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Artículo de método

Hibridación en situ de montaje completo en embriones de pez cebra y ensayo de formación de tubos en iPSC-CE para estudiar el papel de la endoglina en el desarrollo vascular

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DOI:

10.3791/60498

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28 de mayo de 2020

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1Department of Physiology and Department of Cardiology of the Second Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2Department of Cell Biology, State Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 3Wuxi Lung Transplant Center, Wuxi People's Hospital affiliated to Nanjing Medical University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí se presenta un protocolo para el análisis de hibridación de ARN in situ de montaje completo en ensayos de formación de peces cebra y tubos en células endoteliales derivadas de células madre inducidas por el paciente para estudiar el papel de la endoglina en la formación vascular.

Resumen

El desarrollo vascular se determina mediante la expresión secuencial de genes específicos, que pueden ser estudiados mediante la realización de ensayos de hibridación in situ en peces cebra durante diferentes etapas de desarrollo. Para investigar el papel de la endoglina (eng) en la formación de recipientes durante el desarrollo de telangiectasia hemorrágica hereditaria (HHT), se utiliza el derribo dirigido a morfolino de eng en peces cebra para estudiar su expresión temporal y funciones asociadas. Aquí, la hibridación de ARN in situ de montaje completo (WISH) se emplea para el análisis de eng y sus genes aguas abajo en embriones de pez cebra. Además, los ensayos de formación de tubos se realizan en células endoteliales diferenciadas por células madre pluripotentes inducidas por el paciente de HHT (iPSC-CE; con mutaciones eng). Un sistema de amplificación de señal específico que utiliza toda la cantidad In Situ Hybridization – WISH proporciona una mayor resolución y resultados de fondo más bajos en comparación con los métodos tradicionales. Para obtener una mejor señal, el tiempo posterior a la fijación se ajusta a 30 minutos después de la hibridación de la sonda. Debido a que la tinción por fluorescencia no es sensible en los embriones de pez cebra, se sustituye por la tinción de diaminobezidina (DAB) aquí. En este protocolo, las líneas iPSC derivadas del paciente de HHT que contienen una mutación eng se diferencian en células endoteliales. Después de recubrir una placa con matriz de membrana de sótano durante 30 min a 37 oC, los iPSC-CE se siembran como monocapa en pozos y se mantienen a 37 oC durante 3 h. A continuación, la longitud del tubo y el número de ramas se calculan utilizando imágenes microscópicas. Así, con este protocolo WISH mejorado, se demuestra que la reducción de la expresión eng afecta a la formación de progenitores endoteliales en embriones de pez cebra. Esto se confirma además mediante ensayos de formación de tubos que utilizan iPSC-ECs derivados de un paciente con HHT. Estos ensayos confirman el papel del eng en el desarrollo vascular temprano.

Introducción

Se ha notificado una sola mutación en eng (CD105) en pacientes con HHT. La mutación conduce a una mayor proliferación de las CE y a una reducción del alargamiento de las CE mediada por el flujo1,2. También se ha informado previamente que la deficiencia de ENG reduce la expresión de marcadores endoteliales (es decir, kdrl, cdh5, hey2) en el pez cebra3. La endoglina, expresada principalmente en células endoteliales, es una glicoproteína transmembrana y funciona como un co-receptor para la transformación de los miembros de la familia factor de crecimiento (TGF-). Dirige la unión BMP9 a la superficie celular para regular el gen aguas abajo, incluida la expresión Id1, para inducir la diferenciación de células madre hacia las CE4. Por lo tanto, el gen eng desempeña un papel importante en la vasculogénesis y la enfermedad vascular humana5,6. Hemos examinado previamente los efectos del derribo de endogina en la formación de buques en embriones de pez cebra, seguido de un análisis de las CE derivadas de iPSC adquiridas a un paciente con HHT que lleva una mutación7. Este protocolo demuestra los efectos de la deficiencia de ENG en la expresión del marcador de progenitor endotelial y la formación de tubos, que es un método cuantificable para medir la angiogénesis in vitro.

Para estudiar la expresión espacial y temporal, WISH se emplea para detectar la expresión génica in vivo8. La hibridación in situ (ISH) es un método de uso de sondas etiquetadas con secuencias de complemento de ácidos nucleicos diana (ADN o ARNm) para detectar y visualizar híbridos de ácido nucleico objetivo en una muestra fija. El proceso amplifica las señales de expresión génica in vivo y se utiliza para detectar la expresión de genes mediante microscopía. WISH ha sido ampliamente utilizado en varios animales modelo, especialmente en peces cebra9. También se utiliza para adquirir los siguientes datos: 1) patrones de expresión espacial/temporal del gen, que proporcionan información sobre la función y clasificación del gen; y 2) marcadores genéticos expresados específicamente que se utilizan en fármacos de alto rendimiento o cribado mutante10.

