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Artículo de método

Control de las velocidades de flujo de fluidos activos 3D basados en microtúbulos mediante la temperatura

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DOI:

10.3791/60484

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26 de noviembre de 2019

 ,  ,  , 
1Department of Physics, Worcester Polytechnic Institute, 2Department of Physics, Brandeis University

En este artículo

Resumen

El objetivo de este protocolo es utilizar la temperatura para controlar las velocidades de flujo de los fluidos activos tridimensionales. La ventaja de este método no sólo permite regular las velocidades de flujo in situ, sino que también permite un control dinámico, como ajustar periódicamente las velocidades de flujo hacia arriba y hacia abajo.

Resumen

Presentamos un método para usar la temperatura para ajustar las velocidades de flujo de fluidos activos tridimensionales tridimensionales (3D) impulsados por la quinesina y basados en microtúbulos. Este método permite ajustar las velocidades in situ sin necesidad de fabricar nuevas muestras para alcanzar las diferentes velocidades deseadas. Además, este método permite el control dinámico de la velocidad. Ciclismo la temperatura lleva a los fluidos a fluir rápido y lento, periódicamente. Esta controlabilidad se basa en la característica de Arrhenius de la reacción de kinesina-microtúbulo, lo que demuestra un rango de velocidad de flujo medio controlado de 4-8 m/s. El método presentado abrirá la puerta al diseño de dispositivos microfluídicos donde los caudales en el canal son ajustables localmente sin necesidad de una válvula.

Introducción

La materia activa se diferencia de la materia pasiva convencional debido a su capacidad para convertir la energía química en trabajo mecánico. Un material que posee tal capacidad puede consistir en entidades vivas o no vivientes como bacterias, insectos, coloides, granos y filamentos citoesqueléticos1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Estas entidades materiales interactúan con sus vecinos. A mayor escala, se autoorganizan en vórtices turbulentos (turbulencia activa) o flujos materiales11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. La comprensión de la autoorganización de la materia activa ha dado lugar a diversas aplicaciones en transbordadores moleculares, dispositivos ópticos y cómputo paralelo21,22,23. Para llevar las aplicaciones al siguiente nivel se requiere control más allá de la autoorganización. Por ejemplo, Palacci y otros desarrollaron un coloide encapsulado de hematita que sólo se autopropulsado cuando se expone a la luz azul controlada manualmente, lo que llevó a la aparición de cristales vivos24. Morin y otros establecieron el control de la rodadura de los coloides de Quincke mediante el uso de un campo eléctrico externo ajustable, lo que resulta en bandadas coloidales en un canal25similar a una pista de carreras. Estos trabajos anteriores demuestran el papel del control local en las aplicaciones y avanzan en la base de conocimientos de la materia activa.

En este artículo, nos centramos en la controlabilidad de fluidos activos 3D basados en microtúbulos (MT) basados en kinesina. Los fluidos consisten en tres componentes principales: MTs, motores moleculares de kinesina y deplorantes. Los depilantes inducen una fuerza de agotamiento para agrupar los MT, que luego son puenteados por los racimos de motor. Estos motores caminan a lo largo del MTstoward el extremo más. Cuando un par de MTsis puenteados son antiparalelos, los motores correspondientes caminan en direcciones opuestas. Sin embargo, los motores están unidos en un racimo y son incapaces de separarse, por lo que se deslizan de forma cooperativa pares de M (deslizamiento entre filamentos, Figura 1A). Estas dinámicas deslizantes se acumulan, haciendo que los haces de MTsto se extiendan hasta alcanzar su punto de inestabilidad de pandeo y rotura (agrupaciones extensivas, Figura 1B)26. Los haces rotos son recocidos por la fuerza de agotamiento, que posteriormente se extiende de nuevo, y la dinámica se repite. Durante el proceso de la dinámica de repetición, los movimientos del haz agitan el líquido cercano, induciendo los flujos que se pueden visualizar mediante el dopaje con trazadores a escala de micrones(Figura 1C). Sánchez y Henkin et al. han caracterizado las velocidades medias de los trazadores, encontrando que las velocidades eran ajustables variando las concentraciones de trifosfato de adenosina (ATP), depilantes, racimos de motores y MTs19,27. Sin embargo, tal atún existía sólo antes de la síntesis de fluido activo. Después de la síntesis, la incapacidad se perdió, y los fluidos se autoorganizados a su manera. Para controlar la actividad del fluido activo después de la síntesis, Ross.et al. informó de un método utilizando la dimerización activada por la luz de las proteínas motoras, permitiendo que la actividad del fluido se afina y apague utilizando la luz28. Mientras que el control de la luz es conveniente en términos de activación local de los fluidos, el método requiere rediseñar las estructuras de las proteínas del motor, junto con la modificación de las trayectorias ópticas en un microscopio. Aquí, proporcionamos un método fácil de usar para controlar localmente los flujos de fluidos sin modificación del microscopio mientras mantenemos intacta la estructura del motor.

Nuestro método de ajuste local del flujo de fluido activo se basa en la ley Arrhenius porque se ha informado que la reacción kinesina-MT aumenta con la temperatura29,30,31,32. Nuestros estudios anteriores mostraron que la dependencia de la temperatura de la velocidad media de un flujo de fluido activo siguió la ecuación de Arrhenius: v - A exp(-Ea/RT), donde A es un factor preexponencial, R es la constante de gas, Ea es la energía de activación, y T es la temperatura del sistema33. Por lo tanto, la actividad del fluido es sensible al ambiente de temperatura, y la temperatura del sistema debe ser consistente para estabilizar el rendimiento del motor y, en consecuencia, la velocidad de flujo de fluido34. En este artículo, demostramos el uso de la dependencia de temperatura del motor para ajustar continuamente las velocidades de flujo de los fluidos activos ajustando la temperatura del sistema. También demostramos la preparación de una muestra de fluido activo, seguida de montaje de la muestra en una etapa del microscopio cuya temperatura se controla a través de software informático. El aumento de la temperatura de 16 oC a 36 oC acelera las velocidades medias de flujo de 4 a 8 m/s. Además, la incapacidad es reversible: aumenta y disminuye repetidamente la temperatura acelera y desacelera secuencialmente el flujo. El método demostrado es aplicable a una amplia gama de sistemas donde las reacciones principales obedecen a la ley Arrhenius, como el ensayo de deslizamiento MT29,30,31,32.

