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Artículo de método

Infiltración de leucocitos del músculo cremaestro en ratones evaluado por microscopía intravital

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DOI:

10.3791/60509

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15 de abril de 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neonatology, Heidelberg University Children's Hospital

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí, mostramos cómo realizar la microscopía intravital en los ventosos post-capilares del músculo cremaestro del ratón. Comúnmente aplicados a diferentes modelos de inflamación y sepsis, particularmente los inducidos por quimioquinas y citoquinas, destacamos su relevancia en el estudio de las muscolopatías que implican una infiltración exagerada de leucocitos musculares.

Resumen

La microscopía intravital (IVM) se utiliza ampliamente para monitorear los procesos fisiológicos y fisiopatológicos dentro de la cascada de reclutamiento de leucocitos in vivo. El protocolo actual representa un método práctico y reproducible para visualizar la interacción del leucocito endotelio que conduce al reclutamiento de leucocitos en el tejido derivado del músculo esquelético dentro del organismo intacto del ratón. El modelo es aplicable a todos los campos de investigación que se centran en la activación de granulocitos y su papel en la enfermedad.

Proporcionamos un protocolo paso a paso para guiar a través del método y resaltar posibles escollos y dificultades técnicas. El protocolo cubre los siguientes aspectos: ajustes experimentales y material requerido, anestesia del ratón, disección del músculo cremaestro, así como cánula traqueal y carótida, grabaciones de IVM y análisis fuera de línea. Los formatos de datos como leucocitos adherentes, flujo rodante (RF) y fracción de flujo rodante (RFF) se explican en detalle y se discuten las aplicaciones adecuadas. Los resultados representativos de los ratones mdx con deficiencia de distrofina se proporcionan en la sección de resultados.

IVM es una poderosa herramienta para evaluar el reclutamiento de leucocitos en un entorno in vivo; sin embargo, la delinear, por ejemplo, la función endotelial y leucocito puede requerir una combinación con configuraciones ex vivo como experimentos de cámara de flujo. Además, los antecedentes genéticos de los animales de interés pueden influir en gran medida en el reclutamiento de líneas de base, lo que requiere una afinación individual del protocolo proporcionado. A pesar de sus limitaciones, IVM puede servir como una plataforma para traducir fácilmente los hallazgos in vitro en un organismo vertebrado vivo.

Introducción

La microscopía intravital (IVM) es una herramienta comúnmente aplicada en el campo de la biología de leucocitos. El reclutamiento de leucocitos sigue una cascada de eventos bien definidos iniciados por la captura de leucocitos, laminación y adhesión a la pared endotelial, y finalmente la transmigración y extravasación de leucocitos al sitio real de la inflamación1. Cada paso está mediado y controlado por varias quimioquinas (por ejemplo, IL-8/CXCL8), receptores (por ejemplo, LFA-1, Mac-1) y las moléculas de adhesión de células endoteliales correspondientes (por ejemplo, ICAM-1, VCAM-1 y E-Selectin)2,3. La interacción de diferentes sitios reguladores, factores de control y mediadores de la cascada de reclutamiento de leucocitos como receptor de productos finales de glicación avanzada (RAGE), molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM-1), ligando de motivo C-X-C (CXCL)1/2 y su receptor CXCR2 fueron descubiertos utilizando IVM4,5,6,7,8,9.

El método de La iVM se ha descrito para muchos órganos y tejidos diferentes como el intestino10,la piel11,los ganglios linfáticos12,el saco de yema embrionaria13 y otros. Sin embargo, el método más ampliamente estudiado de IVM es el modelo cremaster, descrito por primera vez en ratas14. Mientras que todavía se utiliza en ratas15, el método se aplica hoy en día principalmente en ratones debido a la alta abundancia de diferentes líneas transgénicas. Nuestro grupo ha destacado recientemente el papel potencial de la iVM de cremaster en el campo de las muscolopatías inflamatorias como la distrofia muscular de Duchenne (DMD) estudiando ratones mdx deficientes en distrofina16. Debido a su composición delgada entretejida y de fácil acceso de fibra, el músculo cremaestro representa el músculo candidato ideal para ser estudiado como un montaje completo utilizando la microscopía ligera o fluorescente. El reclutamiento y la extravasación de leucocitos se llevan a cabo principalmente en los ventosos post-capilares, que se pueden identificar fácilmente en una capa muscular continua en el músculo cremaestro.

