Artículo de método

Uso de embriones de pez cebra Tg(Vtg1:mcherry) para probar los efectos estrogénicos de los compuestos disruptores endocrinos

DOI:

10.3791/60462

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8 de agosto de 2020

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1Department of Aquaculture, Institute of Aquaculture and Environmental Safety, Faculty of Agricultural and Environmental Sciences, Szent István University, 2Institute of Cancer and Genomic Sciences, College of Medical and Dental Sciences, University of Birmingham

En este artículo

Resumen

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Presente aquí es un protocolo detallado para el uso de embriones de pez cebra Tg(vtg1: mCherry) para la detección de efectos estrogénicos. El protocolo abarca la propagación de los peces y el tratamiento de embriones, y hace hincapié en la detección, documentación y evaluación de señales fluorescentes inducidas por compuestos disruptores endocrinos (EDC).

Resumen

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Hay muchos compuestos disruptores endocrinos (EDC) en el medio ambiente, especialmente sustancias estrogénicas. La detección de estas sustancias es difícil debido a su diversidad química; por lo tanto, se utilizan cada vez más métodos de detección de efectos, como los organismos biomonitor/bioindicador sensibles al efecto estrogénico. Estos organismos biomonitores incluyen varios modelos de peces. Este protocolo abarca el uso de la línea transgénica Tg(vtg1: mCherry) de peces cebra como organismo biomonitorio, incluida la propagación de peces y el tratamiento de embriones, con énfasis en la detección, documentación y evaluación de señales fluorescentes inducidas por la EDC. El objetivo del trabajo es la demostración del uso de los embriones de línea transgénica Tg(vtg1: mCherry) para detectar efectos estrogénicos. Este trabajo documenta el uso de embriones transgénicos de pez cebra Tg(vtg1: mCherry) para la detección de efectos estrogénicos mediante la prueba de dos sustancias estrogénicas, el zearalenol. El protocolo descrito es sólo una base para diseñar ensayos; el método de prueba puede variar según los puntos finales de prueba y las muestras. Además, puede combinarse con otros métodos de ensayo, facilitando así el uso futuro de la línea transgénica.

Introducción

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Hay un número significativo de compuestos disruptores endocrinos (EDC) que se encuentran entre las sustancias más peligrosas en nuestro medio ambiente. Estos son principalmente compuestos estrogénicos que contaminan el agua de los recursos naturales. La diversidad química de las sustancias pertenecientes al grupo dificulta las pruebas de su presencia, ya que se requieren diferentes métodos analíticos para su detección. Basado en su estructura química es muy difícil determinar si una sustancia es realmente capaz de actuar como un estrógeno. Además, estas sustancias nunca están presentes en forma pura en el medio ambiente, por lo que sus efectos pueden verse afectados por otros compuestos, demasiado1. Este problema se puede resolver mediante métodos de detección de efectos, como el uso de biomonitor/bioindicador organismos que muestran efectos estrogénicos2,3,4,5.

Recientemente, una variedad de línea celular6 y sistemas de prueba basados en levadura2,3 se han desarrollado para detectar efectos estrogénicos. Sin embargo, estos son generalmente sólo capaces de detectar la unión de la sustancia al receptor de estrógeno2,3. Además, son incapaces de modelar procesos fisiológicos complejos en el organismo, o para detectar fases sensibles a las hormonas de las etapas de la vida; por lo tanto, a menudo conducen a resultados falsos.

Se sabe que ciertos genes reaccionan sensiblemente al estrógeno en organismos vivos7. La detección de productos genéticos por métodos de biología molecular también es posible en el nivel de proteína o ARNm8,9, pero por lo general implica sacrificio animal. Las leyes de protección animal se han vuelto más estrictas, y existe una creciente demanda de sistemas de ensayo alternativos que minimicen el número y el sufrimiento de los animales utilizados en experimentos o la sustitución del modelo animal por otro modelo10. Con el descubrimiento de proteínas fluorescentes y la creación de líneas de biomarcadores, las tecnologías transgénicas proporcionan una buena alternativa11. Con estas líneas, la activación de un gen sensible al estrógeno se puede probar in vivo.

