Clasificación celular activada por fluorescencia para el aislamiento de las poblaciones celulares escleractinianas

Resumen

Los corales crean ecosistemas biodiversos importantes tanto para los seres humanos como para los organismos marinos. Sin embargo, todavía no entendemos todo el potencial y la función de muchas células de coral. Aquí, presentamos un protocolo desarrollado para el aislamiento, etiquetado y separación de poblaciones de células de coral pedregosas.

Resumen

Los arrecifes de coral están amenazados debido a factores de estrés antropogénicos. La respuesta biológica del coral a estos factores estresantes puede ocurrir a nivel celular, pero los mecanismos no se entienden bien. Para investigar la respuesta coralina a los factores estresantes, necesitamos herramientas para analizar las respuestas celulares. En particular, necesitamos herramientas que faciliten la aplicación de ensayos funcionales para comprender mejor cómo reaccionan las poblaciones celulares al estrés. En el estudio actual, utilizamos la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para aislar y separar diferentes poblaciones celulares en corales pedregosos. Este protocolo incluye: (1) la separación de los tejidos corales del esqueleto, (2) la creación de una suspensión de una sola célula, (3) el etiquetado de las células de coral utilizando varios marcadores para la citometría de flujo, y (4) gating y estrategias de clasificación celular. Este método permitirá a los investigadores trabajar en corales a nivel celular para análisis, ensayos funcionales y estudios de expresión génica de diferentes poblaciones celulares.

Introducción

Los arrecifes de coral son uno de los ecosistemas más importantes de la Tierra. Facilitan la biodiversidad proporcionando hábitats críticos para los peces y los invertebrados y son cruciales para sostener las comunidades antropogénicas proporcionando alimentos y medios de vida económicos a través del turismo¹. Como el constructor clave de los arrecifes de coral, el animal de coral (Phylum: Cnidaria) también ayuda a las comunidades costeras mediante la creación de grandes marcos de carbonato de calcio que mitigan los daños causados por las olas y las tormentas^2.

Los corales como adultos son animales sésiles que albergan una amplia gama de socios endosímbióticos, incluyendo virus, arqueas, bacterias, protistas, hongos, y más notablemente, miembros de la familia de dinoflagelados de algas Symbiodiniaceae³. Los cambios en el medio ambiente pueden causar desequilibrios en esta comunidad, a menudo dando lugar a brotes de enfermedades y blanqueo de corales en los que las Simbióticas Symbiodiniaceae son expulsadas de la colonia de coral, eliminando así la principal fuente de nutrición para el coral. Ambos escenarios a menudo causan la muerte del huésped de coral^4,5,6. Los efectos de los factores estresantes inducidos por antropogénicos, como el rápido cambio climático, están acelerando los eventos masivos de muerte de coral, lo que conduce a un declive global de los arrecifes de coral⁷.

Recientemente, se han desarrollado muchos métodos diferentes para ayudar a mitigar la pérdida de arrecifes de coral. Estos métodos incluyen la desplantación de corales en arrecifes existentes, el cruce genético utilizando genotipos térmicamente tolerantes, y la manipulación celular de las comunidades microbianas y simbióticas alojadas dentro del coral^8,,9. A pesar de estos esfuerzos, mucho sigue siendo desconocido sobre la diversidad de células de coral y la función celular^10,11,12,13. Una comprensión profunda de la diversidad del tipo de células de coral y la función celular es necesaria para entender cómo el organismo coralino se comporta bajo condiciones normativas y estresantes. Los esfuerzos para maximizar la restauración y la eficiencia de la preservación se beneficiarán de una mejor comprensión de cómo se acoplan la diversidad celular y la función génica.