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Protocolo

1. Preparación de MTs

ADVERTENCIA: En este paso purificamos las tubulinas del tejido cerebral bovino. El cerebro bovino puede causar la variante de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (vCJD)35. Por lo tanto, los desechos cerebrales y las soluciones relacionadas, botellas y puntas de pipeta deben recogerse en una bolsa de biorresiduos y eliminarse como residuos biopeligrosos de acuerdo con las reglas de la institución.

  1. Purificar las tubulinas del cerebro bovino (modificadas de Castoldi et al.36).
    1. Transportar aproximadamente 1,5 kg de cerebros bovinos frescos de un matadero local a una sala fría de la universidad. Durante el transporte, almacenar los cerebros en tampón de fosfato (20 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7.2) en hielo.
      NOTA: Para maximizar el rendimiento final de la tubulina, la cantidad inicial de tubulina funcional en el tejido cerebral fresco es clave. Los cerebros más frescos contienen una tubulina más funcional. Para obtener los cerebros más frescos del matadero, recomendamos pedirle al carnicero que proporcione cerebros de las vacas sacrificadas más recientemente. Los cerebros no deben ser mayores de 3 h al iniciar el procedimiento, porque reducir el tiempo entre el sacrificio y el inicio del procedimiento producirá mejores rendimientos.
    2. Homogeneizar y aclarar los cerebros.
      1. Limpie el cerebro usando bisturíes para cortar los vasos sanguíneos y el tejido conectivo en trozos más pequeños y retírelos del cerebro a mano.
        NOTA: Los cerebros limpios deben ser rosados.
      2. Sumergir el tejido cerebral limpio en 1 L de tampón de despolimerización (DB: 50 mM 2-(N-morpholino) ácido etanosulfónico, 1 mM CaCl2,pH 6.6) por kilogramo de cerebro.
      3. Homogeneizar los cerebros con una licuadora de cocina.
      4. Centrifugar la solución cerebral homogeneizada a 10.000 x g y 4 oC durante 150 min.
    3. Polymerize MTs (primera polimerización).
      1. Recoger y mezclar el sobrenadante con volúmenes iguales de las siguientes soluciones a 37 oC: glicerol, tampón PIPES de alta molaridad (HMPB: 1 M PIPES, 10 mM MgCl2, 20 mM etilenglicol-bis(éter aminoehyl)-N,N,N',N'-ácido tetraacético [EGTA], pH 6.9)
      2. Añadir 1.5 mM ATP y 0.5 mM de trifosfato de guanosina (GTP) a la mezcla.
      3. Incubar la mezcla a 37oC durante 1 h.
    4. Despolimerizar MT (primera despolimerización MT).
      1. PelletMT centrifugando a 151.000 x g y 37oC durante 30 min.
      2. Desechar el sobrenadante y resuspender cada pellet MT en 10 ml de 4 oC DB.
      3. Incubar sobre hielo durante 30 min.
      4. Agitar la mezcla cada 5 minutos con una punta de pipeta para evitar la sedimentación mt.
        NOTA: La mezcla debe limpiarse en 30 minutos, lo que indica la finalización de la despolimerización de MT.
    5. Polimerización MT (segunda polimerización MT).
      1. Aclare la solución centrifugando a 70.000 x g y 4 oC durante 30 min.
      2. Recoger y mezclar el sobrenadante con volúmenes iguales de glicerol y HMPB de 37 oC.
      3. Añadir 1.5 mM ATP y 0.5 mM GTP a la mezcla.
      4. Incubar la mezcla a 37oC durante 30 min.
    6. Repita el paso 1.1.4, reemplazando HMPB por el tampón de reensamblaje de Brinkley (BRB) 80 (80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6.8), seguido de aclarar la mezcla despejada mediante centrifugación a 79.000 x g y 4 oC durante 30 min.
    7. Recoge el sobrenadante. Mida la absorbancia de 280 nm con un espectrómetro. Determinar la concentración de tubulina utilizando la ley Beer-Lambert (coeficiente de extinción de la tubulina: 1,15 (mg/ml)-1cm-1)37,38.
    8. Almacene la proteína a -80 oC.