Entre los vertebrados, el potencial de los peces en la evaluación del riesgo ambiental es excepcional. Ofrecen muchas ventajas sobre los modelos de mamíferos: al ser organismos acuáticos, son capaces de absorber contaminantes a través de todo su cuerpo, producir un gran número de crías, y algunas de sus especies se caracterizan por un corto tiempo de generación. Su sistema endocrino y procesos fisiológicos muestran grandes similitudes con otros vertebrados e incluso con mamíferos, incluidos los humanos12.

También se conocen varios genes para la detección de efectos estrogénicos en peces. Los más importantes son los receptores de estrógeno aromatasa-b, coriogenina-H, y vitellogenina (vtg)7,13. Recientemente, varias líneas de biosensores productores de estrógenos también se han creado a partir de modelos de peces utilizados en el laboratorio, como de pez cebra (Danio rerio)4,5,14,15,16,17. La principal ventaja del pez cebra en la creación de líneas de biosensor es el cuerpo transparente de los embriones y larvas, ya que la señal de reportero fluorescente puede entonces ser fácilmente estudiada in vivo sin sacrificar al animal10. Además de la protección animal, también es una característica valiosa ya que permite estudiar la reacción del mismo individuo en diferentes momentos del tratamiento18.

Estos experimentos utilizan un reportero de vitellogenin linótez de la línea15. La construcción transgene utilizada para el desarrollo de Tg(vtg1:mCherry) tiene un largo (3,4 kbp) promotor natural vitellogenin-1. El receptor de estrógeno (ER) es una proteína potenciadora activada por ligandos que es un representante de la superfamilia de los receptores de esteroides /nuclear. ER se une a secuencias de ADN específicas llamadas elementos de respuesta de estrógeno (EERE) con alta afinidad y transactiva la expresión génica en respuesta al estradiol y otras sustancias estrogénicas, por lo que cuanto más ERE en el promotor causa una respuesta más fuerte19. Hay 17 sitios ERE en la región promotora de la construcción transgén de Tg(vtg1:mCherry) y se espera que imitan la expresión del gen vtg nativo15. Hay una expresión continua de la señal fluorescente en hembras maduradas sexualmente. Sin embargo, en varones y embriones la expresión en el hígado sólo es visible en el tratamiento con sustancias estrogénicas (Figura 1).

figure-introduction-1
Figura 1: Señal fluorescente roja en el hígado de vg1:mCherry transgenic adult zebrafish y 5 dpf embryos, después de 17-estradiol (E2) inducción. En hembras y en hombres tratados con E2 (25 g/L de tiempo de exposición:48hrs) la fuerte fluorescencia del hígado es visible incluso a través de la piel pigmentada. No se puede ver ninguna señal fluorescente en los machos no tratados (A). Después de la inducción de E2 (50 g/L de tiempo de exposición: 0-120 hpf), también se puede observar una señal fluorescente roja en el hígado de embriones de 5 dpf, que no es visible en los embriones de control (B). Mientras que la señal fluorescente está continuamente presente en las hembras adultas, principalmente los machos y embriones de la línea son adecuados para detectar efectos estrogénicos. (BF: campo brillante, mCherry: vista de filtro fluorescente rojo, imágenes simples, barra de escala A: 5 mm, barra de escala B: 250 m) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Al igual que la vitellogenina endógena, el reportero de mCherry sólo se expresa en el hígado. Debido a que la vitellogenina sólo se produce en presencia de estrógeno, no hay señal fluorescente en los controles. Debido a que la expresión está sólo en el hígado, la evaluación de los resultados es mucho más fácil15.