Los trabajos previos sobre diversidad y función celular se han centrado principalmente en estudios histológicos y muestreo de ARN de tejido entero^14,15,16,17. Para obtener más detalles sobre la función de tipo celular específico en los corales, es necesario que existan métodos para el aislamiento de poblaciones específicas de células coralinas vivas. Esto se ha hecho con éxito en organismos modelo noclónicos mediante la tecnología de citometría de flujo activada por fluorescencia (FACS)¹⁸. FACS utiliza una combinación de láseres sintonizados con diferentes longitudes de onda para medir diferentes propiedades celulares endógenas a nivel de celda única, como el tamaño relativo de la célula, la granularidad celular y la autofluorescencia. Además, las células pueden estar marcadas por compuestos con etiqueta fluorescente para medir las propiedades específicas deseadas^18,19.

Hasta ahora, la aplicación de la citometría de flujo a las células de coral ha sido principalmente para el análisis de Symbiodiniaceae simbióticas y otras poblaciones bacterianas mediante la utilización de su fuerte autofluorescencia natural^20,,21,22. FACS también se ha utilizado para estimar el tamaño del genoma del coral mediante el uso de señal marcador de ADN fluorescente en comparación con las células del organismo modelo de referencia^23,24. La aplicación eficiente de FACS proporciona tres herramientas distintas que son útiles para los estudios de biología celular: 1) descripción morfológica y funcional de células individuales; 2) identificación, separación y aislamiento de poblaciones celulares específicas para estudios posteriores; y 3) el análisis de ensayos funcionales a nivel de célula única.

El desarrollo y aplicación de varios marcadores fluorescentes exógenos para el estudio de las células de coral sigue siendo casi inexplorado. Tales marcadores pueden incluir proteínas etiquetadas, sustratos etiquetados para enzimas o respuestas fluorescentes a otros compuestos. Estos marcadores se pueden utilizar para identificar tipos de celdas que tienen propiedades únicas, como resaltar celdas que producen cantidades variables de una característica de compartimiento celular específica, como los lisosomas. Un ejemplo adicional es el uso de perlas con etiqueta fluorescente para identificar funcionalmente las células competentes para la fagocitosis, o el engullimiento de un patógeno objetivo²⁵. Las poblaciones de células activas en las respuestas de inmunidad pueden ser fácilmente identificadas por el FACS después del engullimiento de estas cuentas aplicadas exógenamente. Mientras que los métodos histológicos tradicionales requieren tejido preservado y muchas horas para aproximar el porcentaje de células positivas para el engullimiento de las cuentas, un ensayo funcional basado en FACS para el engullido patógeno se puede realizar relativamente rápidamente en células vivas aisladas. Además de estudiar las respuestas específicas de las células al estrés, esta tecnología tiene el potencial de aclarar la expresión específica del gen e iluminar la historia evolutiva y de desarrollo de tipos celulares totalmente únicos de los cnidarios, como calicoblastos y cnidocitos.

Recientemente, realizamos un cribado intensivo de más de 30 marcadores celulares que resultó en identificar 24 que son capaces de etiquetar células de coral, 16 de las cuales son útiles para distinguir poblaciones únicas^18,convirtiéndolas en grupos de diferenciación (CD). Aquí describimos el proceso de aislamiento de células de coral en Pocillopora damicornis de la eliminación de células del esqueleto de carbonato de calcio hasta la identificación y aislamiento de poblaciones celulares específicas con FACS (Figura 1).

Protocolo

1. Disociación de tejidos del esqueleto de coral a través de aerógrafo y compresor

NOTA: Realice pasos sobre hielo y proteja las manos con guantes.