  2. Recicla tubulinas (modificadas de Castoldi et al.36).
    NOTA: Para mejorar la pureza de la tubulina, la tubulina purificada se polimeriza y despolimeriza de nuevo.
    1. Polimerizar los MM mezclando la tubulina purificada (paso 1.1.7) con ditilotrito de 500 oM (TDT) y 20 oM de GTP, seguido de 30 minutos de incubación a 37oC.
    2. Pellet los MTs.
      1. Cargar 1 mL de cojín de glicerol (80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 60% v/v glicerol, pH 6.8) en la parte inferior de un tubo centrífugo.
      2. Poner los MT polimerizados en la parte superior del cojín.
      3. Centrífuga a 172.000 x g durante 90 min a 37oC.
    3. Despolimerizar los MT.
      1. Retire el sobrenadante y el cojín.
      2. Resuspenda cada pellet de MT en 150 oL de tampón de 4 oC MT (M2B: 80 mM PIPES, 2 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6.8).
      3. Incubar la mezcla sobre hielo durante 30 min.
      4. Agitar la mezcla con una punta de pipeta cada 5 min. La mezcla debe volverse clara.
    4. Aclarar la mezcla centrifugando a 172.000 x g y 4oC durante 30 min.
    5. Recoge el sobrenadante. Mida la concentración de proteínas. Conservar a -80oC.
  3. Etiquetar la tubulina con tinte fluorescente39.
    1. Polimerizar los MT. Mezclar la tubulina purificada (paso 1.1.7) con 500 M de TDT y 16,7 m de GTP, e incubar la mezcla a 37 oC durante 30 minutos.
    2. Pellet los MTs.
      1. Colocar 1 mL de cojín de alto pH de 37oC (0,1 M DeSNaHEPES, 1 mM MgCl2, 1 mM de EGTA, 60% v/v de glicerol, pH 8,6) en un tubo centrífugo.
      2. Poner los MT polimerizados en el cojín.
      3. Centrífuga a 327.000 x g durante 50 min a 37oC.
    3. Etiqueta tubulina.
      1. Resuspenda cada pellet de MT con 700 ml de tampón de etiquetado de 37 oC (0,1 M DeNaHEPES, 1 mM MgCl2, 1 mM de EGTA, 40% v/v de glicerol, pH 8,6).
      2. Mezclar la suspensión con un exceso de 10-20 molares de tinte fluorescente de color rojo lejano funcionalizado con un éster de succinimidil.
      3. Incubar la mezcla a 37oC durante 30 min en la oscuridad para permitir que los TM reaccionen con el éster del tinte fluorescente.
      4. Detenga la reacción de etiquetado saturando el éster del tinte de suspensión con 50 mM de K-glutamato, incubando durante 5 min a 37 oC.
    4. Pellet los MT setiquetados: Repita el paso 1.3.2, reemplazando el cojín de alto pH por un cojín de bajo pH (tubos de 80 mM, 2 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 60% v/v glicerol, pH 6.8).
    5. Despolimerizar los TM.
      1. Deseche el sobrenadante y el cojín.
      2. Resuspenda el glet a 700 oC de 4 oC M2B.
      3. Incubar la suspensión sobre hielo.
      4. Agitar cada 5 minutos con una punta de pipeta hasta que la solución esté clara.
    6. Aclare la solución despejada centrifugando a 184.000 x g y 4 oC durante 35 min.
    7. Mejore la pureza de la solución de tubulina etiquetada repitiendo los pasos 1.2.1–1.2.4.
    8. Mida la concentración de proteínas y tinte fluorescente. Utilice estas mediciones para determinar la concentración de tubulina y las fracciones de tubulina etiquetada, definida como la relación de concentraciones de colorante fluorescente a tubulina.
    9. Conservar la solución de tubulina etiquetada a -80 oC.
  4. Polimerizar los MT (adoptados de Sánchez yotros 19):
    1. Mezclar la tubulina reciclada (paso 1.2.5) con la tubulina etiquetada (paso 1.3.9) en una proporción que produzca una fracción de tubulina etiquetada al 3%.
    2. Mezclar la mezcla de tubulina de 8 mg/ml con 1 mM de TDT y 0,6 mM de guanosina-5'[(a,)-metileno]trifosfato (GMPCPP), seguido de 30 min de incubación a 37oC.
    3. Después de la incubación, recocido los MTs a temperatura ambiente en la oscuridad durante 6 h.
    4. Aliquot y almacenar a -80oC.

