 x 4 x 102 células por pozo, respectivamente).
  4. Neuronas de cultivo en una incubadora de 37oC, 5%CO2.
  5. Alimentar las neuronas cada 5 días mediante la eliminación de la mitad de los medios antiguos (100 l) y la sustitución con el mismo volumen de medio de cultivo de neuronas motoras frescas. Asegúrese de que los procesos neuronales se vuelvan visibles en 1 DIV y se vuelvan más gruesos y más largos por 14 DIV(Figura 4). Los cuerpos celulares neuronales se agrandan y tienden a acumularse en cultivos a largo plazo, particularmente para las SMN(Figura 4).
    NOTA: Realice todos los cambios medios y de solución dejando la mitad del volumen medio original para evitar separar las células cultivadas. Esto incluye pasos de fijación e inmunocitoquímica (ICC). Si se retiran todos los medios, independientemente de la suavidad con la que se desprensitúen, la mayoría de las células se separarán y se lavarán.

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Resultados

El objetivo de este protocolo era purificar y cultivar altamente tanto los CN3/CN4 primarios como los SMN a largo plazo para permitir análisis comparativos de los mecanismos subyacentes a los trastornos de las neuronas motoras (ver Figura 1 y Figura 2 para una visión general).

Una vez que las neuronas se aislaron y cultivaron con éxito, se obtuvieron cultivos primarios ...

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Discusión

Históricamente, los estudios in vitro de neuronas motoras CN3 y/o CN4 han recurrido a cultivos heterogéneos como disociados17,18,19,20,21, explantar17,22,23,24,25,26

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Divulgaciones

Los autores no declaran conflicto de intereses.