La ventaja de la imagen in vivo en comparación con otros ensayos in vitro es su contexto biológico en un organismo vivo. Al mismo tiempo, la delinear contribuciones específicas de las células al reclutamiento alterado de leucocitos puede requerir modelos in vitro adicionales como cámaras de flujo o ensayos endoteliales. La combinación de múltiples métodos producirá datos más convincentes. Los científicos deben ser conscientes de las limitaciones del modelo cremaster, ya que cualquier manipulación quirúrgica conducirá a un aumento del tráfico y reclutamiento de leucocitos. Por lo tanto, el reclutamiento de referencia es difícil de estimar con este método. A pesar de su amplia aplicación, IVM del cremaster puede ser difícil y una configuración novedosa puede tomar tiempo y recursos para establecer. Ahora proporcionamos un protocolo fácil que ayudará a evitar algunos de los errores comunes en IVM. Además, se discutirán las limitaciones y se resaltarán los métodos complementarios cuando corresponda.

IVM del cremaster representa un enfoque ideal para ser implementado en el campo de los estudios inflamatorios e infecciosos. Más específicamente, el modelo cremaster puede ser de alto interés para los científicos que estudian la biología del músculo esquelético en el contexto de la enfermedad inflamatoria.

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Protocolo

Los animales fueron alojados bajo condiciones controladas y específicas libres de patógenos en el IBF (Interfakult-re Biomedizinische Forschungseinrichtung), Heidelberg. Todos los procedimientos descritos aquí fueron aprobados por el IRB local y el Regierungspraesidium Karlsruhe, Baden-Wuerttemberg, Alemania.

1. Administración de anestesia

  1. Anestetizar el ratón mediante inyección intraperitoneal (i.p.) de bolo de 125 mg/kg de ketamina y 12,5 mg/kg de xilazina.
  2. Coloque y fije el ratón en una posición dorsal reclinada en una almohadilla de calentamiento para mantener la temperatura corporal del ratón (36,5-38 oC). Utilice una sutura estéril no absorbible (6/0) para enrollar un simple bucle alrededor de los dientes frontales y tape los extremos de unión de la sutura a la almohadilla de calentamiento. Esta fijación tiene como objetivo mantener la boca abierta con el fin de evitar perturbaciones en la respiración.
  3. Compruebe que el ratón esté en la profundidad adecuada de la anestesia mediante pellizco interdigital del dedo del dedo del dedo del dedo del sol (no se debe ver la retirada).
  4. Una vez que se alcanza suficiente anestesia proceder a la preparación quirúrgica. Confirme repetidamente la anestesia a lo largo del experimento en curso cada 30 minutos. Vuelva a administrar los medicamentos como se describió anteriormente si es necesario.
  5. Solución de sal fisiológica de equilibrio (PSS, composición: 132 mmol/L NaCl, 4,7 mmol/L KCl, 1,2 mmol/L MgS04, 2,0 mmol/L CaCl2, 18 mmol/L NaHCO3) con 5% CO2/95% N2 durante 15 minutos. Burbuja continuaps con 5% CO2/95% N2 a lo largo del experimento y mantener a 37 oC.

