Aquí se presenta un protocolo para el análisis de hibridación de ARN in situ de montaje completo en ensayos de formación de peces cebra y tubos en células endoteliales derivadas de células madre inducidas por el paciente para estudiar el papel de la endoglina en la formación vascular.
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Artículo de método
Hibridación en situ de montaje completo en embriones de pez cebra y ensayo de formación de tubos en iPSC-CE para estudiar el papel de la endoglina en el desarrollo vascular
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Resumen
Resumen
El desarrollo vascular se determina mediante la expresión secuencial de genes específicos, que pueden ser estudiados mediante la realización de ensayos de hibridación in situ en peces cebra durante diferentes etapas de desarrollo. Para investigar el papel de la endoglina (eng) en la formación de recipientes durante el desarrollo de telangiectasia hemorrágica hereditaria (HHT), se utiliza el derribo dirigido a morfolino de eng en peces cebra para estudiar su expresión temporal y funciones asociadas. Aquí, la hibridación de ARN in situ de montaje completo (WISH) se emplea para el análisis de eng y sus genes aguas abajo en embriones de pez cebra. Además, los ensayos de formación de tubos se realizan en células endoteliales diferenciadas por células madre pluripotentes inducidas por el paciente de HHT (iPSC-CE; con mutaciones eng). Un sistema de amplificación de señal específico que utiliza toda la cantidad In Situ Hybridization – WISH proporciona una mayor resolución y resultados de fondo más bajos en comparación con los métodos tradicionales. Para obtener una mejor señal, el tiempo posterior a la fijación se ajusta a 30 minutos después de la hibridación de la sonda. Debido a que la tinción por fluorescencia no es sensible en los embriones de pez cebra, se sustituye por la tinción de diaminobezidina (DAB) aquí. En este protocolo, las líneas iPSC derivadas del paciente de HHT que contienen una mutación eng se diferencian en células endoteliales. Después de recubrir una placa con matriz de membrana de sótano durante 30 min a 37 oC, los iPSC-CE se siembran como monocapa en pozos y se mantienen a 37 oC durante 3 h. A continuación, la longitud del tubo y el número de ramas se calculan utilizando imágenes microscópicas. Así, con este protocolo WISH mejorado, se demuestra que la reducción de la expresión eng afecta a la formación de progenitores endoteliales en embriones de pez cebra. Esto se confirma además mediante ensayos de formación de tubos que utilizan iPSC-ECs derivados de un paciente con HHT. Estos ensayos confirman el papel del eng en el desarrollo vascular temprano.
Introducción
Se ha notificado una sola mutación en eng (CD105) en pacientes con HHT. La mutación conduce a una mayor proliferación de las CE y a una reducción del alargamiento de las CE mediada por el flujo1,2. También se ha informado previamente que la deficiencia de ENG reduce la expresión de marcadores endoteliales (es decir, kdrl, cdh5, hey2) en el pez cebra3. La endoglina, expresada principalmente en células endoteliales, es una glicoproteína transmembrana y funciona como un co-receptor para la transformación de los miembros de la familia factor de c....
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Protocolo
Todos los experimentos con animales descritos fueron aprobados por el Comité de ética de la investigación de la escuela de medicina de la Universidad de Zhejiang.
1. Hibridación in situ de montaje completo
- La cría y reproducción de la línea de peces zebra
- Alimentar y criar todo el pez cebra adulto a 26-28 oC en un sistema de acuicultura recirculante con 14 h de luz/10 h de ciclo oscuro para cada día. Utilice líneas de peces cebra AB (tipo salvaje) para los siguientes procedimientos.
- Ponga una capa de guijarros en el fondo de la caja de cría como refugio para los huevos. Agrupe el pescado parental en la proporció....
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Resultados
La hibridación in situ de montaje completo se basa en un principio similar a la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia. Está diseñado para mejorar tanto la sensibilidad como la especificidad en el ISH del pez cebra, así como para amplificar las señales específicas del objetivo sin afectar la señal de fondo.
En 24 embriones de pez cebra hpf, la endoglina está muy expresada en la vena cardinal posterior .......
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Discusión
Este protocolo aplicó una plataforma mejorada de análisis de ARN in situ de montaje integral para ensayos de formación de peces cebra y tubos en iPSC-ECs derivados de un paciente con HHT. El método ISH tradicional requiere un ciclo experimental más largo con pasos experimentales adicionales. El protocolo tiene algunas mejoras importantes, el uso de sondas Z dobles independientes e iPSC derivados de un paciente con HHT que se aplicaron en ensayos WISH y formación de tubos, respectivamente. Estos refinamientos son cruciale.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de la célula madre de China y la investigación traslacional [número de subvención 2016YFA0102300 (a Jun Yang)];la Fundación para la Ciencia de la Naturaleza de China [concesión número 81870051, 81670054 (a Jun Yang)]; el Fondo de Innovación CAMS para Ciencias Médicas (CIFMS) [número de subvención 2016-I2M-4-003 (a Jun Yang)]; puMC Youth Found y los Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades Centrales [número de subvención 2017310013 (a Fang Zhou)].
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| µ-Slide Angiogenesis | ibidi | 81506 | Amplificador de cultivo celular |
| 1-FL | ACD | SDS | amplificador de amplificación de señal |
| 2-FL | ACD | SDS | amplificación |
| de señal 3-FL | ACD | SDS | amplificación de señal |
| Alt B-FL | ACD | SDS | amplificación |
| Corning Matrigel Matrix | Corning | 354234 | Matrigel con factor de crecimiento reducido |
| DEPC | Sigma | D5758 | Agua libre de ARNasa |
| Endotelial humano-SFM | Thermofisher | 11111044 Cultivo celular | |
| Paraformaldehído | Sigma | 30525-89-4 | Embriones fijos |
| Paraformaldehído | Sigma | 30525-89-4 | Células fijas |
| Proteasa K | ACD | SDS | Tejido de digestión |
| Citrato de sodio | Sigma | 6132-04-3 | Solución SSCT: Tampón de lavado |
| VEGF-165 | STEMCELL Technologies | 78073 | Factor de crecimiento |
Referencias
- Jin, Y., et al. Endoglin prevents vascular malformation by regulating flow-induced cell migration and specification through VEGFR2 signalling. Nature Cell Biology. 19 (6), 639-652 (2017).
- Sugden, W. W., et al.
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Reimpresiones y permisos