1. Montar el kit de aerógrafo conectando el compresor de aire, la manguera y el aerógrafo (Figura 2). Ajuste el manómetro entre 276 x 483 kPa.
   NOTA: El compresor y la manguera de aire recomendados para este estudio se preestablecieron a una presión máxima de 393 kPa. El uso fuera de este rango de 276-483 kPa puede resultar en la eliminación celular inadecuada del esqueleto o la ruptura de las membranas celulares. Este rango puede diferir para cada especie y puede requerir una prueba de viabilidad. Se puede realizar una prueba de viabilidad con un subconjunto de la mezcla celular con un hemociclomekilido simple y un ensayo de exclusión de tinte de 4o,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI), visualizado en un microscopio compuesto.
2. Preparar 100 ml de medios de tinción celular en un autoclavado, recipiente de vidrio estéril añadiendo 33 ml de solución salina tamponada 10x fosfato (PBS; sin calcio y magnesio) a una concentración final de 3,3x, 2 ml de suero de ternera fetal (FCS; calor inactivado a 56 oC durante 30 min) a 2% del volumen total, y 2 ml de búfer HEPES de 1 M a una concentración final de 20 mM. A continuación, respete a 100 ml con agua estéril.
   NOTA: La concentración de 3,3 pbS se eligió para imitar la salinidad del agua de mar, como se demuestra en Rosental et al.¹⁸. Esta concentración debe ajustarse para que las especies que se encuentran en otros ambientes imiten su salinidad.
3. Transfiera 10 ml de medios de tinción celular a una botella de aerógrafo (etiquetada "F" en la Figura 2)y conecte la tapa del adaptador para el conector del aerógrafo.
   NOTA: Los fragmentos más grandes y las especies con capas de tejido más gruesas pueden requerir más medios para la extracción adecuada de tejido.
4. Para las especies de coral ramificadas que se muestran aquí, utilice un cortador de huesos para cortar o cortar un fragmento de coral de aproximadamente 3 x 5 cm de longitud o 4 cm² de área.
   NOTA: El fragmento debe estar libre de macroalgas y otros organismos multicelulares porque estos no pueden ser eliminados de la muestra aguas abajo y contaminarán la muestra durante los procesos de análisis y clasificación de FACS. Un fragmento de 1 cm de P. damicornis da aproximadamente 2 x 10 x 10⁶ células después de filtrar, tinción y lavado.
5. Coloque el fragmento de coral dentro de una bolsa de plástico y utilice el aerógrafo para rociar los medios de tinción celular sobre el coral (Figura 2). Continúe este proceso hasta que la mayor parte del esqueleto quede expuesto. Retire el esqueleto restante de la bolsa de colección.

2. Disociación de células del tejido coral ánsúnico

NOTA: Realice todos los pasos sobre hielo y proteja las manos con guantes.

1. Filtrar la suspensión celular a través de un colador de células de nylon de 40 m en un tubo centrífugo de 50 ml para obtener una suspensión de una sola célula.
   NOTA: Diferentes tamaños de malla de colador celular pueden ser más apropiados para diferentes especies. Sin embargo, tamaños más grandes pueden resultar en una disociación inadecuada del tejido debido al paso de escombros y grumos celulares.
   1. Para muestras con capas de moco más gruesas, utilice el émbolo esterilizado de una jeringa de plástico de 1 ml y muele suavemente contra el filtro para romper los grumos y ayudar a las células a pasar a través del colador. Enjuague el colador y el émbolo con medios de tinción celular en el tubo centrífugo.
2. Pele el gestion de las células por centrifugación a 4oC a 450 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante y resuspenda las células en 1 ml de medios de tinción celular.

3. Mancha de células

NOTA: Realice todos los pasos sobre hielo y proteja las manos con guantes. Las manchas que aparecen en este protocolo son para fines de representación. Las manchas alternativas requerirán diferentes concentraciones y tiempos de incubación.

1. Transfiera 500 l de células resuspendidas a un tubo de fondo redondo de 5 ml y reserve como muestra de control. No añada manchas a esta alícuota.
2. A la suspensión celular restante, añada 0,42 l de tinte de viabilidad DAPI de 12 mM(Tabla de materiales),1 l de una tinción de oxígeno reactivo (ROS) de 5 m (Tablade materiales)y 0,1 l de mancha de lisosomas de 0,2 M(Tabla de materiales). Pipetear bien para mezclar e incubar sobre hielo durante 30 minutos en la oscuridad para evitar el fotoblanquetado.
   NOTA: DAPI se utiliza en este ejemplo para trabajar como una mancha de ADN y tinte de viabilidad para el gating diferencial de células muertas en la máquina FACS. Esto supone que DAPI penetra en las células moribundas debido a la integridad de la membrana. La mancha ROS emite luz en el rango de 520 nm (verde), mientras que el marcador lisosomal emite luz a aproximadamente 668 nm (rojo).
3. Pellet 500 l de las células manchadas por centrifugación a 4 oC a 450 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante y resusppend el pellet en 500 s de medios de tinción celular. Transfiera a un nuevo tubo de fondo redondo de 5 ml y guárdelo en hielo.

