Separación del sobre celular para bacterias gramnegativas en fracciones de membrana interna y externa con ajustes técnicos para Acinetobacter baumannii

Resumen

Las bacterias gramnegativas producen dos membranas segregadas espacialmente. La membrana externa se divide a partir de la membrana interna por una periplasma y una capa de peptidogglicano. La capacidad de aislar las bicapas duales de estos microbios ha sido fundamental para entender su fisiología y patogénesis.

Resumen

Este método funciona dividiendo la envoltura de bacterias Gram-negativas en fracciones totales, internas y externas de membrana (OM) y concluye con ensayos para evaluar la pureza de las bicapas. El OM tiene una mayor densidad global en comparación con la membrana interna, en gran parte debido a la presencia de lipooligosacáridos (LOS) y lipopolisacáridos (LPS) dentro del prospecto exterior. Las moléculas LOS y LPS son glucólidos anfipááticos que tienen una estructura similar, que consiste en un disanolípido lípido-A y un sustituito de oligosacárido central. Sin embargo, sólo las moléculas lpS están decoradas con una tercera subunidad conocida como O-polisacárido, o oantígeno. El tipo y la cantidad de glucólidos presentes afectarán la densidad OM de un organismo. Por lo tanto, probamos si las membranas de bacterias con contenido variado de glucólidos podrían aislarse de manera similar utilizando nuestra técnica. Para los organismos productores de LPS, Salmonella enterica serovar Typhimurium y Escherichia coli, las membranas fueron fácilmente aisladas y la mitad del antígeno O-antígeno LPS no impactó la partición bicapa. Acinetobacter baumannii produce moléculas LOS, que tienen una masa similar a las moléculas LPS deficientes de O-antígeno; sin embargo, las membranas de estos microbios no podían separarse inicialmente. Razonamos que el OM de A. baumannii era menos denso que el de Enterobacteriaceae, por lo que el gradiente de sacarosa se ajustó y las membranas fueron aisladas. Por lo tanto, la técnica puede ser adaptada y modificada para su uso con otros organismos.

Introducción

Las bacterias gramnegativas producen dos membranas que están separadas por un espacio periférico y una pared celular de peptidoglycan¹. La membrana interna (IM) encierra el citosol y es una bicapa simétrica de fosfolípidos. Peptidoglycan protege contra la presión del turgencia y proporciona a la bacteria una forma celular, y está unido a la membrana externa (OM) por lipoproteínas^2,,3. El OM rodea la periferia y es predominantemente asimétrico. El prospecto interno se compone de fosfolípidos y el prospecto externo consiste en glucólidos conocidos como lipooligosacáridos (LOS) o lipopolis....

Protocolo

1. Reactivos generales y preparación de medios para la extracción de membranas

1. Medios de crecimiento bacteriano: Preparar y esterilizar 1 L de medios de caldo en un matraz de 2 L completamente limpiado y autoclave.
2. Tampón de resuspensión general (1 M Tris Buffer pH 7.5; 50 mL): Disolver 6,05 g de base Tris en 30 ml de H₂O. Ajuste el pH a 7,5 con 5 M HCl. Ajuste el volumen final a 50 mL con Ultrapure H₂O.
3. Stock maestro de solución de quelación de cationes divalentes (0,5 M EDTA pH 8; 100 mL): Añadir 18,6 g de tetraacetato de etileno disódico 2H₂O a 80 ml de H₂O. Agitar vigorosamente y ajustar el ....

Resultados

Esta técnica proporciona un medio eficaz para aislar los HIM y OMs para bacterias Gram-negativas. Se ilustra un esquema de todo el procedimiento (Figura 1). En general, la normalización de cultivos a una DO₆₀₀ de 0,6-0,8 en 1 L de medios, o la cosecha entre 6,0 y 8,0 x 10¹¹ células bacterianas garantizará que se recoja la cantidad adecuada de material de membrana para su posterior separación.