La sensibilidad y usabilidad de los embriones de esta línea se han investigado en diversas mezclas de compuestos estrogénicos y también en muestras ambientales15,20, y en la mayoría de los casos se documentaron las relaciones dosis-respuesta ( Figura2). Sin embargo, en el caso de sustancias altamente tóxicas, principalmente hepatotóxicas ,por ejemplo, zearalenona), sólo una señal fluorescente muy débil puede ser visible en el hígado de embriones tratados y la señal fluorescente de intensidad máxima causada puede alcanzarse dentro de un rango de concentración muy pequeño, lo que dificulta el establecimiento de relaciones dosis-efecto20.

figure-introduction-2
Figura 2: Diagrama de dosis-respuesta (A) e imágenes fluorescentes (mCherry) del hígado (B) expuestos a 17-etilestradiol (EE2), en 5 dpf vtg1:mCherry larvas. Los resultados se expresan como densidad integrada generada a partir de la intensidad de la señal y el tamaño de la zona afectada (-SEM, n a 60). 100% se refiere al máximo observado. La intensidad de la señal fluorescente aumentó gradualmente con la concentración. Barra de escala de 250 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Hay varias sustancias estrogénicas presentes en el medio ambiente, tales como 17-í-estradiol (concentración ambiental: 0,1–5,1 ng/L)21, 17-etilestradiol (concentración ambiental: 0,16–0,2 g/L)22, zearalenona (concentración ambiental: 0,095–0,22 g/L)23, bisfenol-A (concentración ambiental: 0,45–17,2 mg/L)24. Al probar estas sustancias en forma activa pura con la ayuda de embriones transgénicos mCherry, las concentraciones de efecto observadas más bajas (LOEC) para la detección de signos fluorescentes fueron 100 ng/L para 17-és-estradiol, 1 ng/L para 17-etilestradiol, 100 ng/L para zearalenona y 1 mg/L para el tratamiento con bisfenol-A (96–120 hpf), que está muy cerca o dentro del rango de concentraciones ambientales de las sustancias15. La línea transgénica Tg(vtg1:mCherry) puede ayudar a detectar la estrofica en muestras de aguas residuales después de la exposición directa. La línea es tan sensible como la prueba de estrógeno de levadura de uso común, el ensayo de estrógeno de levadura bioluminiscente (BLYES)15. Con la ayuda de esta línea, se han confirmado los efectos protectores de las beta-ciclodextrinas contra la toxicidad inducida por zearalenona utilizando mezclas químicas20.

En un informe reciente, el uso in vivo de la línea transgénica se demostró con la ayuda de dos metabolitos estrogénicos de zearalenona (ZEA), los anudalenol de los ácidos (ZEA) y los a-zearalenol (a-ZOL y a-ZOL)25. La línea de base del protocolo es apropiada para estudiar los efectos estrogénicos de varios compuestos o muestras ambientales en embriones Tg(vtg1:mCherry).

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Protocolo

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El Protocolo de los Animales fue aprobado en virtud de la Ley Húngara de Bienestar Animal y todos los estudios se completaron antes de que los individuos tratados hubieran llegado a la etapa de alimentación libre.