4. Inicio de FACS

NOTA: Los pasos pueden variar según la marca y el modelo del citómetro debido a las diferencias en los láseres y canales. Para este protocolo, se utilizó un citometro con láseres de longitud de onda 405, 488, 535 y 640 nm. Los filtros que aparecen en este protocolo son para fines de representación. Las manchas celulares alternativas pueden requerir un conjunto diferente de filtros y láseres.

1. Comience a crear una nueva plantilla de proyecto en el software clasificador y elija el panel láser. Para la combinación representada de manchas y fluorescencia natural, seleccione los cuatro láseres (405, 488, 535 y 640 nm).
2. Seleccione los filtros adecuados para cada color esperado representado en el experimento.
   1. Para detectar la emisión DAPI y ayudar en la separación de células vivas y muertas, utilice un filtro con un paso de banda (BP) de 450/50 (rango de 425 a 475 nm) como un filtro DAPI, Hoeschst o Pacific Blue.
   2. Para la detección de la luz emitida por la señal ROS verde, utilice un filtro con una presión BP de 530/30 (rango de longitud de onda de 515-545 nm) como un filtro de isotiocianato de fluoresceína (FITC) o proteína fluorescente verde (GFP). Este filtro medirá la concentración de ROS en cada célula.
   3. Agregue un filtro adicional con una presión arterial de 670/30 (rango de 655 x 685 nm) como un filtro de aloficocian (APC) para la detección de la emisión de manchas lisosomales.
      NOTA: El canal APC permitirá la medición de la actividad fagocítica. Este canal también detectará la autofluorescencia generada por el coral de algas simbióticas de la familia Symbiodiniaceae. Sin embargo, esta señal se puede separar utilizando un canal adicional que tenga una longitud de onda más larga que el filtro APC.
   4. Incluya un filtro que tenga una presión arterial de 780/60 (rango de 750-810 nm), como la fitoerytrina más utilizada, filtro de cianina (APC-Cy7), que detecta la emisión de autofluorescencia de color rojo lejano de Symbiodiniaceae y ayuda en el aislamiento de las células aposymbióticas.

5. Configuración de gating FACS

NOTA: Los pasos pueden variar según la marca y el modelo del citómetro y el programa de adquisición junto con el citómetro.

1. En la pantalla experimental del proyecto del software de citometría, cree una gráfica de dispersión y seleccione la dispersión hacia delante (FCS) como la métrica para el eje X y la dispersión lateral (SSC) para el eje Y.
   NOTA: FCS se correlaciona con el tamaño de la célula y SSC se correlaciona con la granularidad. Esto permitirá la eliminación de la mayoría de los desechos, ya que la mayoría será de menor tamaño que las células intactas.
2. Establezca los ejes en escalas logarítmicas o biexponenciales, ya que los tamaños de celda y la granularidad pueden variar en varios órdenes de magnitud(Figura 3A),particularmente en corales.

6. Análisis FACS y aislamiento celular

NOTA: Los pasos pueden variar según la marca y el modelo del citómetro y el programa de adquisición acoplado.

