Aquí, presentamos tres métodos para evaluar la migración y la infiltración de neutrófilos tanto in vivo como in vitro. Estos métodos se pueden utilizar para descubrir terapias prometedoras dirigidas a la migración de neutrófilos.
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Artículo de método
Detectar la migración y la infiltración de neutrófilos en ratones
* These authors contributed equally
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Resumen
Resumen
Los neutrófilos son un miembro importante del sistema inmunitario innato y desempeñan un papel fundamental en la defensa del huésped contra patógenos y reacciones inflamatorias patológicas. Los neutrófilos pueden ser reclutados a sitios de inflamación a través de la guía de citoquinas y quimioquinas. La infiltración abrumadora de neutrófilos puede provocar daño indiscriminado a los tejidos, como en la artritis reumatoide (AR). Neutrófilos aislados del exudado peritoneal responden a un quimioatraer definido, N-formilo-Met-Leu-Phe (fMLP), in vitro en los ensayos de cámara Transwell o Zigmond. El experimento de la bolsa de aire se puede utilizar para evaluar la quimiotaxis de los neutrófilos hacia el lipopolisacárido (LPS) in vivo. El modelo de ratón de artritis inducida por adyuvantes (AA) se utiliza con frecuencia en la investigación de RA, y la tinción inmunohistoquímica de secciones articulares con anticuerpos antimieloperoxidasa (MPO) o antineutrófilos elastasa (NE) es un método bien establecido para medir infiltración de neutrófilos. Estos métodos se pueden utilizar para descubrir terapias prometedoras dirigidas a la migración de neutrófilos.
Introducción
Los neutrófilos son los glóbulos blancos más abundantes y representan entre el 50 y el 70% de toda la población de glóbulos blancos en humanos1. Los neutrófilos son uno de los principales respondedores durante la inflamación aguda. Los neutrófilos pueden ser reclutados en sitios de inflamación a través de la guía de citoquinas y quimioquinas liberadas por células residentes entejidos 2,3,4, que está mediada por las interacciones entre las moléculas de adhesión celular en la superficie de los neutrófilos y las células de endotelio vascular
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Protocolo
Todos los procedimientos experimentales fueron revisados y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Medicina China de Beijing.
NOTA: Se utilizaron ratones C57BL/6 (7-8 semanas de edad).
1. Aislamiento de neutrófilos
- Adquisición de células de exudado peritoneal
- Preparar una solución fresca de peptona proteosa al 10% en ddH2O. Calcular el volumen necesario según el número de ratones.
NOTA: Establezca el número de ratones como N, (2N+1) ml de solución debe disolverse y filtrarse de antemano. - Rocíe el espacio de trabajo con 70% de etanol. Uti....
- Preparar una solución fresca de peptona proteosa al 10% en ddH2O. Calcular el volumen necesario según el número de ratones.
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Resultados
Las células de exudado peritoneal se recogieron del líquido de lavado de ratones. Las células se resuspendieron en 1 ml de medio completo RPMI-1640, en capas en dos pasos (54,8%/70,2%) gradiente de densidad discontinua(Figura 1A) y centrifugado a 1.500 x g para 30 min. Los neutrófilos (95%, 1 x 107 neutrófilos/ratón) se recuperaron de la interfaz inferior(Figura 1B).
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Discusión
Los protocolos detallados de neutrófilos altamente purificados de sangre periférica7, médula ósea y tejidos18 han estado disponibles durante mucho tiempo. Aquí adoptamos un método de aislar a los neutrófilos del líquido peritoneal19 en el que los neutrófilos maduros permanecen inactivados para estudios antiinflamatorios y antioxidantes adicionales.
Usamos el experimento de la bolsa de aire para explorar la infiltración ind.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (números de subvención 81430099 y 31500704), Proyectos de Cooperación Internacional e Intercambio (número de subvención 2014DFA32950), y el programa de investigación de la Universidad de Medicina China de Beijing ( números de subvención BUCM-2019-JCRC006 y 2019-JYB-TD013).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,1% Solución Verde Rápida | Solarbio | 8348b | Transfiera 20 mg de grene rápido FCF de un vial a otro vaso de precipitados de 100 ml. Añada 20 ml de H2O en el vaso de precipitados y disuelva la mancha agitándola para obtener una solución verde rápida al 0,1 %, y fíltrela con un filtro Nalgene PES de 75 mm |
