Artículo de método

Identificación de nuevos reguladores de la transpiración de plantas mediante el cribado térmico de imágenes a gran escala en Helianthus Annuus

DOI:

10.3791/60535

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30 de enero de 2020

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1Department of Biology and Program in Molecular Biology, Pomona College

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Proporcionamos un método para identificar moduladores de transpiración foliar mediante cribado a gran escala de una biblioteca compuesta.

Resumen

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La adaptación de las plantas a las tensiones bióticas y abióticas se rige por una variedad de factores, entre los que la regulación de la apertura estomatal en respuesta al déficit de agua o patógenos juega un papel crucial. La identificación de moléculas pequeñas que regulan el movimiento estomatal puede contribuir, por lo tanto, a comprender la base fisiológica por la que las plantas se adaptan a su entorno. Los enfoques de cribado a gran escala que se han utilizado para identificar los reguladores del movimiento estomatal tienen limitaciones potenciales: algunos dependen en gran medida de la vía de señalización hormonal del ácido abscés (ABA), excluyendo así los mecanismos independientes de la ABA, mientras que otros dependen de la observación de efectos fisiológicos indirectos a largo plazo como el crecimiento y desarrollo de las plantas. El método de cribado presentado aquí permite el tratamiento a gran escala de plantas con una biblioteca de productos químicos junto con una cuantificación directa de su transpiración por imágenes térmicas. Dado que la evaporación del agua a través de la transpiración da como resultado un enfriamiento de la superficie de la hoja, las imágenes térmicas proporcionan un enfoque no invasivo para investigar los cambios en la conductancia estomatal a lo largo del tiempo. En este protocolo, las plántulas Helianthus annuus se cultivan hidropónicamente y luego se tratan mediante la alimentación de las raíces, en la que la raíz primaria se corta y se sumerge en el producto químico que se está probando. Las imágenes térmicas seguidas de un análisis estadístico de los cambios de temperatura cotiledóres a lo largo del tiempo permiten la identificación de moléculas bioactivas que modulan la apertura estomatal. Nuestros experimentos de prueba de concepto demuestran que un producto químico se puede llevar desde la raíz cortada hasta el cotilería de la plántula de girasol en 10 minutos. Además, cuando las plantas son tratadas con ABA como un control positivo, se puede detectar un aumento en la temperatura de la superficie de la hoja en cuestión de minutos. Nuestro método permite así la identificación eficiente y rápida de nuevas moléculas que regulan la apertura estomatal.

Introducción

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La tolerancia al estrés en las plantas es un rasgo poligénico influenciado por una variedad de características y mecanismos moleculares, celulares, de desarrollo y fisiológicos1. Las plantas en un entorno fluctuante necesitan modular continuamente sus movimientos estomatales para equilibrar la demanda fotosintética de carbono manteniendo el agua suficiente y previniendo la invasión de patógenos2; sin embargo, los mecanismos por los cuales se toman estas "decisiones" de compensación se entienden mal3. La introducción de moléculas bioactivas en las plantas puede modular su fisiología y ayudar a sond....

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Protocolo

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1. Cultivo de las plantas

  1. Agregue una capa de vermiculita fina de 4 cm de espesor a las bandejas de planta estándar de 10 pulg. x 20 pulgadas (254 mm x 501 mm) sin orificios.
  2. Coloque los soportes de semillas (ver Tabla de Materiales)2 cm de distancia en las bandejas de la planta.
  3. Llene los soportes de semillas con vermiculita.
  4. Coloque una semilla de girasol con su extremo puntiagudo hacia abajo en cada soporte de semilla, empujando hacia abajo para que la mitad de la semilla permanezca expuesta.
    NOTA: Una semilla de girasol es asimétrica y el extremo puntiagudo desde donde emergerá el radio debe apuntar hacia....

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Resultados

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Un experimento con el tinte rojo Eritrosina B (0,8 kDa) demuestra la capacidad de los productos químicos para ser absorbidos visiblemente a través de una raíz cortada en los cotiledones de una plántula de girasol en 10 minutos(Figura 1).

Cuando las plantas son tratadas con ABA, se detecta un aumento en la temperatura de las hojas en los cotilediones de girasol en cuestión de minutos. Este aumento de.......

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Discusión

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El número de compuestos que se pueden probar en un día determinado depende principalmente de (i) el espacio ambientalmente controlado disponible para el cultivo de las plantas y para realizar la pantalla, así como (ii) el número de individuos que pueden participar en el paso 6 del protocolo. Recomendamos el uso de tres réplicas experimentales para consolidar la interpretación de los resultados después del tratamiento estadístico. En un día típico, uno a dos individuos pueden examinar 60 compuestos en triplicados sin difi.......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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El trabajo fue apoyado por Pomona College Start-up Funds y Hirsch Research Initiation Grants Fund (to FJ) así como el Programa de Biología Molecular de Pomona College a través del Programa Estelar de Asistente de Investigación de Verano (a KG).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1020 bandejas de cultivo de plástico sin orificiosBandejas estándar de 10 x 20
pulgadas Microtubos de 2,0 mL, sin tapaGenesee Scientific22-283NC
Ácido abscísico (ABA)Sigma-AldrichA1049
Bomba de aireActive AquaAAPA7.8L2 Salidas, 3W, 7,8 L/min
Piedras difusoras
Biblioteca de compuestos químicosMicroSource DiscoveryColección de productos naturales
Creative Versa-Tool (herramienta para quemar madera)Nasco9724549
Dimetilsulfóxido (DMSO), cultivo de células vegetales probadoSigma-AldrichD4540
Mancha solar enana Semillas de girasolOutsidepride.com
Eritrosina BSigma-Aldrich200964
Set de fertilizantes hidropónicos (FloraBloom, FloraGrow, FloraMicro)General HydroponicsGL51GH1421.31.11
Kimwipes Limpiadores para tareas delicadasKimberly-Clark Professional34155
LaptopDell
MES hydrateSigma-AldrichM2933
Tijeras de
Microsoft ExcelMicrosoft
Hidróxido de potasio (KOH)Sigma-AldrichP5958
ResearchIR SoftwareFLIR
R-Tech Tablero de espuma de poliestireno rígidoSoportes para semillas Insulfoam
AraponicsN/A
Super Tub (tina de plástico)MaccourtST3608Bañera de 36 x 24 x 8 pulgadas utilizada para hidroponía
T450sc LWIR (infrarrojo de onda larga) Cámara termográfica de manoFLIRFLIR-T62101Viene con el cable de carga requerido y el cable USB necesario para conectarse a la computadora portátil
Vermiculita
Filtro de aguaSunSunHW-304B Pro Filtro
de drenaje microdisección de recipiente

Referencias

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  1. Basu, S., Ramegowda, V., Kumar, A., Pereira, A. Plant adaptation to drought stress. F1000Research. 5, (2016).
  2. McLachlan, D. H., Kopischke, M., Robatzek, S. Gate control: guard cell regulation by microbial stress. The New Phytologist. 203 (4), 1049-1063 (2014).
  3. Leung, J., Bazihiz....

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