1. Coloque el control (es decir, el subconjunto de células no manchada) en la cámara de muestra del citómetro e inicie el proceso de lectura. Cuando el equipo comienza a recibir datos de cada celda o evento, los puntos comenzarán a aparecer en el gráfico de dispersión. Para eliminar los restos que queden en las cámaras del citometro de experimentos anteriores, permita que pasen aproximadamente 30 s antes de iniciar el análisis.
2. En la gráfica de dispersión, ajuste la tensión del tubo fotomultiplicador (PMT) para centrar los puntos.
   NOTA: La tensión PMT se utiliza para amplificar la intensidad de la señal de los fotones que se miden; si el voltaje PMT es demasiado débil, se leerán menos celdas, y si el voltaje PMT es demasiado fuerte, las celdas se medirán cerca del valor máximo y diferentes tipos de celdas serán indistinguibles entre sí. Una tensión PMT adecuada garantiza que los eventos distinguibles independientemente poblarán la gráfica de dispersión. La separación de eventos es más fácil de visualizar mediante la proyección de escalas logarítmicas o biexponenciales en las gráficas de dispersión FSC y SSC.
3. Comience a grabar los eventos. Para conservar el ejemplo, detenga la adquisición de datos después de que se hayan leído aproximadamente 15.000 eventos. En la mayoría de los casos, esto será adecuado para visualizar los patrones generales de población celular. Registre más eventos si analiza y aísla poblaciones celulares pequeñas y especializadas.
4. En el primer gráfico de FSC y SSC, cree una selección, o puerta, de las celdas alrededor de la marca 10² y superior en el eje X FSC. Cualquier cosa por debajo de este umbral es probable que los desechos celulares. Dibuje puertas rectangulares, que es una opción regular en programas de software de citometría de flujo y buena para poblaciones celulares claras y distintas. Para las poblaciones de celdas que toman una forma más irregular en las gráficas de dispersión, utilice una opción de medición poligonal.
   NOTA: Un límite mínimo de 10² en la dispersión hacia adelante debe seleccionar para las células de coral más pequeñas, pero puede permitir la contaminación de los desechos. Para enmendar esto, aumente el límite inferior de la gating para ser más conservador.
5. Cree un nuevo gráfico de dispersión que exprese el filtro DAPI en el eje X y el filtro APC-Cy7 en el eje Y. Para ello, seleccione la puerta para las celdas intactas creadas en el paso 6.4, haga clic con el botón derecho y seleccione la opción para crear un nuevo gráfico de dispersión. Ajuste los ejes a escalas logarítmicas o biexponenciales.
   NOTA: Los pasos necesarios para crear una nueva gráfica pueden variar con diferentes programas de software.
6. Ahora retire la muestra de control de la cámara del citometro y sustitúyala con las células manchadas. Permita que pasen 30 s antes de iniciar el análisis y registrar los datos. Registre aproximadamente 15.000 celdas antes de hacer una pausa.
   NOTA: Las poblaciones distintas en el extremo superior de la escala APC-Cy7 son aquellas con alta autofluorescencia roja de Symbiodiniaceae. No se necesita ninguna mancha para visualizar estas roturas de población, y también se pueden ver en la grabación de muestra de control (Figura 3C). Seleccione para las poblaciones solo de coral, las más bajas en el eje Y, para una mayor diferenciación.
7. Cree una nueva gráfica de dispersión de las células aposintomáticas para visualizar las concentraciones de ROS (filtro FITC) y las celdas positivas a lisosomas (filtro APC), utilizando de nuevo escalas logarítmicas o biexponenciales.
   NOTA: Si hay varias poblaciones celulares distintas que son aposímbióticas, cada una se puede distinguir aún más en su propia gráfica de dispersión (Figura 3C,D).
8. Compare el grupo de muestras manchado con el subconjunto no detenido del control mediante la primera grabación de la muestra de control o reinsertando y volviendo a ejecutar el grupo de control. Puerta de los eventos que son exclusivos del grupo de muestra manchado.

7. Clasificación y recogida de FACS

NOTA: Los pasos pueden variar según la marca y el modelo del citómetro y el programa de adquisición junto con el citómetro.