Agradecimientos

Agradecemos a Brigitte Pettmann (Biogen, Cambridge, MA, EE. UU.) la instrucción en técnicas de disección SMN; el Dana Farber Cancer Institute Flow Cytometry Facility, el Immunology Division Flow Cytometry Facility of Harvard Medical School, The Joslin Diabetes Center Flow Cytometry Core, Brigham and Women's Hospital Flow Cytometry Core, y Boston Children's Hospital Flow Cytometry Research Facility for FACS isolation of primary motor neuron; A.A. Nugent, A.P. Tenney, A.S. Lee, E.H. Nguyen, M.F. Rose, miembros adicionales del laboratorio engle y miembros del consorcio Project ALS para asistencia técnica y discusión reflexiva. Este estudio fue apoyado por el Proyecto ELA. Además, R.F. fue financiado por la Japan Heart Foundation/Bayer Yakuhin Research Grant Abroad y NIH Training Grant in Genetics T32 GM007748; J.J. contó con el apoyo del programa de capacitación NIH/NEI en las Bases Moleculares de Enfermedades Oculares (5T32EY007145-16) a través del Instituto de Investigación Ocular schepens y el Programa de Capacitación en Neurología del Desarrollo (5T32NS007473-19) a través del Hospital Infantil de Boston; M.C.W contó con el apoyo de NEI (5K08EY027850) y Children's Hospital Ofthalmology Foundation (Faculty Discovery Award); y E.C.E. es investigador del Instituto Médico Howard Hughes.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Alexa Fluor 488-conjugada cabra anti-ratón IgG (H+L)Thermo Fisher ScientificA-110011:400
Alexa Fluor 594-conjugada F(ab')2 cabra anti-conejo IgG (H+L)Thermo Fisher ScientificA-110721:400
B27 Suplemento (50x), sin sueroThermo Fisher Scientific17504-044
BD FACSAria llu SORP Citómetro de flujoBD Bioscience- Este tiene 4 sistemas láser equipados con láseres de 405, 488, 594 y 640 nm.
BD Halcón 70μ m Filtros de celdas de nylonCORNING352350Para filtrar las celdas disociantes antes de FACS.
Tubos de ensayo de fondo redondo BD Falcon con tapón a presiónCORNING352054
BDNF HumanProSpec-Tany TechnoGene, Ltd.CYT-207
Microplaca de cultivo celular, 96 pocillos, PS, fondo F (pozo de chimenea)Greiner Bio-One International655090Probamos varias placas de 96 pocillos y esta fue la mejor para el cultivo y los análisis después de ICC
Cubreobjetos circulares para microscopíaKarl Hecht & Asistente1001/14Utilizamos este cubreobjetos ya que el área era grande (diámetro: 14 mm).
CNTF HumanProSpec-Tany TechnoGene, Ltd.CYT-272
Ácido ciclopiazónico de Penicillium cyclopiumSigma-AldrichC1530CPA. Uno de los factores estresantes de la sala de emergencias.
4′,6-diamidino-2-fenilinodol (DAPI)Thermo Fisher ScientificD1306
Dimethyl sulfóxidoSigma-AldrichD2650DMSO
Dumont #5 Pinzas de acero inoxidable Tamaño de la punta 0,05 mm x 0,01 mm Biologie TipsRoboz Instrumento quirúrgicoRS-5015
ForskolinThermo Fisher ScientificBP25205
GDNF HumanProSpec-Tany TechnoGene, Ltd.CYT-305
Suplemento GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050-061
Hanks' Solución salina equilibrada (HBSS)Thermo Fisher Scientific14175-095
Hibernate EBrainBitsHE
Hibernate E baja fluorescenciaBrainBitsHELFLa fluorescencia que dificulta la observación de las expresiones de GFP del embrión debe ser baja.
Suero de caballo, inactivado por calor, origen neozelandésThermo Fisher Scientific26050-070
IBMXTocris Cookson2845Laminina de isobutilmetilxantina
Thermo Fisher Scientific23017-015
Leibovitz' s L15 medianoThermo Fisher Scientific 11415064
2-MercaptoetanolSigma-AldrichM6250
Micro Tijeras de DisecciónRoboz Instrumento QuirúrgicoRS-5913
Micro Cuchillo 4.75" 1.7 mm x 27 mmhoja Roboz Instrumento QuirúrgicoRS-6272
Moria Mini Cuchara PerforadaHerramientas de Ciencia Fina10370-19
Anticuerpo monoclonal de ratón contra la clase neuronal III β-tubulina (TUBB3)BioLegend801202 1:500, TUJ1
Microscopio de fluorescencia de células vivas Nikon Perfect Focus Eclipse Ti y software ElementsNikon-DifferentialInterference Contrast Images e imágenes de inmunocitoquímica de los cultivos celulares se capturaron con estos equipos
Ácido nítrico 90%, fumante (ACS certificado)Fisher ScientificA202-212Para enjuagar cubreobjetos
Microtubos Olympus de 1,7 mL, transparentesGenesee Scientific22-281Estos son los tubos que describimos como "tubos de microcentrífuga de 1,7 mL" en el contexto.
Sistema de disociación de papaínaWorthington Biochemical CorpLK003150solución de papaína y solución inhibidor de alubumina-ovomucoide se preparan a partir de este kit.
Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140-122
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)Thermo Fisher Scientific10010-023
Poly D-lisina (PDL)MilliporeSigmaA-003-E
Anticuerpo monoclonal de conejo contra Islet1Abcamab1095171:200
SMZ18 y microscopios estereoscópicos con zoom SMZ1500 con DS-Ri1 Se realizó una disecciónNikony se capturaron imágenes de embriones y tejidos disecados bajo estos microscopios de fluorescencia.
Sylgard 170 Encapsulante de Silicona Negra - A+B Kit 0,9 kgDow Corning1696157Hacemos platos de disección con este kit.
Platos tratados con TC, 100 mm x 20 mmGenesee Scientific25-202Hacemos platos de disección con este plato.
Pinza de vendaje Thum de 4,5" dentada de 2,2 mm de ancho de puntaInstrumento quirúrgico RobozTransductor RS-8100
para LOGOQ e VETGE HealthcareL8-18i-RSPara ultrasonido en ratones hembra
Ecógrafo veterinarioGE HealthcareLOGOQ e VETPara ultrasonido en ratones hembra
Zeiss LSM serie 700 Microscopio confocal de barrido láser y software ZenCarl Zeiss-La imagen confocal del embrión fue capturada con estos equipos

Referencias

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