2. Sintetizar grupos de kinesina

NOTA: Las bacterias existen de forma omnipresente y pueden crecer en los medios y contaminar el proceso de preparación. Para evitar la contaminación, las acciones que impliquen el contacto con los cultivos celulares (por ejemplo, pipeteo) DEBEN realizarse cerca de una llama. Las herramientas como matraces, pipetas, puntas de pipeta, medios y placas DEBEN autoclaverse antes de su uso.

  1. Motores de kinesina exprés en Escherichia coli40.
    1. Transforma las celdas.
      1. Pipeta de 1 l del plásmido K401-BCCP-H6 en 10 l de células competentes.
      2. Incubar sobre hielo durante 5 min.
      3. Choque de calor a 42,5 oC durante 45 s.
      4. Incubar las células sobre hielo durante 2 minutos para permitir la recuperación.
      5. Mezclar las células con 300 l de 2XYT libre de antibióticos (5 g/L NaCl, 10 g/L extracto de levadura, 16 g/L de triptona).
      6. Incubar las células a 37oC durante 1 h.
        NOTA: A menos que se especifique, no es necesario supervisar el crecimiento celular durante la incubación.
    2. Inocular los medios de la placa.
      1. Extienda el cultivo celular en una placa 2XYT (10 g/L NaCl, 5 g/L extracto de levadura, 10 g/L de triptona, agar 15 g/L, 100 g/ml de ampicilina, 25 g/ml de cloramphenicol).
      2. Incubar la placa boca abajo a 37 oC durante la noche.
    3. Inocular medios líquidos.
      1. Desde el plato de la noche, cosechar una colonia aislada con una punta de pipeta.
      2. Expulse la punta en un matraz que contenga 50 ml de 2XYT.
      3. Incubar y agitar los medios de cultivo a 37 oC y 200 rpm durante 12–16 h.
    4. Expanda las celdas.
      1. Mezclar 2,5 ml del cultivo celular en 500 ml de 2XYT.
      2. Incubar y agitar el cultivo de 500 ml a 37 oC y 250 rpm durante 3-6 h.
    5. Inducir la expresión de proteínas.
      1. Durante la incubación, monitoree el crecimiento celular midiendo la absorbancia a 600 nm, utilizando 2XYT como referencia. Mida la absorbancia cada 60 minutos, hasta que alcance oD600 a 0,3. Luego mida la absorbancia cada 30 minutos hasta que alcance 0.5–0.6.
      2. Permita que las células crezcan hasta que la absorbancia alcance oD600 a 0,5–0,6
      3. Añadir 24 g/ml de biotina y 1 mM de isopropilo a la célula.
        NOTA: IPTG se utiliza para inducir la expresión proteica de los motores de quinesina, que están etiquetados con proteína portadora de carboxilo de biotina (BCCP) y seis histidinas (H6). La etiqueta H6 se utiliza en el proceso de purificación (paso 2.2), mientras que el BCCP se une a las moléculas de biotina añadidas para biotinylar los motores de quinesina expresados.
      4. Incubar y agitar el cultivo celular a 20 oC y 250 rpm durante 12–20 h.
    6. Cosecha las células centrifugando a 5.000 x g y 4oC durante 10 min. Deseche el sobrenadante. Almacene los gránulos celulares a -80 oC.
  2. Purificar la proteína motora de kinesina (modificada de Spriestersbach et al.41):
    1. Suspenda el pellet celular (paso 2.1.6) con un volumen igual de tampón de lisis (50 mM PIPES, 4 mM MgCl2, 50 m DE ATP, 10 mM 2-mercaptoetanol (ME), 20 mM de imidazol, pH 7.2), seguido de la adición de un comprimido de inhibidor de la proteasa, 2 mg de fluoruro de sulfonil de fenilmetil (PMSF), y 2 mg de lisozyma.
    2. Lijar las células por congelación del flash en nitrógeno líquido (LN) 3veces y descongelar la mezcla celular.
      NOTA: Después del sieteo, la mezcla debe volverse viscosa.
    3. Aclarar la mezcla de células lisadas centrifugando a 230.000 x g y 4 oC durante 30 min.
    4. Recoger el sobrenadante y fluirlo a través de una columna de gravedad, seguido de lavar la columna con 10 ml de tampón de lisis.
      NOTA: Las proteínas con una etiqueta H6, como la kinesina K401-BCCP-H6, deben permanecer en la columna.
    5. Eluir la proteína etiquetada con 5 mL de tampón de elución (50 mM PIPES, 4 mM MgCl2, 50 M ATP, 500 mM imidazol, pH 7.2). Recoja el flujo a través secuencialmente en fracciones de 1 ml. Para determinar las fracciones que contienen proteínas, mezcle 3 ml de cada fracción con 100 ml de tinte trifeniletmetano. Las fracciones que contienen proteínas deben volverse azules. Combine estas fracciones y diluya por 5x con tampón de lisis.
    6. Concentrar la solución proteica.
      1. Cargue la solución en un tubo de filtro centrífugo.
      2. Centrífuga a 3.000 x g durante 10 min a 4oC.
      3. Agitar el tubo suavemente y centrifugar de nuevo hasta que el volumen de la solución sea de <3 ml.
    7. Medir la concentración proteica con un espectrómetro (coeficiente de extinción: 0,549 (mg/ml)-1cm-1)42,43. Diluir la proteína a 1 mg/ml mientras añade un 35% de sacarosa.
    8. Conservar a -80oC.
  3. Mida las concentraciones de kinesina con un gel de electroforesis (modificado de Taylor et al.44).
    NOTA: Para medir la concentración de quinesina con un gel de electroforesis, la tubulina es una escalera de concentración ideal debido a su alta pureza y su concentración medible a través de un espectrómetro(Figura 2A)36.
    1. Preparar muestras de tubulina con concentraciones de 0,25, 0,5, 0,75, 1,00 y 1,25 mg/ml. Mezclar 15 ml de cada muestra de tubulina y muestra de quinesina (paso 2.2.8) por separado con 5 l de tampón de muestra (200 mM Tris-HCl, 8% de dodecil sulfato sódico (SDS), 400 mM de TDT, 0,2% de azul bromofenol, 40% de glicerol, pH 6,8) e incubar a 90 oC para 3 minutos.
    2. Preparen la electroforesis.
      1. Bloquee un gel de electroforesis en la caja de gel.
      2. Llene la caja con tampón de carrera (50 mM MOPS, base Tris de 50 mM, 0,1% SDS, ácido etilendiaminetetraacético de 1 mM (EDTA), pH 7,7).
        NOTA: Asegúrese de que el nivel de tampón esté por encima de la abertura superior del gel.
    3. Cargue 10 ml de escalera estándar de proteína, muestras de tubulina y muestra sin quinesina en pozos separados y aplique 200 V a través del gel durante 45 min.
    4. Tinción de gel.
      1. Incubar y mecer el gel con solución de manchas hervidas (aproximadamente 95 oC) A (0,5 g/L de tinte trifenilmetano, ácido acético 10% v/v, 25% isopropanol) durante 5 min, luego enjuagar el gel con agua desionizada (DI).
      2. Repita con las soluciones de tinción B (0,05 g/L trifenilmetano, 10% v/v ácido acético, 10% isopropanol), C (0,02 g/L de tinte trifenilmetano, 10% v/v ácido acético) y D (10% v/v ácido acético), secuencialmente. Incubar y mecer el gel en agua DI durante la noche.
    5. Escanee el gel. Convierta la imagen de gel en una imagen en escala de grises, seguida de una inversión en blanco y negro y una mejora del contraste para revelar bandas de proteínas brillantes en el fondo negro.
    6. Mida el brillo de cada banda sumando los valores de píxel. Aplique el ajuste lineal C a B + b, donde B es el brillo de una banda de tubulina, C es la concentración correspondiente y a y b son parámetros de ajuste. Determinar la concentración de kinesina Ck utilizando el brillo de la banda de kinesina Bk para calcular la ecuación lineal: Ck á aBk + b.
  4. Agrupe los motores de kinesina.
    1. Mezclar 1,5 oM de quinesina (paso 2.2.8) con 120 M de TDT y 120 nM de estreptavidina. Incubar sobre hielo durante 30 min.
    2. Conservar a -80oC.