2. Preparación quirúrgica de la tráquea y la arteria carótida (opcional)

  1. Disecciona la piel de la zona del cuello tirando suavemente de la piel con pinzas en la línea media. Utilice tijeras para aplicar un corte circular de 1-2 cm de diámetro para dar suficiente espacio para la preparación quirúrgica.
  2. Disecciona cuidadosamente el músculo circundante, la grasa y los tejidos conectivos usando pinzas.
  3. Haga un corte transversal (1,3 mm) en la tráquea utilizando pequeñas tijeras quirúrgicas e introduzca un tubo de polietileno (I.D x O.D. 0.034" x 0.050") dentro del extremo caudal de la tráquea para asegurar las vías respiratorias superiores.
  4. Fijar el tubo situado en la tráquea por una sola sutura circular de nudo (6/0 USP).
  5. Localice la arteria carótida a lo largo del lado derecho de la tráquea y diseque el tejido circundante de la pared de la arteria carótida. Alternativamente, la yugular o también la vena de la cola podría ser utilizada para el acceso i.v. Trate de evitar lesiones en el nervio vagal, ya que se encuentra de cerca.
  6. Pasar dos piezas de sutura (6/0) debajo de la arteria carótida. Coloque la primera sutura craneal proximal, cerca de la bifurcación de las arterias carótidas y atarla permanentemente. La segunda sutura se ubicará a unos 5-8 mm de distal de la primera y más tarde se utilizará para asegurar el tubo en la arteria carótida. No lo ates todavía.
  7. Preparar un tubo de polietileno (I.D x O.D. 0.011" x 0.024") con una longitud de 30 cm doblando la parte final a una aguja de jeringa de 1 ml llena de salina (0,9% NaCl). El lavado riguroso es importante para evitar la embolización de aire durante la preparación.
  8. Utilice un clip de recipiente de 7 mm para sujetar la arteria carótida distalmente de la segunda sutura.
  9. Realice un pequeño corte transversal (0,5 mm) en la arteria carótida e introduzca el tubo de polietileno estéril. Fije el tubo en la arteria usando la segunda sutura preparada antes.
  10. Retire el clip del recipiente y aplique suavemente un poco de tensión a la jeringa conectada al tubo de polietileno. Este catéter carótida ahora se puede utilizar para administrar medicamentos o tomar muestras de sangre si es necesario, incluso es posible controlar la presión arterial o la frecuencia del pulso con los dispositivos respectivos.

3. Preparación quirúrgica del músculo cremaestro

  1. Transfiera el ratón en la almohadilla de calentamiento (junto con la almohadilla de calentamiento) al marco de plástico hecho a medida que sostiene el escenario para la microscopía posterior. Oriente el ratón con su escroto mirando hacia la etapa del microscopio.
    1. Reevaluar la profundidad de la anestesia antes de continuar; volver a administrar una dosis de anestesia de cuarto a medio si es necesario.
  2. Localizar el escroto, sosteniéndolo en su parte más distal usando pinzas, tirar suavemente y cortar una sección circular de la piel escrotal con aproximadamente 5 mm de diámetro. Asegúrese de no dañar las estructuras subyacentes como el músculo cremaestro. Asegúrese de mantener el tejido abierto bien hidratado con solución salina.
  3. Diseccione el tejido conectivo suelto con dos pinzas y localice ambas testículos.
  4. Sostenga un testículo distalmente y comience a sacarlo suavemente, eliminando el tejido conectivo circundante paso a paso.
  5. Una vez que el testis está exteriorizado, fijar su extremo distal al anillo de goma que rodea el escenario. Tras la exteriorización, hidratar el tejido con solución salina durante todo el proceso.
  6. Paso crítico: Retire cuidadosamente el tejido conectivo sin dañar el músculo cremaestro subyacente. El exceso de tejido conectivo puede obstruir la visión en la microscopía posterior y puede producir imágenes borrosas.
  7. Ancle la parte distal del testis hacia abajo y abra el músculo cremaestro con un pequeño corte transversal (aproximadamente 1 mm), seguido de una incisión longitudinal desde el extremo distal hasta el extremo proximal. Como resultado, el músculo cremaster debe abrirse esféricamente. El recipiente visible macroscópicamente no debe ser cortado, ya que esto puede afectar a la hemodinámica.
  8. Extienda cuidadosamente el músculo sobre la etapa de vidrio y anclelo al anillo de goma. Asegúrese de no tocar o dañar la región central, ya que la microscopía se realizará aquí.
    Precaución: El exceso de estiramiento puede obstruir el flujo sanguíneo.
  9. Ancle el testis restante a un lado para dar acceso a la región de interés. Asegúrese de humedecer con PSS repetidamente para evitar el secado. El músculo montado ya está listo para la microscopía.