1. Cosecha y tratamiento de embriones

  1. Mantener el pez cebra Tg(vtg1:mCherry) a 25,5 a 0,5 oC, pH a 7 a 0,2, conductividad entre 525 s/m, nivel de oxígeno al 80 % de saturación y 14 horas de luz y 10 h de ciclo de oscuridad.
  2. Llene los tanques de apareamiento con agua del sistema y configure el pescado para aparearse la tarde antes de cosechar los huevos.
  3. Coloque el pez macho y hembra en el tanque y sepárelos con la ayuda de un divisor.
  4. Retire el divisor de los tanques mientras la luz se enciende a la mañana siguiente. Revise los tanques de apareamiento en busca de huevos cada 15-20 min.
  5. Cosecha todos los embriones usando un colador de té o una malla fina densamente tejida y combínalos en una placa grande de Petri con tampón E3 (cloruro de sodio de 5 mM, cloruro de potasio de 0,17 mM, cloruro de calcio de 0,33 mM, sulfato de magnesio de 0,33 mM) o agua clara del sistema.
  6. Colocar los embriones en la incubadora establecido en 25,5 a 0,5 oC.
  7. Después de 1–1.5 h, retire y deseche los huevos no fertilizados o que dividan inadecuadamente con una tubería de transferencia de plástico bajo un microscopio diseccionado.
    NOTA: Los huevos no fertilizados son opacos; los óvulos fertilizados son transparentes. Para iniciar el tratamiento en una etapa posterior de desarrollo, preste atención al desarrollo normal de las personas que están siendo tratadas.
  8. Coloque los embriones seleccionados en los recipientes de tratamiento (por ejemplo, en platos petri o placas de cultivo de tejidos) que ya hayan sido etiquetados y llenos de diferentes concentraciones de la sustancia de ensayo.
  9. Incubar los embriones a 25,5 oC a 0,5 oC hasta el final del experimento.
    NOTA: Los embriones pueden reaccionar con una sensibilidad individual significativa a varios compuestos estrogénicos, por lo que se recomienda utilizar al menos 15 embriones en al menos tres tratamientos repetidos para evaluar el experimento correctamente. Al seleccionar el recipiente, tenga en cuenta que el desarrollo de un embrión requiere al menos 200 l de agua26. En este experimento, los embriones se incubaron hasta 120 cvf a 25,5 a 0,5 oC.
  10. Actualice la solución de prueba si es necesario mantener la concentración del tratamiento. Tenga cuidado al cambiar la solución de prueba para evitar dañar los embriones.
    NOTA: También es posible investigar la mortalidad o los síntomas subletales durante el experimento. Las concentraciones utilizadas deben permanecer lo más estables posible para obtener resultados fiables. Esto se puede lograr fácilmente actualizando las soluciones de prueba. La frecuencia de actualización puede variar dependiendo de la sustancia de ensayo. Por lo tanto, es aconsejable comprobar la concentración de la sustancia de ensayo mediante mediciones analíticas para determinar la frecuencia de las actualizaciones de la solución.

2. Preparación de larvas para la fotografía

  1. Preparar 4% metilcelulosa con MS-222 (tricaine-mena-sulfonato) de antemano.
    1. Para ello, añadir 4 mg/ml de MS-222 a 100 ml de agua destilada doble a una concentración final de 0,168 mg/ml, y llevar la solución a 4 oC. A continuación, agregue 4 g de metilcelulosa. Revuelva con un agitador magnético, luego déjelo en 4 oC durante la noche.
    2. Al día siguiente, revuelva de nuevo y la solución debe estar lista para usar. Si la metilcelulosa no se disuelve por completo, vuelve a colocarla a 4oC y espera unas horas más.
  2. Coloque larvas de 5 días de edad en un plato Petri de 5 cm por grupo de tratamiento con una pipeta Pasteur.
  3. Retire la solución de tratamiento de las larvas con una pipeta de plástico, luego llene el plato Petri con 2 ml de solución anestésica 0.02% MS-222.
    NOTA: La anestesia suele ser eficaz en menos de un minuto. Las larvas son anestesiadas si no nadan en respuesta al tacto. Una sobredosis de MS-222 puede matar a las larvas.
  4. Llene cada cuadrado de un plato Petri de 10 cm especialmente diseñado con 4% de metilcelulosa con MS-222 (Figura 3).
    NOTA: Pegue dos áreas cuadradas de 1,5 x 1,5 cm en la parte inferior del plato Petri utilizando láminas de plástico (1 mm de altura, 5 mm de ancho). Veinte larvas se pueden colocar una al lado de la otra en un cuadrado. En lugar de un plato Petri especialmente diseñado, se puede utilizar otro recipiente de borde bajo para fijar la posición de los embriones.