1. Con una selección de células elegidas para recoger, coloque los tubos de microcentrífuga (que contienen 250-500 l de medios de cultivo celular o tampón de lysis basado en el número de células recogidas y el método de almacenamiento) en la cámara de recolección del citometro.
   NOTA: El citómetro de flujo representado es capaz de clasificar cuatro poblaciones diferentes a la vez, y la máquina se puede configurar para contener una variedad de dispositivos de recolección, incluyendo varios tubos de centrífuga y 96 placas de pozo.
2. Una vez que el citómetro comienza a leer la muestra y ha pasado una cantidad adecuada de tiempo para eliminar los escombros, comience a clasificar las poblaciones deseadas y recoja entre 20.000 células hasta varios millones.
   1. Para más de 500.000 celdas, ajuste el volumen de medios de cultivo de celdas o búfer de lysis y el volumen del dispositivo de recopilación.
   2. Para estudios in vitro, almacene las células en hielo hasta que se coloquen en una incubadora o en un entorno esterilizado.
   3. Para estudios moleculares, inicie inmediatamente el proceso de aislamiento de ADN/ARN/proteína o congele el flash y guárdelo a -80 oC hasta la extracción.
3. Cada vez que se utiliza una nueva mancha, especie o clasificador, realice una comprobación de pureza de la población de interés clasificando al menos 20.000 células de interés en 500 oL de medios de tinción, luego vuelva a analizar las celdas ordenadas y confirme que las celdas se están leyendo dentro de la puerta utilizada para ordenar inicialmente (Figura 4).

Resultados

En general, este protocolo es útil porque facilita la identificación y recolección de poblaciones de células de coral vivas que se pueden utilizar para análisis funcionales. El flujo de trabajo comenzó con la separación mecánica de los tejidos corales del esqueleto de carbonato de calcio subyacente (Figura 1). Este es uno de los pasos iniciales más importantes porque una técnica inadecuada resulta en una alta mortalidad celular y puede crear grandes cantidade...

Discusión

Este protocolo fue adaptado de Rosental et al.¹⁸ y desarrollado para la identificación y aislamiento de células P. damicornis. La metodología se centra en el proceso de filtrado de muestras para eliminar desechos, células no viables y células alojadas en Symbiodiniaceae a través del examen de factores intrínsecos celulares, incluyendo el tamaño relativo de la célula, la granularidad relativa de las células, la autofluorescencia celular y la presencia de membranas celulares intactas. Estas...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Kit de aerógrafo & Compresor	TCP Global	ABD KIT-H-SET	Paasche H Series Kit de aerógrafo de alimentación de sifón de acción simple con compresor Master TC-20 & manguera de aire
BD FACSAria II	BD	644832
cortadores de huesos	a granel		de arrecifes 205357 Oceans Wonders Coral Stony Bone Cutter
Cell Strainer Corning		352340	40 mmm; BD Halcón; envueltos individualmente; estéril; nylon
CellRox Green	Life Technologies	C10444	2,5 mM en DMSO; Excitación/Emisión: 485/520 nm
Bolsa de recolección	Grainger	38UV35	Reloc Zippit 6"L x 4"W Bolsa de polietileno recerrable estándar con cierre de cierre de hermética, transparente; 2 mil de espesor
DAPI	Invitrogen	D1306	10mg en H2O; Excitación/Emisión: 358/461 nm
Suero de ternera fetal	Sigma-Aldrich	F2442-100ML	Inactivado por calor a 57 ° C durante 30 minutos
Hemacitómetro	Sigma-Aldrich Z359629		Bright-Line Hemacitómetro
HEPES Buffer	Sigma-Aldrich	H0887
LysoTracker Deep Red	Life Technologies	L12492	1mM en DMSO; Absorción/Emisión: 647/668 nm
Tubos de microcentrífuga	VWR	87003-294	1,7 mL
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Gibco	70011-044	pH 7,4; 10X
Tubos de fondo redondo	VWR 352063		5 mL Polipropileno Jeringa de tubo de fondo redondo
	BD 309628		1 mL BD Luer-Lok Jeringa estéril, de un solo uso policarbonato