Control de las velocidades de flujo de fluidos activos 3D basados en microtúbulos mediante la temperatura

Summary

El objetivo de este protocolo es utilizar la temperatura para controlar las velocidades de flujo de los fluidos activos tridimensionales. La ventaja de este método no sólo permite regular las velocidades de flujo in situ, sino que también permite un control dinámico, como ajustar periódicamente las velocidades de flujo hacia arriba y hacia abajo.

Abstract

Presentamos un método para usar la temperatura para ajustar las velocidades de flujo de fluidos activos tridimensionales tridimensionales (3D) impulsados por la quinesina y basados en microtúbulos. Este método permite ajustar las velocidades in situ sin necesidad de fabricar nuevas muestras para alcanzar las diferentes velocidades deseadas. Además, este método permite el control dinámico de la velocidad. Ciclismo la temperatura lleva a los fluidos a fluir rápido y lento, periódicamente. Esta controlabilidad se basa en la característica de Arrhenius de la reacción de kinesina-microtúbulo, lo que demuestra un rango de velocidad de flujo medio controlado de 4-8 m/s. El método presentado abrirá la puerta al diseño de dispositivos microfluídicos donde los caudales en el canal son ajustables localmente sin necesidad de una válvula.

Introduction

La materia activa se diferencia de la materia pasiva convencional debido a su capacidad para convertir la energía química en trabajo mecánico. Un material que posee tal capacidad puede consistir en entidades vivas o no vivientes como bacterias, insectos, coloides, granos y filamentos citoesqueléticos^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10}. Estas entidade....

Protocol

1. Preparación de MTs

ADVERTENCIA: En este paso purificamos las tubulinas del tejido cerebral bovino. El cerebro bovino puede causar la variante de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (vCJD)³⁵. Por lo tanto, los desechos cerebrales y las soluciones relacionadas, botellas y puntas de pipeta deben recogerse en una bolsa de biorresiduos y eliminarse como residuos biopeligrosos de acuerdo con las reglas de la institución.

1. Purificar las tubulinas del cerebro bovino (modificadas de Castoldi et al.³⁶).
   1. Transportar aproximadamente 1,5 kg de cerebros bovinos frescos de un matadero loca....

Results

Preparar los fluidos activos basados en MT impulsados por la quinesina requiere kinesina y MT. Los TM fueron polimerizados a partir de tubulinas etiquetadas (pasos 1.3 y 1.4) que fueron purificadas a partir de cerebros bovinos (paso 1.1, Figura 2A),seguido de reciclaje para mejorar la pureza (paso 1.2, Figura 2B). Las proteínas motoras de kinesina se expresaron y se purificaron a partir de E. coli (pasos 2.1 y 2.2,