4. Microscopía intravital

  1. Coloque el músculo cremaestro montado en el microscopio vertical y realice la microscopía utilizando un objetivo de 40x.
  2. Adquiera datos y exporte utilizando espectrografía de imágenes de alto rendimiento.
  3. Realizar grabaciones bajo superfusión continua con PSS17precalentado (35-37 oC). Aplicar la superfusión por un pequeño tubo que ha sido pegado al objetivo vertical del microscopio para permitir el goteo continuo de PSS junto con el objetivo hacia abajo sobre el tejido muscular.
  4. Identificar los venudios post-capilares (confluencia de dos vasos más pequeños) y medir la microcirculación en los venáculos con un diámetro de 20-40 m.
  5. Grabar imágenes de alta resolución de la microcirculación desde el músculo cremaestro en un rango de tiempo de 30 s. Como puede haber una ligera contracción y relajación del tejido muscular durante la grabación, asegúrese de ajustar continuamente el enfoque. Generalmente, el ratón tiende a exhibir una circulación estable durante aproximadamente 2 horas. Es posible adquirir varias grabaciones de diferentes buques de diferentes regiones. Uno o ambos testículos se pueden utilizar posteriormente.
    NOTA: Como se trata de un modelo de inflamación, las formas comunes de inducción son: aplicación sistémica o inyección escrotal local de mediadores pro inflamatorios, así como superfusión con por ejemplo N-Formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP). La estimulación local de TNF-- se utiliza comúnmente para desencadenar el reclutamiento de leucocitos; La endotoxemia inducida por LPS es un modelo de inflamación sistémica grave de SIRS.

5. Visualización de leucocitos

NOTA: Los leucocitos adherentes y rodantes se pueden ver fácilmente sin más visualización. Para determinar la velocidad de la línea central de los leucocitos que se mueven libremente, realice la tinción diferencial.

  1. Si se utilizan ratones etiquetados con eGFP, analícelos directamente mediante microscopía de fluorescencia.
  2. Para cepas de ratón no etiquetadas con eGFP, utilice la tinción de rodamina.
    1. Administrar rodamina 6G a 0,2 mg/kg de peso corporal. Pueden ser necesarias dosis repetidas para lograr suficientes intensidades de tinción. Asegúrese de mantener volúmenes pequeños, ya que los volúmenes más grandes pueden afectar a los parámetros hemodinámicos.
    2. Para la tinción instantánea de leucocitos, administre la mancha a través de la arteria carótida. Si no se ha realizado la disección de la arteria carótida, se puede lograr una tinción suficiente mediante la aplicación, es decir, con la misma dosis18. Como alternativa al cateterismo de la arteria carótida, se puede realizar cualquier otro cateterismo venoso.
      NOTA: Tenga en cuenta que la tinción de rodamina, a diferencia del etiquetado eGFP, muestra la decaimiento del tiempo de la intensidad de la fluorescencia, así como un máximo general de tinción de alrededor del 80% de los leucocitos a concentraciones más altas.
    3. Visualice leucocitos manchados de rodamina en movimiento libre mediante microscopía de fluorescencia.

6. Fin del experimento

NOTA: El tiempo estimado total para realizar este protocolo debe ser de 90 a 150 minutos.

  1. Terminar el experimento con la eutanasia por dislocación cervical.
  2. Para análisis posteriores, como la transmigración, fije el músculo cremaestro en PFA mientras todavía se estira en el escenario y se tiñe para la histología según sea necesario.

7. Análisis fuera de línea

  1. Analice los siguientes parámetros como recuentos simples durante la reproducción de vídeo.
    1. Calcular flujo rodante [number/min]: número de celdas rodantes que pasan por una línea imaginaria/min
    2. Calcular la adhesión [número/mm2]: número de células adhesivas a la pared del recipiente dentro del campo de visión 30 s/superficie vascular [mm2].
  2. Mida los siguientes parámetros hemodinámicos y microvasculares que se miden utilizando ImageJ.
    1. Calcule el diámetro del recipiente como el diámetro de la pared interior.
    2. Calcule la longitud del recipiente como la longitud de la línea central del recipiente.
    3. Calcule la Símbolo de micrómetro por segundo [μm/s] para la medición de la velocidad en ecuaciones científicas. velocidad de la línea central obtenida del análisis de vídeo de fotograma a fotograma de leucocitos en movimiento libre en la línea central.
  3. Utilice las siguientes ecuaciones como estimación.
    1. Calculate vascular surface in [mm2]: vessel length [μm] x vessel diameter [μm] x π x 10-6.
    2. Calcular la velocidad Análisis de equilibrio estático; Símbolo ΣFx=0; ilustración conceptual; educación física. de cizallamiento de Símbolo de micrómetro por segundo [μm/s] para la medición de la velocidad en ecuaciones científicas. la pared: 4,9 x (8 x velocidad de línea central x 0,625/diámetro del recipiente [m]).
    3. Calcular la velocidad Símbolo de micrómetro por segundo [μm/s] para la medición de la velocidad en ecuaciones científicas. media del Símbolo de micrómetro por segundo [μm/s] para la medición de la velocidad en ecuaciones científicas. flujo sanguíneo: velocidad de la línea central x 0,625.
    4. Calcular Ecuación que representa la medición de la velocidad en unidades de número por minuto para el análisis de datos experimentales. el flujo total de leucocitos: recuento Medición de la concentración en unidades de número por microlitro [número/μL], utilizada en cálculos de laboratorio. sistémico Símbolo de micrómetro por segundo [μm/s] para la medición de la velocidad en ecuaciones científicas. de leucocitos x (velocidad Fórmula de cálculo del diámetro vascular, diagrama para la medición y el análisis microvascular. media de flujo sanguíneo x 60/1000) x x x .
    5. Calcular la fracción de flujo rodante [%]: flujo rodante/flujo de leucocitos total x 100.