Las sondas cromogénicas se degradan fácilmente con la hibridación in situ del cromosoma tradicional (CISH), lo que da como resultado un alto ruido de fondo y señales inespecíficas11,12. El método WISH utiliza dos sondas Z dobles independientes, que están diseñadas para hibridizar a las secuencias de ARN de destino. Cada sonda contiene una secuencia de 18-25 complementaria al ARN objetivo y una secuencia de cola de 14 bases (conceptualizada como Z). Los sondeos de destino se utilizan en un par (doble Z). Las dos secuencias de cola juntas forman un sitio de hibridación de 28 bases para el preamplificador, que contiene 20 sitios de unión para el amplificador. El amplificador, a su vez, contiene 20 sitios de unión para la sonda de etiquetas y teóricamente puede producir hasta 8.000 etiquetas para cada secuencia de ARN de destino.

Esta avanzada tecnología facilita la amplificación simultánea de la señal y la supresión de fondo para lograr la visualización de una sola molécula, preservando al mismo tiempo la morfología tisular13. La modificación adicional de los métodos WISH se basa en investigaciones anteriores14,incluyendo fijación adicional y tinción DAB. Aquí se proporciona un protocolo WISH mejorado que puede funcionar incluso si el ARN objetivo se reduce o degrada parcialmente. Las ventajas incluyen que se puede completar en 24 h sin condiciones libres de RNase. Las señales también se pueden detectar simultáneamente a través de múltiples canales desde múltiples destinos, y los resultados son consistentes y compatibles con los resultados de diferentes plataformas de automatización de alto rendimiento.

Los resultados de modelos animales no son necesarios reflejan el mismo fenómeno que ocurre en los seres humanos. ENG contiene dos pares de ciisteínas conservadas, C30-C207 y C53-C182, que forman puentes de disulfuro en regiones huérfanas. Para seguir estudiando el papel del eng en pacientes con HHT, se han llevado a cabo ensayos de formación de tubos con iPSC derivados de pacientes con HHT en células sin/con mutaciones eng (Cys30Arg, C30R)15. Después de que Kubota et al. informaron por primera vez el experimento de formación detubos 16,el ensayo se ha desarrollado de varias maneras. Se ha utilizado para identificar factores angiogénicos o antiangiogénicos, definir las vías de señalización en la angiogénesis e identificar genes que regulan la angiogénesis17.

Antes de la disponibilidad de iPSC-CE derivados del paciente, los investigadores utilizaron principalmente ECs cultivados para estudiar la angiogensis16. Sin embargo, para las células endoteliales, es un desafío técnico transducir genes exógenos con un virus, debido al número limitado de pasaje al que pueden sufrir las ECs. Esto se debe a que no hay suficiente material celular para ser recogido de los vasos humanos ya sea de la cirugía o donantes aprobados a juego. Con la invención de la técnica de generación iPSC por Shinya Yamanaka, los CE humanos derivados de iPSC se pueden utilizar de forma fiable en experimentos in vitro, como se informó anteriormente18.

El uso de EC transducidos viralmente con números y pasajes limitados puede ser suficiente para los estudios de señalización, pero para los estudios funcionales, es mejor generar líneas de células madre pluripotentes mutadas , (ya sea iPSCs o hESC dirigidas a CRISPER/Cas9), luego diferenciarlas en EC para estudios de angiogénesis que utilizan ensayos de formación de tubos19. La formación de tubos se puede utilizar para evaluar la función de las células endoteliales que tienen mutaciones en los rodamientos. Este protocolo también describe la formación de tubos en una placa de angiogénesis de deslizamiento, que es un método fácil, rentable y reproducible.

El protocolo siguiente proporciona un método fiable y sistémico para estudiar el papel de genes específicos en la formación vascular, junto con detalles para el patrón de expresión in vivo y la cuantificación funcional in vitro para el modelado de enfermedades humanas.

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Protocolo

Todos los experimentos con animales descritos fueron aprobados por el Comité de ética de la investigación de la escuela de medicina de la Universidad de Zhejiang.