Discussion

El control in situ de la materia activa abre la puerta a la autoorganización dirigida de la materia activa^4,5,24,28,54. En este artículo, presentamos un protocolo para el uso de la temperatura para controlar los fluidos activos basados en MT impulsados por cineína in situ, basado en la característica Arrhenius del sistema^29,<.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
(±)-Ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxílico	Sigma-Aldrich	238813	Trolox
2-Mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M6250
3-(trimetoxisilil)metacrilato de propilo, 98%, ACROS Organics	Fisher Scientific	AC216550050
3,2 mm I.D. Tygon Tubing R-3603	HACH	2074038	Tubos de agua de
31,75 mm de diámetro sin recubrimiento, ventana de zafiro	Edmund Optics	43-637 Disco de	zafiro
3M 1181 Cinta de cobre - 1/2 pulgada de ancho x 18 yardas de largo - 2.6 MIL Espesor total - 27551	R.S. HUGHES	054007-27551	Cinta de cobre
Ácido acético	Sigma-Aldrich	A6283
Solución de acrilamida (40%/electroforesis), Fisher BioReagents	Fisher Scientific	BP1402-1
Adenosina 5'-trifosfato dipotásico hidrato de sal	Sigma-Aldrich	A8937	ATP
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)	Thermo Fisher Scientific	A20006	Colorante fluorescente rojo lejano. Alexa 647 puede presuspenderse en dimetilsulfóxido (DMSO) antes de mezclarse con microtúbulos (1.3.3.2.)
Unidad de filtro centrífugo Amicon Ultra-4	Sigma-Aldrich	UFC801024	Tubo de filtro centrífugo. Peso molecular de corte: 10 kDa
Persulfato de amonio, 100 g, MP Biomedicals	Fisher Scientific	ICN802829	Sal
sódica de ampicilina APS (polvo cristalino), Fisher BioReagents	Fisher Scientific	BP1760	Mesa
antivibratoria	Nikon	63-7590S
Centrífuga Avanti J-E	Beckman Coulter	369001
Agente soldador Bacto Agar, BD Diagnostics	VWR	90000-760	Agar
Biotina	Alfa Aesar	A14207
Cubo de plástico blanco - 2 galones	Bon	84-715	Cubo
de agua Cloruro de calcio	Sigma-Aldrich	746495	CaCl2
Catalasa de hígado bovino	Sigma-Aldrich	C40
CFI Plan Apo Lambda 4x Obj	Nikon	MRD00045	4x objetivo aéreo
C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero Shift	Nikon	96372	GFP
cubo de filtro CH-109-1.4-1.5	TE Technology	CH-109-1.4-1.5	Enfriador termoeléctrico (TEC)
Cloranfenicol, 98%, ACROS Organics	Fisher Scientific	C0378
Bloque de enfriamiento	N/A	N/A	Aluminio fresado a medida
Coomassie Brilliant Blue R-250 #1610400	Bio-Rad	1610400	Colorante de trifenilmetano
D-(+)-Glucosa	Sigma-Aldrich	G7528
Dimetilsulfóxido (certificado ACS), Fisher Chemical	Fisher Scientific	D128	DMSO
DL-1,4-Ditiotreitol, 99%, para bioquímica, ACROS Organics	Fisher Scientific	AC165680050	TDT
DOWSIL 340 Compuesto de disipador de calor	Dow	1446622	Pasta térmica
ALCOHOL ETÍLICO, 200 PRUEBA ACS / USP / NF GRADO 5 GALONES POLY CUBE	Pharmco by Greenfield Global	111000200CB05	Etanol
Etilenglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N'-ácido tetraacético	Sigma-Aldrich	E3889	EGTA
Ácido etilendiaminotetraacético	Sigma-Aldrich	798681	EDTA
Fisher BioReactivos Microbiología Aditivos de Medios: Triptona	Fisher Scientific	BP1421	Triptona
Fisher BioReactivos Microbiología Aditivos de Medios: Extracto de Levadura	Fisher Scientific	BP1422	Extracto de Levadura
Fluoresbrite YG Microesferas, Grado de Calibración 3.00 y micro; m	Polysciences	18861	Partículas trazadoras
Glucosa oxidasa de Aspergillus niger	Sigma-Aldrich	G2133
Glicerol	Sigma-Aldrich	G5516
GpCpp	Jena Bioscience	NU-405L	Guanosina-5'[ (α,β)-metileno]trifosfato (GMPCPP)
GS Power calibre 18 (True American Wire Ga), 100 pies, 99.9% trenzado de cobre libre de oxígeno OFC, rojo/negro 2 conductores unidos cable de cremallera cable eléctrico de alimentación/altavoz para automóvil, audio, cine en casa	Amazon	B07428NBCW	Alambre de cobre
Guanosina 5'-trifosfato sodio sal hidrato	Sigma-Aldrich	G8877	GTP
Hellmanex III	Sigma-Aldrich	Z805939	Detergente