3. Preparar portaobjetos y cubreobjetos de vidrio recubiertos con poliacrilamida (modificados de Lau et al.45)

  1. Cargue nuevos portaobjetos de vidrio y cubiertas de vidrio en los contenedores correspondientes. Sumerja los portaobjetos y los labios de las cubiertas en el detergente del 1% v/v en agua DI y luego hierva el agua en un microondas.
  2. Sonicar los portaobjetos y los labios de las cubiertas durante 5 min y luego enjuagar con agua DI para eliminar el detergente.
  3. Sumerja y sonice los portaobjetos y los labios en etanol durante 5 min.
  4. Sumerja e sonice los portaobjetos y los cubreobjetos en hidróxido de potasio de 100 mM (KOH) durante 5 min. Enjuague con agua DI.
  5. Incubar los portaobjetos y cubrelos en una solución de silano (1% ácido acético y 0,5% 3-(trimethoxysilyl)propyl metacrilato en etanol) durante 15 min y luego enjuagar con agua DI.
  6. Incubar los portaobjetos y los labios en la solución de acrilamida (2% p/p de acrilamida, 0,7 mg/ml de persulfato de amonio y 0,0035% v/v tetrametiletilenomina en agua DI) para 3 h.
  7. Guarde los portaobjetos y los cubreobjetos en la solución de acrilamida.

4. Preparar fluidos activos basados en MT impulsados por la quinesina

  1. Preparar fluidos activos (modificados de Sánchez yotros 19).
    NOTA: Los pasos siguientes demuestran el proceso de preparación de 100 ml de un fluido activo utilizando materiales de ejemplo. El volumen final es escalable y las concentraciones de las existencias de ejemplo se pueden ajustar siempre que se mantenga la concentración final de cada componente.
    1. Mezclar 16,7 l de 8 mg/ml de MT (paso 1.4.4) con 6,7 ml de racimos de motor de quinesina de 1,8 m (paso 2.4.2) y 1,1 ml de TDT de 500 mM en M2B de alta sal (M2B + 3,9 mM MgCl2).
    2. Agrupe los MM añadiendo 11,4 l de 7% p/p de polietilenglicol (PEG).
    3. Active los motores de kinesina añadiendo 2,8 l de 50 mM de ATP.
    4. Mantener las concentraciones de ATP añadiendo 2,8 ml de piruvato quinasa/lactato deshidrogenasa (PK/LDH) y 13,3 ml de pirenol pirenol pirenol (PEP) de 200 mM.
    5. Reduzca el efecto de fotoblanqueo añadiendo 10 ml de Trolox de 20 ml, 1,1 ml de 3,5 mg/ml de catalasa, 1,1 ml de 20 mg/ml de glucosa oxidasa y 1,1 ml de glucosa de 300 mg/ml.
    6. Realice un seguimiento del movimiento del fluido añadiendo 1,6 l de partículas trazadoras de 0,025% v/v.
    7. Añadir M2B de alta sal para alcanzar un volumen total de 100 l.
      NOTA: Las órdenes de mezcla en los pasos 4.1.1–4.1.6 son intercambiables. Sin embargo, una vez que ATP, MTs, y los motores se mezclan, los motores comienzan a consumir ATP mientras que pisan a lo largo de los MT. La muestra se activa con una vida útil finita debido a los combustibles limitados (ATP y PEP), por lo que el experimento debe iniciarse con prontitud. El líquido activo final debe contener 1,3 mg/ml MT, 120 nM de grupos de motor de quinesina, 5.5 mM TDT, 0.8% w/w PEG, 1.4 mM ATP, 2.8% v/v PK/LDH, 27 mM PEP, 2 mM Trolox, 0.038 mg/mL catalasa, 0.22 mg/mL glucosa oxidasa, 3.3 mg/mL glucosa, y 0.0004% v/v cololíid en alta sal M2B.
  2. Preparar una muestra en un canal de flujo (modificado de Chandrakar et al.46):
    1. Enjuague un portaobjetos de vidrio recubierto con poliacrilamida y cubra (paso 3.7) con agua DI. Seque los vasos con aire presurizado. Colocar sobre una superficie limpia y plana.
    2. Cortar dos tiras de películas de cera con una anchura de 3 mm y la misma longitud que el cubreobjetos de vidrio (20 mm). Inserte las tiras entre la diapositiva y el cubreobjetos como espaciadores de canal.
    3. Adherir el vidrio a la película de cera colocando el complejo de cera de vidrio en una placa caliente de 80 oC para derretir la cera. Durante la fusión, presione suavemente el cubreobjetos con una punta de pipeta para adherir uniformemente la película de cera a las superficies de vidrio. Después de la adhesión, enfríe el complejo de vidrio a temperatura ambiente.
    4. Cargue los fluidos activos (paso 4.1) en el canal de flujo. Selle el canal con pegamento UV.