1. Hibridación in situ de montaje completo

  1. La cría y reproducción de la línea de peces zebra
    1. Alimentar y criar todo el pez cebra adulto a 26-28 oC en un sistema de acuicultura recirculante con 14 h de luz/10 h de ciclo oscuro para cada día. Utilice líneas de peces cebra AB (tipo salvaje) para los siguientes procedimientos.
    2. Ponga una capa de guijarros en el fondo de la caja de cría como refugio para los huevos. Agrupe el pescado parental en la proporción de 2:1 (es decir, dos hembras y un macho) en cada caja. Deja que los peces hembra desoven durante 1 día. Al final del desove, retire el pescado principal inmediatamente para evitar que se comaran los huevos.
    3. Inyectar el 2 ng de morfolinos y 500 pg de ARNm en embriones de una célula en una etapa utilizando el sistema de inyección Femto Jet bajo un microscopio (secuencia endoglin-MOs: 5'-GATGAACACACCTCTGTCTT-3'; 5-mispair control MOs secuencia: 5'-AAACAGACACATCATTCCTCTCTC-3').
    4. Incubar los cigotos en agua ácida de mar a 27oC durante aproximadamente 48 h.
  2. Recogida y fijación de embriones de pez cebra
    1. Utilice una pipeta de transferencia de plástico para recoger 20-40 embriones de pez cebra del sistema circulante de agua (pH a 5,0) en un tubo de 1,5 ml cuando se descortan y alcanzan un período específico de desarrollo. Añadir 1 ml de solución 4% PFA recién preparada a temperatura ambiente (RT).
      NOTA: El período en el que el embrión elegido se basa en el propósito del experimento. La Tabla 1 muestra el tiempo de fijación requerido para diferentes períodos embrionarios.
    2. Retire la solución de fijación, lave los embriones con solución tamponada con fosfato con Tween-20 (PBST, diluir 1 ml de interpolación en 1000 ml de solución PBS) 3x durante 5 minutos cada uno en RT.
    3. Deshidratar los embriones a través de la incubación en una serie de 25%, 50% y 75% metanol (diluido en PBST) durante 5 min cada uno. Transfiera embriones al 100% del metanol durante 5 minutos y sustitúyalos por metanol fresco. Almacene los embriones a -20 oC durante la noche o durante más tiempo.
  3. Hidratación y digestión
    1. Los embriones de hidrato que se conservaron en metanol 100% usando un tamiz con malla de nylon en la parte inferior para lavar secuencialmente embriones en los pozos de 12 placas de pozos con una serie de 75%, 50% y 25% metanol (diluido en PBST) durante 5 min cada uno. Lave los embriones con PBST 3x durante 5 minutos cada uno en RT.
    2. Añadir 50 l de proteinasa K (10 mg/ml) en el tubo con embriones y seguir el tiempo de digestión en la Tabla 2 en RT.
    3. Retire la proteinasa K y lave los embriones con PBST 3x durante 5 minutos cada uno en RT.
  4. Hibridación de sondas y post-fijación
    1. Coloque las sondas diseñadas de acuerdo con las secuencias de ARNm de cada gen en un sistema de hibridatina de 40 oC hasta que el precipitado se disuelva, que debe tomar 10 min. Mezclar las sondas diana de por ejemplo (XM_007116.7) y otros dos genes importantes implican en la formación de prógeno endotér temprano (aquí, aplnr [NM_001075105.1] y nrp1a [NM_001040326.1]) en un tubo de 1,5 ml en una relación 50:1:1.
    2. Añadir 50-100 l de sondas diana mixtas en cada tubo con embriones, luego incubar durante la noche a 40 oC.