Al lijar las bacterias y ultracentricar el lisado,.......

Discusión

Este método continuará ayudando a los investigadores en la comprensión del papel de la envolvente celular en la fisiología bacteriana y la patogénesis. Siguiendo los pasos secuenciales de ultracentrifugación se puede obtener una fracción total, interna y OM purificada. Estas membranas se pueden analizar de forma aislada para probar hipótesis relacionadas con la localización y función de las proteínas de membrana, el transporte y el tráfico a través de la periferia, y la composición de las bicapas individuales bajo divers.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Botellas centrífugas de 1 L, PC/PPCO, supervelocidad, con tapón de sellado, Nalgene	VWR	525-0466
Botella de almacenamiento de medios Pyrex de 1 L con tapón de alta temperatura	VWR	10416-312
Matraz Erlenmeyer de 2.000 ml, boca estrecha	VWR	10545-844
4-20% mini geles de proteínas prefabricados PROTEAN, 12 pocillos	BIORAD	4561095
4x Muestra de Laemmli Tampón 10 mL	BIORAD	1610747
50 mL Tubos de centrífuga de polipropileno estériles	VWR	89049-174
Homogeneizador de tejidos de 7 mL Dounce con dos morteros de vidrio	VWR	71000-518
Conjunto de botella de policarbonato de 70 mL	Beckman Coulter Life Sciences	355622
Polvo	VWR	A10752
B10P de sobremesa Medidor de pH con sonda de pH	VWR	89231-664
Barnstead GenPure xCAD Plus UV/UF - TOC (versión de banco)	ThermoFisher Scientific	50136146
Benzonase Nucleasa	MilliporeSigma	70746-3
EDTA sal disódica dihidratada 99,0-101,0%, cristales, ultrapuro Biorreactivo Grado de biología molecular, J.T. Baker	VWR	4040-01
EmulsiFlex-C3	Avestin, Inc.
Rotor de ángulo fijo Fiberlite F13-14 x 50cy	ThermoFisher Scientific	75006526
Ácido clorhídrico 6.0 N	VWR	BDH7204
IBI Scientific Agitador de plataforma orbital	Fischer Scientific	15-453-211
LB Caldo Miller 214906
VWR lisozima, clara de huevo, grado ultrapuro	VWR	VWRV0063
Cloruro de magnesio hexahidratado	Sigma Aldrich	M2670
NADH	Sigma Aldrich	10107735001
Optima XPN-80 - IVD	Beckman Coulter Life Sciences	A99839
Pharmco Products  ALCOHOL PURO 200 PROOF GL 4/CS	Fischer Scientific NC1624582
solución de fenol, equilibrada con 10 mM de Tris HCl, pH 8,0, 1 mM de EDTA, bioreactivo, para biología molecular	Sigma - Millipore	P4557
Pierce Coomassie Plus (Bradford) Kit de ensayo	Thermofisher	23238
Pro-Q emerald 300 Kit de tinción en gel de lipopolisacáridos	Thermofisher	P20495
Proteacease-50, sin EDTA	G Biosciences	786-334
Proteinasa K, Grado de Biología Molecular New	England Biolabs	P8107S
Hidróxido de sodio ≥ 99,99%	Centrífuga VWR	AA45780-22
Sorval RC 6 Plus	ThermoFisher Scientific	36-101-0816
	Sacarosa MilliporeSigma	SX1075-3
SW 41 Ti Rotor de cubeta oscilante	Beckman Coulter Ciencias de la vida	331362
Tris(hidroximetil)aminometano (TRIS, Trometamol) ≥ 99,9 % (base seca), biorreactivo ultrapuro Grado de biología molecular, J.T. Baker	VWR	JT4109-6
Tipo 45 Ti Rotor de titanio de ángulo fijo	Beckman Coulter Life Sciences	339160
Tubo ultra claro, 14 x 89 mm	Beckman Coulter Life Sciences	344059
Vortex-Genie 2	VWR	102091-234