5. Controlar la temperatura de la muestra

  1. Construir una configuración de control de temperatura (modificada a partir de diseños en Lowensohn et al. y Wu et al.47,48,49).
    1. Prepare un bloque de refrigeración de aluminio.
      1. Fresa una placa de aluminio con dimensiones de aproximadamente 30 mm x 30 mm a 5 mm.
      2. Taladre un canal interno a través de la placa(Figura 3A)e instale los accesorios de manguera en los extremos del canal.
      3. Enganche cada accesorio a un tubo de agua.
      4. Conecte un tubo a una bomba de pecera en un depósito de agua mientras extiende el otro tubo al depósito.
        NOTA: La bomba circulará el agua del depósito a través de los canales internos de aluminio para mantener la temperatura del bloque a una temperatura aproximadamente ambiente.
    2. Conecte un enfriador termoeléctrico (TEC) y un termosensor a un controlador de temperatura. Conecte el controlador a un ordenador mediante un puerto USB(Figura 3B).
    3. Conecte el controlador de temperatura a una fuente de alimentación de corriente directa (CC). Encienda el controlador conectando la fuente de alimentación a una toma de corriente.
    4. Realice la configuración inicial del TEC siguiendo la guía del fabricante del controlador. Pruebe la salida TEC. Se recomienda controlar el controlador de temperatura a través del software proporcionado por el fabricante, lo que permite la grabación de datos del termosensor y una manipulación más sencilla del controlador de temperatura.
    5. Identifique los lados de calefacción y refrigeración del TEC.
    6. Fije el lado de enfriamiento del TEC al bloque de refrigeración (paso 5.1.1) utilizando pasta térmica.
    7. Conecte un disco de zafiro al lado calefactor del TEC utilizando pasta térmica.
    8. La configuración está completa. La superficie del zafiro y el termosensor pueden ponerse en contacto con una muestra para enfriar y calentar la muestra en función de su temperatura y temperatura objetivo.
      NOTA: Se recomienda que el TEC y el bloque de refrigeración tengan un orificio central alineado para tomar imágenes de las muestras mediante microscopía de campo brillante(Figura 3C).
  2. Utilice la configuración de control de temperatura para controlar la temperatura de la muestra33.
    1. Monte la muestra en la configuración.
      1. Coloque la muestra de líquido activo (paso 4.2.4) sobre la superficie del zafiro con el lado de la corredera en contacto con la superficie.
      2. Fije la corredera de vidrio con cinta adhesiva.
      3. Fije el termosensor a la superficie de revestimiento utilizando cinta de cobre.
    2. Monte la configuración en una etapa del microscopio con el lado de la cubierta orientado hacia los objetivos. Por ejemplo, en un microscopio invertido, el lado de la cubierta debe estar boca abajo. Asegure la configuración con cinta adhesiva de papel y las abrazaderas de aguja de la etapa del microscopio, si corresponde.
      NOTA: La etapa de temperatura presentada debe funcionar con microscopios comunes que estén invertidos o en posición vertical. Para asegurarse de que la etapa de temperatura no se mueve durante el experimento, es mejor asegurar la etapa de temperatura a la etapa del microscopio con cinta adhesiva.
    3. Controle la temperatura de la muestra.
      1. Encienda el controlador de temperatura y la bomba de la pecera.
      2. Siga la guía del fabricante para establecer la temperatura objetivo y activar el control de temperatura. El controlador ajustará la potencia de calentamiento o refrigeración en función de la temperatura objetivo y la temperatura de la muestra, según lo evalúe el termosensor.
    4. Registre las temperaturas de la muestra.
      1. Siga la guía del fabricante para registrar los datos de temperatura del termosensor durante el experimento.
        NOTA: La temperatura de la muestra ahora debe ser controlada por el controlador y registrada por el ordenador(Figura 3D).

6. Caracterizar la actividad fluida activa (modificada a partir de métodos de Henkin et al. y Wu et al.20,27)

NOTA: Las secciones anteriores se utilizan para preparar muestras de fluidos activos (secciones 1–4) y controlar su temperatura (sección 5). Para demostrar el uso de la temperatura para controlar la actividad activa del fluido, observar los comportamientos fluidos, analizar sus actividades y caracterizar su respuesta a la temperatura.

  1. Monitoree los trazadores.
    1. Iimagee la muestra con un intervalo constante det utilizando fluorescencia de proteína fluorescente verde (GFP) para capturar el movimiento de las partículas trazadoras.
      NOTA:Se debe elegir el valor de la trazación para permitir el seguimiento del movimiento del trazador. Los valores det grandes, como 100 s, dan como resultado la pérdida de las trayectorias del trazador, mientras que los valores cortos det, como 0,1 s, impiden que el algoritmo de seguimiento detecte el movimiento del trazador entre fotogramas. Un desplazamiento de trazador entre fotogramasdebe permitir que el desplazamiento del trazador esté dentro de 9 píxeles. Para los trazadores de imágenes que se mueven a 10 m/s utilizando un objetivo 4x, se recomienda que el valor de lat sea de 1 a 5 s.
    2. Guarde las imágenes como archivos TIFF, asigne un nombre a los archivos en función del número de fotograma y guárdelos en una carpeta independiente. Estos procesos son necesarios para garantizar que las imágenes adquiridas se analizarán correctamente con el script MATLAB proporcionado (paso 6.2.2).
  2. Rastreadores de pista que adoptan el software de seguimiento desarrollado por Ouellette et al.50,51):
    1. Descargue el software de seguimiento del Laboratorio de Complejidad Ambiental de la Universidad de Stanford (https://web.stanford.edu/~nto/software.shtml). Asegúrese de que cada archivo MATLAB está en la misma carpeta.
    2. Realice un seguimiento de los trazadores mediante un script MATLAB personalizado: particle_tracking.m. El script lee las imágenes del trazador (paso 6.1) y rastrea el movimiento del trazador utilizando el software de Ouellette et al.50,51. Produce dos archivos: 1) background.tif, que representa el fondo de la imagen, y 2) Tracking.mat, que contiene las trayectorias de partículas y las velocidades en cada fotograma(Figura 4A).
  3. Analice las velocidades medias del trazador utilizando un script MATLAB personalizado: analysis.m. El script lee el archivo de seguimiento (Tracking.mat) y genera la velocidad media de los trazadores frente al tiempo, junto con una velocidad media promediada en el tiempo con ventanas de promediación especificadas(Figura 4B)33.
  4. Registre la velocidad media promedio de tiempo.
  5. Mida la velocidad media promediada por tiempo repitiendo el experimento (pasos 4, 5.2 y 6.1–6.4) a 10–40 oC. Utilice las velocidades medias registradas para trazar la velocidad media frente a la temperatura (Figura 4C)33.

