Aquí, mostramos cómo realizar la microscopía intravital en los ventosos post-capilares del músculo cremaestro del ratón. Comúnmente aplicados a diferentes modelos de inflamación y sepsis, particularmente los inducidos por quimioquinas y citoquinas, destacamos su relevancia en el estudio de las muscolopatías que implican una infiltración exagerada de leucocitos musculares.
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Artículo de método
Infiltración de leucocitos del músculo cremaestro en ratones evaluado por microscopía intravital
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
La microscopía intravital (IVM) se utiliza ampliamente para monitorear los procesos fisiológicos y fisiopatológicos dentro de la cascada de reclutamiento de leucocitos in vivo. El protocolo actual representa un método práctico y reproducible para visualizar la interacción del leucocito endotelio que conduce al reclutamiento de leucocitos en el tejido derivado del músculo esquelético dentro del organismo intacto del ratón. El modelo es aplicable a todos los campos de investigación que se centran en la activación de granulocitos y su papel en la enfermedad.
Proporcionamos un protocolo paso a paso para guiar a través del método y resaltar posibles escollos y dificultades técnicas. El protocolo cubre los siguientes aspectos: ajustes experimentales y material requerido, anestesia del ratón, disección del músculo cremaestro, así como cánula traqueal y carótida, grabaciones de IVM y análisis fuera de línea. Los formatos de datos como leucocitos adherentes, flujo rodante (RF) y fracción de flujo rodante (RFF) se explican en detalle y se discuten las aplicaciones adecuadas. Los resultados representativos de los ratones mdx con deficiencia de distrofina se proporcionan en la sección de resultados.
IVM es una poderosa herramienta para evaluar el reclutamiento de leucocitos en un entorno in vivo; sin embargo, la delinear, por ejemplo, la función endotelial y leucocito puede requerir una combinación con configuraciones ex vivo como experimentos de cámara de flujo. Además, los antecedentes genéticos de los animales de interés pueden influir en gran medida en el reclutamiento de líneas de base, lo que requiere una afinación individual del protocolo proporcionado. A pesar de sus limitaciones, IVM puede servir como una plataforma para traducir fácilmente los hallazgos in vitro en un organismo vertebrado vivo.
Introducción
La microscopía intravital (IVM) es una herramienta comúnmente aplicada en el campo de la biología de leucocitos. El reclutamiento de leucocitos sigue una cascada de eventos bien definidos iniciados por la captura de leucocitos, laminación y adhesión a la pared endotelial, y finalmente la transmigración y extravasación de leucocitos al sitio real de la inflamación1. Cada paso está mediado y controlado por varias quimioquinas (por ejemplo, IL-8/CXCL8), receptores (por ejemplo, LFA-1, Mac-1) y las moléculas de adhesión de células endoteliales correspondientes (por ejemplo, ICAM-1, VCAM-1 y E-Selectin)2,
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Protocolo
Los animales fueron alojados bajo condiciones controladas y específicas libres de patógenos en el IBF (Interfakult-re Biomedizinische Forschungseinrichtung), Heidelberg. Todos los procedimientos descritos aquí fueron aprobados por el IRB local y el Regierungspraesidium Karlsruhe, Baden-Wuerttemberg, Alemania.
1. Administración de anestesia
- Anestetizar el ratón mediante inyección intraperitoneal (i.p.) de bolo de 125 mg/kg de ketamina y 12,5 mg/kg de xilazina.
- Coloque y fije el ratón en una posición dorsal reclinada en una almohadilla de calentamiento para mantener la temperatura corporal del ratón (36,5-38 oC). Utilice u....
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Resultados
IVM según el protocolo proporcionado proporcionará información única sobre la cascada de reclutamiento de leucocitos en el músculo esquelético. La sección de resultados se centrará en los resultados típicos obtenidos por IVM y resaltará los posibles problemas que puedan surgir.
La configuración experimental para la microscopía intravital se describe en la Figura 1. La preparación del músculo cremaestro y la eliminación del tejido conectivo es crucial para obtener .......
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Discusión
IVM como método se ha utilizado ampliamente para estudiar diferentes tipos de células en diferentes órganos y ha sido ampliamente descrito y discutido19. El objetivo principal de este estudio es proporcionar un enfoque eficiente para configurar y realizar IVM en el músculo cremaestro. La práctica del método producirá resultados fiables y reproducibles. Por lo tanto, la planificación y la estandarización son factores clave para dominar la técnica. Sobre todo, la técnica es muy dependiente de los pa.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por el Ministerio Federal Alemán de Educación e Investigación (BMBF) 01GL1746E como parte del Consorcio PRIMAL. Los autores reconocen a Britta Heckmann y Silvia Pezer por su hábil asistencia técnica.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Material | |||
| Ketanest S | Pfizer Pharma GmbH | PZN: 08509909 | anestesia. Genérico / IUPAC Nombre: ketamina |
| Xilacina | CP-Pharma GmbH | Nº de artículo: 1205 | anestesia. Nombre genérico / IUPAC: xilacina (como clorhidrato) |
| Solución salina | B. Braun Melsungen | PZN 02737756 | preparación quirúrgica. Genérico / IUPAC Nombre: cloruro de sodio |
| Aguja de jeringa Omnican F | B. Braun Melsungen | REF 9161502 | preparación quirúrgica |
| Sutura 6/0 USP | Resorba | REF 4217 | preparación quirúrgica |
| Tubo de polietileno #10 | BD GmbH | Proveedor n.º 427401 | preparación quirúrgica |
| Tubo de polietileno #90 | BD GmbH | Proveedor n.º 427421 | preparación quirúrgica |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | Número CAS 989-38-8 | Tinción de leucocitos. Genérico / Nombre IUPAC: etilo 2-[3-(etilamino)-6-etilimino-2,7-dimetilxanteno-9-il]benzoato |
| Equipo de configuración | |||
| Microscopio vertical | Olimpo | Microscopía | BX51W1 |
| de 40 veces objetivo | Zeiss | Achroplan 40 × /0.80 W | microscopía |
| ImSpector software | Lavision Biotec GmbH | ver. 4.0.469 | software |
| ImageJ | National Institute of Health, EE. UU | . ver. 1.51j8 | software |
Referencias
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Zanardo, R. C. O., et al.
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Reimpresiones y permisos