      NOTA: Las sondas premezcladas deben precalentarse a 40 oC y enfriarse a RT antes de su uso.
    3. Preparar una solución de citrato de sodio salino 0,2x con Tween-20 (SSCT): disolver 175,3 g de NaCl y 88 g de citrato de sodio en 1 L de dH2O para obtener una solución SSC de 20x. A continuación, diluya la solución 1:100 en dH2O para obtener una solución de 0,2 x SSCT. Diluir Tween-20 1:1000 en la solución SSCT 0.2x.
    4. Transfiera las sondas recicladas a un tubo nuevo. Lave los embriones en 0,2x solución SSCT 3x durante 15 min cada uno en RT. Las sondas recicladas se pueden reutilizar 5x-10x.
    5. Utilice un 4% de paraformaldehído (PFA) para fijar los embriones durante 30 minutos en RT. Lave los embriones en 0,2x solución SSCT 3x durante 15 minutos cada uno en RT.
      NOTA: El trabajo de Gross-Thebing et al. sugiere un período posterior a la fijación de 10 min14, pero la cantidad real debe ajustarse en consecuencia. Aquí, probamos 10 min después de la fijación 3x, y la sensibilidad de la muerte DAB está significativamente influenciada. Después de investigar, asegúrese de que 0.5-1.0 h de fijación es la condición óptima (un período de fijación más corto no puede producir una señal clara del ARN objetivo, y la extensión adecuada del tiempo de fijación ayuda a fortalecer la señal y proporcionar menos ruido de fondo).
  5. Hibridación secuencial de amplificadores y sondas de etiquetas
    1. Retire la solución SSCT y sustitúyala con 50 s de Amp 1. Permita que los embriones se asienten en Amp 1 a 40 oC durante 30 min. A continuación, lave los embriones en 0,2x solución SSCT 3x durante 15 min cada uno en RT.
    2. Retire la solución SSCT y añada 50 l de Amp 2. Permita que los embriones se asienten a 40 oC durante 15 min. A continuación, lave los embriones en 0,2x solución SSCT 3x durante 15 min cada uno en RT.
    3. Retire la solución SSCT, añada 50 sl de Amp 3 y toque el tubo suavemente. A continuación, incubar los embriones a 40oC durante 30 min. Lavar los embriones en 0,2x solución SSCT 3x durante 15 min cada uno a RT.
    4. Retire la solución SSCT, añada 50 s de Amp 4 dropwise y toque cuidadosamente el tubo. A continuación, incubar los embriones a 40oC durante 15 min. Lavar los embriones en 0,2x SSCT 3x durante 15 min cada uno en RT.
  6. Contramanchas y microscopía
    1. Retire la solución SSCT y añada 50 l de DAPI a cada tubo. Incubar los embriones durante la noche a 4oC.
    2. Lave los embriones con PBST y prepárelos para la toma de imágenes utilizando una solución de agarosa de punto de fusión bajo (LMP) del 1% (1 g de LMP disuelto en 100 ml de dH2O) en un plato de Petri lleno de PBST.
    3. Utilice un kit de sustrato de peroxidasa DAB para manchar la muestra. Agregue los reactivos de color A, B y C (50 ml cada uno) a 1 ml de agua destilada y mezcle bien para obtener un fluido de trabajo DAB completo. Añadir el líquido a la muestra y cubrir durante 10 min.
    4. Lave bien la muestra con PBST después de la tinción.
    5. Utilice un microscopio óptico con una función fotográfica para tomar imágenes de las muestras.
      NOTA: Si toma imágenes más tarde, los tubos deben envolverse en papel de aluminio y almacenarse a 4 oC.