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Resultados

Preparar los fluidos activos basados en MT impulsados por la quinesina requiere kinesina y MT. Los TM fueron polimerizados a partir de tubulinas etiquetadas (pasos 1.3 y 1.4) que fueron purificadas a partir de cerebros bovinos (paso 1.1, Figura 2A),seguido de reciclaje para mejorar la pureza (paso 1.2, Figura 2B). Las proteínas motoras de kinesina se expresaron y se purificaron a partir de E. coli (pasos 2.1 y 2.2,

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Discusión

El control in situ de la materia activa abre la puerta a la autoorganización dirigida de la materia activa4,5,24,28,54. En este artículo, presentamos un protocolo para el uso de la temperatura para controlar los fluidos activos basados en MT impulsados por cineína in situ, basado en la característica Arrhenius del sistema29,<...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Plásmido K401-BCCP-H6 fue un regalo del Dr. Zvonimir Dogic. Esta investigación fue apoyada por el fondo de puesta en marcha del Dr. Kun-Ta Wu en el Instituto Politécnico de Worcester. Agradecemos al Dr. Zvonimir Dogic los protocolos para purificar y etiquetar la tubulina y sintetizar fluidos activos. Agradecemos al Dr. Marc Ridilla su experiencia en la expresión y purificación de proteínas. Agradecemos al Dr. William Benjamin Roger por ayudarnos con la construcción de la etapa de temperatura controlada. Reconocemos a Brandeis MRSEC (NSF-MRSEC-1420382) por el uso de la Instalación de Materiales Biológicos (BMF). Reconocemos a la Royal Society of Chemistry por adaptar las figuras de Bate et al. en Soft Matter33.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
(±)-Ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxílicoSigma-Aldrich238813Trolox
2-MercaptoetanolSigma-AldrichM6250
3-(trimetoxisilil)metacrilato de propilo, 98%, ACROS OrganicsFisher ScientificAC216550050
3,2 mm I.D. Tygon Tubing R-3603HACH2074038Tubos de agua de
31,75 mm de diámetro sin recubrimiento, ventana de zafiroEdmund Optics43-637 Disco dezafiro
3M 1181 Cinta de cobre - 1/2 pulgada de ancho x 18 yardas de largo - 2.6 MIL Espesor total - 27551R.S. HUGHES054007-27551Cinta de cobre
Ácido acéticoSigma-AldrichA6283
Solución de acrilamida (40%/electroforesis), Fisher BioReagentsFisher ScientificBP1402-1
Adenosina 5'-trifosfato dipotásico hidrato de salSigma-AldrichA8937ATP
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)Thermo Fisher ScientificA20006Colorante fluorescente rojo lejano. Alexa 647 puede presuspenderse en dimetilsulfóxido (DMSO) antes de mezclarse con microtúbulos (1.3.3.2.)
Unidad de filtro centrífugo Amicon Ultra-4Sigma-AldrichUFC801024Tubo de filtro centrífugo. Peso molecular de corte: 10 kDa
Persulfato de amonio, 100 g, MP BiomedicalsFisher ScientificICN802829Sal
sódica de ampicilina APS (polvo cristalino), Fisher BioReagentsFisher ScientificBP1760Mesa
antivibratoriaNikon63-7590S
Centrífuga Avanti J-EBeckman Coulter369001
Agente soldador Bacto Agar, BD DiagnosticsVWR90000-760Agar
BiotinaAlfa AesarA14207
Cubo de plástico blanco - 2 galonesBon84-715Cubo
de agua Cloruro de calcioSigma-Aldrich746495CaCl2
Catalasa de hígado bovinoSigma-AldrichC40
CFI Plan Apo Lambda 4x ObjNikonMRD000454x objetivo aéreo
C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero ShiftNikon96372GFP
cubo de filtro CH-109-1.4-1.5TE TechnologyCH-109-1.4-1.5Enfriador termoeléctrico (TEC)
Cloranfenicol, 98%, ACROS OrganicsFisher ScientificC0378
Bloque de enfriamientoN/AN/AAluminio fresado a medida
Coomassie Brilliant Blue R-250 #1610400Bio-Rad1610400Colorante de trifenilmetano
D-(+)-GlucosaSigma-AldrichG7528
Dimetilsulfóxido (certificado ACS), Fisher ChemicalFisher ScientificD128DMSO
DL-1,4-Ditiotreitol, 99%, para bioquímica, ACROS OrganicsFisher ScientificAC165680050TDT
DOWSIL 340 Compuesto de disipador de calorDow1446622Pasta térmica
ALCOHOL ETÍLICO, 200 PRUEBA ACS / USP / NF GRADO 5 GALONES POLY CUBEPharmco by Greenfield Global111000200CB05Etanol
Etilenglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N'-ácido tetraacéticoSigma-AldrichE3889EGTA
Ácido etilendiaminotetraacéticoSigma-Aldrich798681EDTA
Fisher BioReactivos Microbiología Aditivos de Medios: TriptonaFisher ScientificBP1421Triptona
Fisher BioReactivos Microbiología Aditivos de Medios: Extracto de LevaduraFisher ScientificBP1422Extracto de Levadura