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Figura 3: Un plato Petri de 10 cm con pegamento de 1,5 x 1,5 cm de ancho, cuadrados de lámina de plástico de 1 mm de espesor para la preparación de larvas para la fotografía. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Transfiera las larvas anestesiadas a metilcelulosa con un poco de agua en uno de los dos cuadrados. Desde la primera plaza transfiera las larvas a la segunda plaza.
    NOTA: Con la ayuda de esta transferencia, la metilcelulosa del 4% utilizada para la fotografía no se diluirá y las larvas no rotarán durante la toma de imágenes.
  2. En el segundo cuadrado, gire y oriente las larvas hacia su lado izquierdo y presione suavemente hacia abajo hasta el fondo de la celulosa con una punta de pipeta de microcargador cortada hasta 2 cm.
    NOTA: No utilice otras puntas de pipeta porque causan lesiones en las larvas.

3. Microscopía

NOTA: La fotografía no mata a los animales. Los animales pueden ser despertados quitándolos de la metilcelulosa y colocándolos en agua fresca del sistema o solución de tratamiento, por lo que el mismo individuo puede ser examinado varias veces durante el tratamiento.

  1. Para evaluar la señal del reportero expresado, imagine los embriones con la misma vista y configuración.
    NOTA: Consulte el paso 2.6 para un posicionamiento óptimo del embrión. Las fotos en el manuscrito fueron tomadas bajo las condiciones descritas. Campo brillante: aumento de 60x, exposición de 6 ms, iris 100%, ganancia:1.1, fotos de fluorescencia: aumento de 60x, exposición de 300 ms, iris: 100%, ganancia:1, filtro mCherry, fuente de luz fluorescente: bombilla de halogenuros de metal de mercurio. Para tomar fotos se utilizó un estereomicroscopio fluorescente, una cámara dedicada y un software para el microscopio.
  2. Coloque el plato Petri en el escenario del microscopio.
  3. Concéntrese en el hígado del embrión y capture una imagen de campo brillante utilizando el software asociado.
  4. Cambie el microscopio al filtro mCherry y tome una imagen fluorescente del hígado bajo luz fluorescente utilizando el software asociado.
    NOTA: Realice todos los pasos de fluorescencia en la oscuridad. No cambie el aumento, el enfoque o la posición del embrión entre la captura del campo brillante y las imágenes fluorescentes, ya que esto ayudará en el análisis de las imágenes.
  5. Repita los pasos 3.3 y 3.4 hasta que se hayan evaluado todos los embriones del experimento.

4. Determinación de la densidad integrada

NOTA: Uno de los mejores indicadores para comparar la intensidad de la señal fluorescente es el valor de densidad integrado (es decir, el producto del área y el valor gris medio). Una de las formas más fáciles de determinar la densidad integrada es utilizar el programa ImageJ27. El programa está disponible en Internet y se puede instalar en el ordenador.

  1. Abra ImageJ y, a continuación, cargue la imagen fluorescente que se analizará arrastrando y soltando la imagen o haciendo clic en Archivo. Abrir.
  2. Haga clic en Imagen . . . . . . . . . . Color ? Dividir canales para dividir la imagen realizada por el filtro fluorescente según la carta de colores RGB.
  3. Trabaje con el espectro de imágenes del canal rojo, cierre los otros canales.
  4. Designe un área elíptica de tamaño similar en la imagen para que las señales falsas no interfieran con la evaluación. Con las herramientas Oval, dibuje una elipse sobre el área hepática resaltada con la mayor precisión posible.
  5. Si la señal es débil, utilice imágenes de microscopía de luz (es decir, el par de campos brillantes de la imagen fluorescente) para determinar la ubicación del hígado.
  6. Haga clic en Analizar . Medir para determinar la intensidad de la señal y el tamaño de la zona afectada. El software calcula automáticamente el valor de densidad integrado en el gráfico.
  7. Continúe el análisis repitiendo los pasos 4.1–4.6 hasta que se analicen todas las imágenes fluorescentes de todos los embriones del grupo de tratamiento.
  8. Guarde los datos y, a continuación, analice los valores de densidad integrados.
    NOTA: Seleccione siempre el mismo tamaño de área en las imágenes durante el análisis. El tamaño del área a analizar depende de la ampliación, la resolución de la imagen, otros ajustes para la toma, etc. El análisis se puede acelerar o hacer más preciso mediante el uso de macros personales para el análisis. Por ejemplo, las macros se pueden utilizar para asegurarse de que el área seleccionada es siempre la misma en las imágenes examinadas. En el sitio web de ImageJ se encuentran descripciones detalladas para crear macros que permiten el mejor análisis de imágenes de acuerdo con la configuración de fotos en particular.