2. Ensayo de formación de tubos

NOTA: Los CE mutantes y salvajes (control) se diferenciaron de los iPSC derivados de un paciente con HHT (aquí, una paciente de 62 años con epistaxis recurrente desde 22 años, sangrado gastrointestinal, malformaciones arteriovenosas pulmonares, que lleva una mutación de desenfadamiento en la posición c.88T>C de exón 2) y un donante sano (sin mutación eng), que fueron proporcionados por El Hospital Universitario de la Universidad Médica con la aprobación del comité de ética de investigación universitaria.

  1. Cultivos celulares de control y HHT iPSC
    1. Añadir un cierto volumen de matriz de membrana de sótano (por ejemplo, Matrigel) a una placa de cultivo celular de 6 pozos para cubrir la parte inferior del pozo e incubar las placas durante 1 h a 37 oC.
      NOTA: Cuando utilice por primera vez la matriz de membrana del sótano almacenada a -20 oC, incubar sobre hielo o en un refrigerador de 4 oC sin heladas hasta que se descongele. A continuación, diluir a 1:100 en DMEM/F12, luego distribuir el diluyente en tubos de 200 l que contengan 100 l cada uno. Almacene los tubos a -20 oC y evite la congelación y descongelación repetidas. Al añadir la matriz de membrana sótano diluida, no cree burbujas. Después de añadir la matriz de membrana del sótano diluido, agitar la placa de 6 pozos suavemente a mano para que cubra uniformemente la parte inferior.
    2. Después de recubrir la placa, retire la solución de matriz de membrana del sótano utilizada de los pozos. A continuación, agregue 2 ml de mTeSR1 medio en cada poc, y plato los iPSC cosechados del último pasaje a aproximadamente 1 x 106 por pozo.
  2. Generación y expansión de ECs a partir de iPSCs
    1. Después de aproximadamente 4 días de cultivo iPSC, cambie el medio de cultivo con el medio BEL complementado con activin A (25 ng/mL), BMP4 (30 ng/mL), VEGF165 (50 ng/mL) y CHIR99021 (1,5 m). Crecer las células durante 3 días para generar células mesoderm.
    2. Sustituya el medio descrito en el paso 2.2.1 por el medio BEL complementado con VEGF (50 ng/mL) y SB431542 (10 oM) durante 4 días para ampliar los ECs vasculares. Tratar las células con el mismo medio y cultivo durante otros 3-4 días.
    3. Utilice CD31-dynabeads para purificar los EC vasculares maduros: consulte las instrucciones del kit CD31-dynabeads, que vincula el anticuerpo HUMANO CD31 con cuentas magnéticas para combinar moléculas CD31 expresadas en ECs, luego recoja las células CD31 positivas por búfer de elución. Mantener y ampliar los CE purificados en medio EC-SFM que contienen VEGF165 (30 ng/mL), bFGF (30 ng/mL) y FBS (1%).
  3. Chapar células endoteliales en placas recubiertas de Matrigel y microscopía
    1. Añadir 10 l de matriz de membrana de sótano por pozo para recubrir las placas de angiogénesis (ver Tabla de materiales)e incubar a 30 min a 37oC.
    2. Cosecha las células endoteliales después de revisar los marcadores endoteliales CD31 y VE-cadherina con tinción por inmunofluorescencia y resuspend en el medio de crecimiento endotelial 2 por pipeteo repetidamente. Añadir 50 l de suspensión celular (2 x 105 células/ml) por pozo en la matriz solidificada e incubar las células durante 3-5 h a 37 oC.
      NOTA: Antes del experimento de formación de tubos, se deben comprobar los marcadores endoteliales para asegurarse del fenotipo adecuado de las células endoteliales funcionales. 1 x 104 celdas por pozo es un número ideal para la formación de tubos. Demasiadas o muy pocas células no son propicias para la formación de tubos. Añadir células desde el lado de la placa y no tocar la matriz de membrana del sótano. Utilice el microscopio de luz en el campo de alto aumento para comprobar las células y tomar fotos.
  4. Resultados cuantitativos de la formación de tubos
    1. Observe los resultados con un microscopio de alta resolución y tome fotografías de al menos 10 áreas para que cada grupo obtenga estadísticas de datos fiables.
    2. Examinar la formación del tubo endotelial: estimar la extensión de la formación del tubo mediante la inspección de la longitud total del tubo, el número de tubo y los puntos de rama. Evalúe y cuente el número y la longitud de las sucursales utilizando el software ImageJ.

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Resultados

La hibridación in situ de montaje completo se basa en un principio similar a la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia. Está diseñado para mejorar tanto la sensibilidad como la especificidad en el ISH del pez cebra, así como para amplificar las señales específicas del objetivo sin afectar la señal de fondo.

En 24 embriones de pez cebra hpf, la endoglina está muy expresada en la vena cardinal posterior ...

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Discusión

Este protocolo aplicó una plataforma mejorada de análisis de ARN in situ de montaje integral para ensayos de formación de peces cebra y tubos en iPSC-ECs derivados de un paciente con HHT. El método ISH tradicional requiere un ciclo experimental más largo con pasos experimentales adicionales. El protocolo tiene algunas mejoras importantes, el uso de sondas Z dobles independientes e iPSC derivados de un paciente con HHT que se aplicaron en ensayos WISH y formación de tubos, respectivamente. Estos refinamientos son cruciale...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de la célula madre de China y la investigación traslacional [número de subvención 2016YFA0102300 (a Jun Yang)];la Fundación para la Ciencia de la Naturaleza de China [concesión número 81870051, 81670054 (a Jun Yang)]; el Fondo de Innovación CAMS para Ciencias Médicas (CIFMS) [número de subvención 2016-I2M-4-003 (a Jun Yang)]; puMC Youth Found y los Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades Centrales [número de subvención 2017310013 (a Fang Zhou)].

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
µ-Slide Angiogenesisibidi81506Amplificador de cultivo celular
1-FLACDSDSamplificador de amplificación de señal
2-FLACDSDSamplificación
de señal 3-FLACDSDSamplificación de señal
Alt B-FLACDSDSamplificación
Corning Matrigel MatrixCorning354234Matrigel con factor de crecimiento reducido
DEPCSigmaD5758Agua libre de ARNasa
Endotelial humano-SFMThermofisher11111044 Cultivo celular
ParaformaldehídoSigma30525-89-4Embriones fijos
ParaformaldehídoSigma30525-89-4Células fijas
Proteasa KACDSDSTejido de digestión
Citrato de sodioSigma6132-04-3Solución SSCT: Tampón de lavado
VEGF-165STEMCELL Technologies78073Factor de crecimiento
320852 320853 amplificador de 320854 amplificador de 4 320856 de señal 322337

Referencias

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