Fluoresbrite YG Microesferas, Grado de Calibración 3.00 y micro; mPolysciences18861Partículas trazadoras
Glucosa oxidasa de Aspergillus nigerSigma-AldrichG2133
GlicerolSigma-AldrichG5516
GpCppJena BioscienceNU-405LGuanosina-5'[ (α,β)-metileno]trifosfato (GMPCPP)
GS Power calibre 18 (True American Wire Ga), 100 pies, 99.9% trenzado de cobre libre de oxígeno OFC, rojo/negro 2 conductores unidos cable de cremallera cable eléctrico de alimentación/altavoz para automóvil, audio, cine en casaAmazonB07428NBCWAlambre de cobre
Guanosina 5'-trifosfato sodio sal hidratoSigma-AldrichG8877GTP
Hellmanex IIISigma-AldrichZ805939Detergente
HEPES Sal de sodio (polvo blanco), Fisher BioReagentsFisher ScientificBP410NaHEPES
Máquina mezcladora de alto rendimientoAIMORESAS-UP1250Mezclador
His GraviTrapGE Healthcare11003399 Columna de gravedad
ImidazolSigma-AldrichI5513
IPTGSigma-AldrichI6758Isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido
Alcohol isopropílico 99%Pharmco de Greenfield Global231000099Rotor Isopropanol
JA-10Beckman Coulter369687
Ácido L-glutámico sal de potasio monohidratoSigma-AldrichG1501K-glutamato
lisozima de clara de huevo de gallinaSigma-AldrichL6876
Cloruro de magnesio hexahidratadoSigma-AldrichM2670MgCl2• 6H2O
MES sal sódicaSigma-AldrichM5057Ácido 2-(N-Morpholino)etanosulfónico sal sódica
MOPSSigma-AldrichM1254Ácido 3-(N-Morfolino)propanosulfónico
MP-3022Tecnología TEMP-3022Termopar
N,N,N',N'-Tetrametilemilendiamina 99%, ACROS OrganicsFisher ScientificAC138450500TEMED
Espectrofotómetro UV-VIS Nanodrop 2000cEspectrómetroE112352Thermo Fisher Scientific
Nikon Ti2-E Microscopio invertidoNikonMEA54000
Norland Adhesivo óptico 81Productos NorlandNOA81Pegamento UV
Novex Sharp Pre-teñido Estándar de proteínasThermo Fisher ScientificLC5800Escalera estándar de proteínas
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1,5 mm, 10 pocillosThermo Fisher ScientificNP0335BOX SDS Gel
Optima L-90K Ultracentrífuga BeckmanCoulter365672
Parafilm PM996 Wrap, 4" de ancho; 125 pies/rolloCole-ParmerEW-06720-40 Película decera
Pe 300 ultra Sistema de iluminación Banda única, 3 mm Control de guía de luz Fuente de alimentación de vainaNikonPE-300-UT-L-SB-40Iluminador LED frío
Fluoruro de fenilmetanosulfoniloSigma-Aldrich78830PMSF
Sal monopotásica de ácido fosfoenolpirúvico, 99%BeanTown Chemical129745PEP
Pierce Coomassie (Bradford) Kit de ensayo de proteínasThermo Fisher Scientific23200
Pierce Inhibidor de la proteasa Mini tabletasThermo Fisher ScientificA32953
TUBERÍASSigma-AldrichP67571,4-piperazinaácido dietanosulfónico
Plurónico F-127Sigma-AldrichP2443
Poli(etilenglicol)Sigma-Aldrich81300PEG. Peso molecular medio 20.000 Da
Hidróxido de potasio (pellets/ACS certificado), Fisher ChemicalFisher ScientificP250-500KOH
PowerEase 300W Fuente de alimentación (115 VAC)ThermoFisher ScientificPS0300Fuente de alimentación de CC de la caja de gel
PS-12-8.4ATE TechnologyPS-12-8.4AFuente de alimentación de CC del controlador
de temperaturaPiruvato quinasa/enzimas lácticas deshidrogenasas del músculo de conejoSigma-AldrichP-0294PK/LDH
Bomba de fuente Lifegard Quiet One, 296 galones por hora BombapeceraAmazonB005JWA612
Rosetta 2(DE3)pLysS Células competentes - NovagenMillipore Sigma71403Celdas competentes
Sharp Microwave ZSMC0912BS Sharp 900W Horno de microondas de encimera, 0,9 pies cúbicos, acero inoxidableAmazonB01MT6JZMRMicroondas para hervir el agua
Cloruro de sodio (cristalino/ACS certificado), Fisher ChemicalFisher ScientificS271-500NaCl
Dodecil sulfato de sodioSigma-AldrichL3771SDS
Fosfato de sodio monobásicoSigma-AldrichS8282NaH2PO4
Proteína de estreptavidinaThermo Fisher Scientific21122
SacarosaSigma-AldrichS7903
TC-720TecnologíaTE TC-720Controlador de temperatura
Tris Base, Grado de Biología Molecular - CAS 77-86-1 - CalbiochemSigma-Aldrich648310Tris-HCL
Tipo 45 Rotor TiBeckman Coulter339160
Rotor Tipo 70 TiBeckman Coulter
Rotor 337922 Tipo 70.1 TiBeckman Coulter342184
VWR Cinta de etiquetado de laboratorio de uso generalVWR89097-916Cintas de papel
VWR Micro Cubreobjetos, cuadrados, n.º 1 1/2VWR48366-227Cubreobjetos de vidrio
VWR Liso y esmerilado Micro portaobjetos, PremiumVWR75799-268Portaobjetos
de vidrio XCell SureLock Mini-CellThermoFisher ScientificEI0001Caja de gel
ZYLA 5.5 USB3.0 CámaraCCD monocromáticaNikonZYLA5.5-USB3
de ampicilina de de

Referencias

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