| Solución de tinción de safranina O al 0,1 % | Solarbio | 8348a | Transfiera 20 mg de tinción de safranina O en un vial a un vaso de precipitados de 100 ml. Añada 20 ml de H2O en el vaso de precipitados y disuelva la mancha agitándola para formar una solución de tinción de safranina O al 0,1 % y fíltrela con un filtro Nalgene PES de 75 mm |
| Solución de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) de 0,5 M, pH 8,0 | Sigma | 324506 | estéril |
| 100 | |||
| de PekínTubo centrífugo cónico de polipropileno de 15 mL | Falcon | 14-959-53A | |
| 23 G x 1 1/4" Aguja | BD | 305120 | |
| 26 G x 3/8" Aguja | BD | 305110 | |
| 3% albúmina sérica bovina (BSA) | Disuelva 0,3 g BSA en 10 mL PBS | ||
| 3% H2O2 | Mezcle 1 mL 30% H2O2 con metanol con 9 mL de metanol | ||
| 3,3'-diaminobenzidina (DAB) KIT | ZSGB-BIO | ZLI-9018 | |
| 30 G x 1/2" Aguja | BD | 305106 | |
| 30% H2O2 | Beijing Chemical Works | ||
| 5 mL Jeringa | BD | Z683574 | |
| 50 mL Tubo de centrífuga cónico de polipropileno | Falcon | 14-432-22 | |
| 50% Mezcla de etanol | 500 mL 100% etanol con 500 mL dH2O | ||
| 54.8% Percoll | Mix 2.74 mL SIP con 2.26 mL 1&veces; PBS, stand still | ||
| 70% Mezcla de etanol | 700 mL 100% etanol con 300 mL dH2O | ||
| 70.2% Percoll | Mix 3.51 mL SIP con 1.49 mL 1&veces; PBS, stand still | ||
| 80% Mezcla de etanol | 800 mL 100% etanol con 200 mL dH2O | ||
| 95% Mezcla de etanol | 950 mL 100% etanol con 50 mL dH2O | ||
| Alcohol ácido Solución de diferenciación ultrarrápida | Beyotime | C0165S | |
| ANTICUERPOS | |||
| Anticuerpo antimieloperoxidasa | Abcam | ab208670 | |
| Anticuerpo anti-elastasa de neutrófilos | Abcam | ab21595 | |
| Analizador de Hematología | Automático Sysmex | XS-800i | |
| Albúmina sérica bovina (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| Adyuvante de Freund completo, 10 mg/ml | Sigma | 1002036152 | |
| cubreobjetos | CITOGLAS | 10212432C | |
| Medidor de espesor de esfera | Mitutoyo | 7301 | |
| Microtubos Eppendorf, 1,5 mL | Sigma | Z606340 | |
| Suero Fetal Bovino (FBS) Premium | PAN | P30-1302 | |
| Sistema de anestesia gaseosa | ZS Dichuang | ZS-MV-IV | |
| Cabra Anti-Conejo IgG H& L (HRP) | PPLYGEN | C1309 | Este es el anticuerpo secundario utilizado en la tinción inmunohistoquímica. |
| Solución salina equilibrada de Hank (HBSS) | Industrias biológicas, Beth HaEmek, Israel | 02-016-1A | |
| Solución de tinción de hematoxilina | ZSGB-BIO | ZLI-9609 | |
| Lipopolisacárido (LPS) | Sigma | L3012 | |
| MEDIOS Y SUPLEMENTOS | |||
| Safranina modificada O-fast Green FCF Kit de tinción de cartílago | Solarbio | G1371 | |
| N-formil-Met-Leu-Phe (fMLP) | Sigma | 47729 | |
| Solución de estreptomicina de penicilina, 100 veces; | Invitrogen | 1514022 | |
| Percoll | GE Healthcare | 10245207 | Medio de gradiente de densidad |
| Mezcla tampón | 100 μ L Triton X-100 con 1 L dH2O para obtener 0.01% Triton X-100 | ||
| Solución salina tampón de fosfato (PBS), 1&veces; | Mezcle 90% ddH2O con 10% (v/v) 10&veces; PBS, | ||
| salina tampón de fosfato (PBS) esterilizada en autoclave, 10 veces; | Disuelva 16 g de NaCl, 0,4 g de KCl, 2,88 g de Na2HPO4· 2H2O, 0,48 g KH2PO4 (anhidro) en 200 mL ddH2O, ajuste de pH 7.4, esterilizado en autoclave | ||
| ARTÍCULOS Y EQUIPOS | |||
| POLVO | |||
| Proteose Peptona | Oxoid | 1865317 | |
| tampón | de recuperaciónMezcle 18 mL de tampón de recuperación A con 82 mL de tampón de recuperación B, agregue dH2O a 1000 mL, ajuste el pH a 6.0 | ||
| Tampón de recuperación A Stock para IHC | Disuelva 4.2 g de ácido cítrico (C6H5O7· H2O) en 200 mL dH2O | ||
| Stock de tampón de recuperación B para IHQ | Disolver 5,88 g de citrato trisódico dihidratado (C6H5Na3O7· 2H20) en 200 mL dH2O | ||
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medio | Sigma | R8758 | |
| RPMI-1640 Medio completo | El medio RPMI-1640 se complementa con un 10% de FBS y un 1% de penicilina/estreptomicina. | ||
| Shu Rui U40 Aguja de inyección de insulina estéril desechable 1 mL | BD | 328421 | |
| portaobjetos | CITOGLAS | 10127105P-G | |
| SOLUCIÓN | |||
| Stock Isotonic Percoll (SIP) | Mezcle 90% (v/v) de percoll con 10% (v/v) 10 veces; PBS, quieto durante 20 minutos | ||
| Tampón de lavado en bolsa de aire Ensayo | diluido 0,5 M EDTA a 10 mM con HBSS | ||
| Xileno | Beijing Chemical Works |
Referencias
- Klein, C. Genetic defects in severe congenital neutropenia: emerging insights into life and death of human neutrophil granulocytes. Annual Review of Immunology. 29, 399-413 (2011).
- Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of Neutrophil Chemotaxis. A....
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Reimpresiones y permisos