HEPES Sal de sodio (polvo blanco), Fisher BioReagents	Fisher Scientific	BP410	NaHEPES
Máquina mezcladora de alto rendimiento	AIMORES	AS-UP1250	Mezclador
His GraviTrap	GE Healthcare		11003399 Columna de gravedad
Imidazol	Sigma-Aldrich	I5513
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758	Isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido
Alcohol isopropílico 99%	Pharmco de Greenfield Global	231000099	Rotor Isopropanol
JA-10	Beckman Coulter	369687
Ácido L-glutámico sal de potasio monohidrato	Sigma-Aldrich	G1501	K-glutamato
lisozima de clara de huevo de gallina	Sigma-Aldrich	L6876
Cloruro de magnesio hexahidratado	Sigma-Aldrich	M2670	MgCl2• 6H2O
MES sal sódica	Sigma-Aldrich	M5057	Ácido 2-(N-Morpholino)etanosulfónico sal sódica
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254	Ácido 3-(N-Morfolino)propanosulfónico
MP-3022	Tecnología TE	MP-3022	Termopar
N,N,N',N'-Tetrametilemilendiamina 99%, ACROS Organics	Fisher Scientific	AC138450500	TEMED
Espectrofotómetro UV-VIS Nanodrop 2000c	Espectrómetro	E112352	Thermo Fisher Scientific
Nikon Ti2-E Microscopio invertido	Nikon	MEA54000
Norland Adhesivo óptico 81	Productos Norland	NOA81	Pegamento UV
Novex Sharp Pre-teñido Estándar de proteínas	Thermo Fisher Scientific	LC5800	Escalera estándar de proteínas
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1,5 mm, 10 pocillos	Thermo Fisher Scientific		NP0335BOX SDS Gel
Optima L-90K Ultracentrífuga Beckman	Coulter	365672
Parafilm PM996 Wrap, 4" de ancho; 125 pies/rollo	Cole-Parmer	EW-06720-40 Película de	cera
Pe 300 ultra Sistema de iluminación Banda única, 3 mm Control de guía de luz Fuente de alimentación de vaina	Nikon	PE-300-UT-L-SB-40	Iluminador LED frío
Fluoruro de fenilmetanosulfonilo	Sigma-Aldrich	78830	PMSF
Sal monopotásica de ácido fosfoenolpirúvico, 99%	BeanTown Chemical	129745	PEP
Pierce Coomassie (Bradford) Kit de ensayo de proteínas	Thermo Fisher Scientific	23200
Pierce Inhibidor de la proteasa Mini tabletas	Thermo Fisher Scientific	A32953
TUBERÍAS	Sigma-Aldrich	P6757	1,4-piperazinaácido dietanosulfónico
Plurónico F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Poli(etilenglicol)	Sigma-Aldrich	81300	PEG. Peso molecular medio 20.000 Da
Hidróxido de potasio (pellets/ACS certificado), Fisher Chemical	Fisher Scientific	P250-500	KOH
PowerEase 300W Fuente de alimentación (115 VAC)	ThermoFisher Scientific	PS0300	Fuente de alimentación de CC de la caja de gel
PS-12-8.4A	TE Technology	PS-12-8.4A	Fuente de alimentación de CC del controlador
de temperaturaPiruvato quinasa/enzimas lácticas deshidrogenasas del músculo de conejo	Sigma-Aldrich	P-0294	PK/LDH
Bomba de fuente Lifegard Quiet One, 296 galones por hora Bomba	pecera	Amazon	B005JWA612
Rosetta 2(DE3)pLysS Células competentes - Novagen	Millipore Sigma	71403	Celdas competentes
Sharp Microwave ZSMC0912BS Sharp 900W Horno de microondas de encimera, 0,9 pies cúbicos, acero inoxidable	Amazon	B01MT6JZMR	Microondas para hervir el agua
Cloruro de sodio (cristalino/ACS certificado), Fisher Chemical	Fisher Scientific	S271-500	NaCl
Dodecil sulfato de sodio	Sigma-Aldrich	L3771	SDS
Fosfato de sodio monobásico	Sigma-Aldrich	S8282	NaH2PO4
Proteína de estreptavidina	Thermo Fisher Scientific	21122
Sacarosa	Sigma-Aldrich	S7903
TC-720	Tecnología	TE TC-720	Controlador de temperatura
Tris Base, Grado de Biología Molecular - CAS 77-86-1 - Calbiochem	Sigma-Aldrich	648310	Tris-HCL
Tipo 45 Rotor Ti	Beckman Coulter	339160
Rotor Tipo 70 Ti	Beckman Coulter
Rotor 337922 Tipo 70.1 Ti	Beckman Coulter	342184
VWR Cinta de etiquetado de laboratorio de uso general	VWR	89097-916	Cintas de papel
VWR Micro Cubreobjetos, cuadrados, n.º 1 1/2	VWR	48366-227	Cubreobjetos de vidrio
VWR Liso y esmerilado Micro portaobjetos, Premium	VWR	75799-268	Portaobjetos
de vidrio XCell SureLock Mini-Cell	ThermoFisher Scientific	EI0001	Caja de gel
ZYLA 5.5 USB3.0 Cámara	CCD monocromática	Nikon	ZYLA5.5-USB3