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Resultados

IVM según el protocolo proporcionado proporcionará información única sobre la cascada de reclutamiento de leucocitos en el músculo esquelético. La sección de resultados se centrará en los resultados típicos obtenidos por IVM y resaltará los posibles problemas que puedan surgir.

La configuración experimental para la microscopía intravital se describe en la Figura 1. La preparación del músculo cremaestro y la eliminación del tejido conectivo es crucial para obtener ...

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Discusión

IVM como método se ha utilizado ampliamente para estudiar diferentes tipos de células en diferentes órganos y ha sido ampliamente descrito y discutido19. El objetivo principal de este estudio es proporcionar un enfoque eficiente para configurar y realizar IVM en el músculo cremaestro. La práctica del método producirá resultados fiables y reproducibles. Por lo tanto, la planificación y la estandarización son factores clave para dominar la técnica. Sobre todo, la técnica es muy dependiente de los pa...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado por el Ministerio Federal Alemán de Educación e Investigación (BMBF) 01GL1746E como parte del Consorcio PRIMAL. Los autores reconocen a Britta Heckmann y Silvia Pezer por su hábil asistencia técnica.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Material
Ketanest SPfizer Pharma GmbHPZN: 08509909anestesia. Genérico / IUPAC Nombre: ketamina
XilacinaCP-Pharma GmbHNº de artículo: 1205 anestesia. Nombre genérico / IUPAC: xilacina (como clorhidrato)
Solución salinaB. Braun Melsungen  PZN 02737756preparación quirúrgica. Genérico / IUPAC Nombre: cloruro de sodio
Aguja de jeringa Omnican FB. Braun Melsungen  REF 9161502preparación quirúrgica 
Sutura 6/0 USPResorbaREF 4217preparación quirúrgica 
Tubo de polietileno #10 BD GmbHProveedor n.º 427401preparación quirúrgica 
Tubo de polietileno #90 BD GmbHProveedor n.º 427421preparación quirúrgica 
Rhodamine 6GSigma-Aldrich Chemie GmbHNúmero CAS 989-38-8 Tinción de leucocitos. Genérico / Nombre IUPAC: etilo 2-[3-(etilamino)-6-etilimino-2,7-dimetilxanteno-9-il]benzoato
Equipo de configuración
Microscopio vertical Olimpo MicroscopíaBX51W1
de 40 veces objetivo ZeissAchroplan 40 × /0.80 Wmicroscopía
ImSpector softwareLavision Biotec GmbHver. 4.0.469software
ImageJNational Institute of Health, EE. UU. ver. 1.51j8software

Referencias

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  3. Woodfin, A., et al. ICAM-1-expressing neutrophils exhibit enhanced effector functions in murine models of endotoxemia. Blood. 127 (7), 898-907 (2016).
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  6. Frommhold, D., et al. RAGE and ICAM-1 differentially control leukocyte recruitment during acute inflammation in a stimulus-dependent manner. BMC Immunology. 12 (1), 56(2011).
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  20. Nussbaum, C., et al. Neutrophil and endothelial adhesive function during human fetal ontogeny. Journal of Leukocyte Biology. 93 (2), 175-184 (2013).

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