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Resultados

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En el experimento presentado en este manuscrito, los efectos de dos sustancias estrogénicas se probaron en cinco concentraciones comenzando en la fertilización durante 5 días en embriones de pez cebra Tg(vtg1:mCherry). Investigamos si las señales fluorescentes aparecieron en el hígado de los peces al final del tiempo de exposición debido a las sustancias y si había diferencias en la estrofia de las dos sustancias. Los resultados se evaluaron sobre la base de las imágenes fluorescentes y los valores de densidad i...

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Discusión

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El uso de biomonitores/bioindicadores para efectos estrogénicos se ha propagado en estudios toxicológicos. Los modelos in vivo desempeñan un papel sobresaliente, ya que a diferencia de las pruebas in vitro, no sólo proporcionan información sobre la respuesta de una célula o un receptor, sino que también permiten la investigación de procesos complejos en el organismo. Varias líneas transgénicas para el estudio de efectos estrogénicos se han producido a partir de peces cebra, uno de los cuales Tg(vtg1:mCherry) se ...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo contó con el apoyo de la Oficina Nacional de Investigación, Desarrollo e Innovación (NKFIH) del Fondo Nacional de Investigación, Desarrollo e Innovación (NKFIA); Acuerdo de subvención: proyecto NVKP_16-1-2016-0003, EFOP-3.6.3-VEKOP-16-2017-00008 cofinanciado por la Unión Europea, y el Programa de Excelencia Temática NKFIH-831-10/2019 de la Universidad Szent István, otorgado por el Ministerio de Tecnología y Innovación.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
placa de cultivo de tejidos de 24 pocillosJet BiofilTCP011024
Cloruro de calcio (CaCl2)Reanal Laborvegyszer Ltd.16383-0-27-39
Software GraphPad Prism 6.01Software GraphPad Software Inc.
Software ImageJInstitutos Nacionales de Salud, EE. UU.Software de acceso público, descargable desde: http://imagej.nih.gov/
Leica Application Suite X software calibradoLeica Microsystems GmbH.Utilizamos el softver descrito en los experimentos, pero cualquier software fotográfico cumple con las pruebas de
microscopio estereoscópico Leica M205 FA, cámara Leica DFC 7000TLeica Microsystems GmbH.Se utilizaron los equipos descritos en los experimentos, pero cualquier microscopio estereoscópico fluorescente es adecuado para las pruebas
de sulfato de magnesio (MgSO4)Reanal Laborvegyszer Ltd.20342-0-27-38
mFiltro de cerezaLeica Microsystems GmbH.
MetilcelulosaSigma Aldrich Ltd.
Punta de pipeta con microcargadorEppendorf GmbH.
pipeta PasteurVWR International LLC.612-1684
Placa de PetriJet Biofil TCD000060
Cloruro de potasio (KCl)Reanal Laborvegyszer Ltd.18050-0-01-33
Cloruro de sodio (NaCl)Reanal Laborvegyszer Ltd.24640-0-01-38
Tricano-metanosulfonato (MS-222)Sigma Aldrich Ltd.E10521
2744295242956003

Referencias

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