Los corales crean ecosistemas biodiversos importantes tanto para los seres humanos como para los organismos marinos. Sin embargo, todavía no entendemos todo el potencial y la función de muchas células de coral. Aquí, presentamos un protocolo desarrollado para el aislamiento, etiquetado y separación de poblaciones de células de coral pedregosas.
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Artículo de método
Clasificación celular activada por fluorescencia para el aislamiento de las poblaciones celulares escleractinianas
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
Los arrecifes de coral están amenazados debido a factores de estrés antropogénicos. La respuesta biológica del coral a estos factores estresantes puede ocurrir a nivel celular, pero los mecanismos no se entienden bien. Para investigar la respuesta coralina a los factores estresantes, necesitamos herramientas para analizar las respuestas celulares. En particular, necesitamos herramientas que faciliten la aplicación de ensayos funcionales para comprender mejor cómo reaccionan las poblaciones celulares al estrés. En el estudio actual, utilizamos la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para aislar y separar diferentes poblaciones celulares en corales pedregosos. Este protocolo incluye: (1) la separación de los tejidos corales del esqueleto, (2) la creación de una suspensión de una sola célula, (3) el etiquetado de las células de coral utilizando varios marcadores para la citometría de flujo, y (4) gating y estrategias de clasificación celular. Este método permitirá a los investigadores trabajar en corales a nivel celular para análisis, ensayos funcionales y estudios de expresión génica de diferentes poblaciones celulares.
Introducción
Los arrecifes de coral son uno de los ecosistemas más importantes de la Tierra. Facilitan la biodiversidad proporcionando hábitats críticos para los peces y los invertebrados y son cruciales para sostener las comunidades antropogénicas proporcionando alimentos y medios de vida económicos a través del turismo1. Como el constructor clave de los arrecifes de coral, el animal de coral (Phylum: Cnidaria) también ayuda a las comunidades costeras mediante la creación de grandes marcos de carbonato de calcio que mitigan los daños causados por las olas y las tormentas2.
Los corales como adultos son ani....
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Protocolo
1. Disociación de tejidos del esqueleto de coral a través de aerógrafo y compresor
NOTA: Realice pasos sobre hielo y proteja las manos con guantes.
- Montar el kit de aerógrafo conectando el compresor de aire, la manguera y el aerógrafo (Figura 2). Ajuste el manómetro entre 276 x 483 kPa.
NOTA: El compresor y la manguera de aire recomendados para este estudio se preestablecieron a una presión máxima de 393 kPa. El uso fuera de este rango de 276-483 kPa puede resultar en la eliminación celular inadecuada del esqueleto o la ruptura de las membranas celulares. Este rango puede diferir para cada especie ....
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Resultados
En general, este protocolo es útil porque facilita la identificación y recolección de poblaciones de células de coral vivas que se pueden utilizar para análisis funcionales. El flujo de trabajo comenzó con la separación mecánica de los tejidos corales del esqueleto de carbonato de calcio subyacente (Figura 1). Este es uno de los pasos iniciales más importantes porque una técnica inadecuada resulta en una alta mortalidad celular y puede crear grandes cantidade.......
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Discusión
Este protocolo fue adaptado de Rosental et al.18 y desarrollado para la identificación y aislamiento de células P. damicornis. La metodología se centra en el proceso de filtrado de muestras para eliminar desechos, células no viables y células alojadas en Symbiodiniaceae a través del examen de factores intrínsecos celulares, incluyendo el tamaño relativo de la célula, la granularidad relativa de las células, la autofluorescencia celular y la presencia de membranas celulares intactas. Estas.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
NTK desea reconocer los Premios de Investigación en Ciencias Naturales e Ingeniería de la Universidad de Miami por financiar esta investigación. BR desea agradecer a Alex y Ann Lauterbach por financiar el Laboratorio de Inmunología Comparativa y Evolutiva. El trabajo de la BR fue apoyado por los números de la Fundación Israel Science (ISF): 1416/19 y 2841/19, y HFSP Research Grant, RGY0085/2019. Nos gustaría dar las gracias a Zhanna Kozhekbaeva y Mike Connelly por la asistencia técnica. También nos gustaría agradecer al Recurso Compartido de Citometría de Flujo de la Universidad de Miami, Miller School of Medicine en el Sylvester Comprehensive Cancer Center por el acc....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Kit de aerógrafo & Compresor | TCP Global | ABD KIT-H-SET | Paasche H Series Kit de aerógrafo de alimentación de sifón de acción simple con compresor Master TC-20 & manguera de aire |
| BD FACSAria II | BD | 644832 | |
| cortadores de huesos | a granel | de arrecifes 205357 Oceans Wonders Coral Stony Bone Cutter | |
| Cell Strainer Corning | 352340 | 40 mmm; BD Halcón; envueltos individualmente; estéril; nylon | |
| CellRox Green | Life Technologies | C10444 | 2,5 mM en DMSO; Excitación/Emisión: 485/520 nm |
| Bolsa de recolección | Grainger | 38UV35 | Reloc Zippit 6"L x 4"W Bolsa de polietileno recerrable estándar con cierre de cierre de hermética, transparente; 2 mil de espesor |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 10mg en H2O; Excitación/Emisión: 358/461 nm |
| Suero de ternera fetal | Sigma-Aldrich | F2442-100ML | Inactivado por calor a 57 ° C durante 30 minutos |
| Hemacitómetro | Sigma-Aldrich Z359629 | Bright-Line Hemacitómetro | |
| HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| LysoTracker Deep Red | Life Technologies | L12492 | 1mM en DMSO; Absorción/Emisión: 647/668 nm |
| Tubos de microcentrífuga | VWR | 87003-294 | 1,7 mL |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Gibco | 70011-044 | pH 7,4; 10X |
| Tubos de fondo redondo | VWR 352063 | 5 mL Polipropileno Jeringa de tubo de fondo redondo | |
| BD 309628 | 1 mL BD Luer-Lok Jeringa estéril, de un solo uso policarbonato |
Referencias
- Bellwood, D. R., Hughes, T. P. Regional-scale assembly rules and biodiversity of coral reefs. Science. 292 (5521), 1532-1535 (2001).
- Ferrario, F., et al. The effectiveness of coral reefs for coastal hazard risk reduction and adaptation. Nature Communicat....
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Reimpresiones y permisos
