Microarrays de biopartículas para el análisis quimiotáctico y molecular del enjambre de neutrófilos humanos in vitro

Resumen

Este protocolo genera microarrays de biopartículas que proporcionan enjambre de neutrófilos controlado espacialmente. Proporciona un fácil acceso a los mediadores que los neutrófilos liberan durante la migración y permite el análisis cuantitativo de imágenes.

Resumen

El enjambre de neutrófilos es un proceso cooperativo por el cual los neutrófilos cierran un sitio de infección y promueven la reorganización de los tejidos. El enjambre se ha estudiado clásicamente in vivo en modelos animales que muestran patrones característicos de migración celular. Sin embargo, los modelos in vivo tienen varias limitaciones, incluyendo mediadores intercelulares que son difíciles de acceder y analizar, así como la incapacidad de analizar directamente a los neutrófilos humanos. Debido a estas limitaciones, es necesario una plataforma in vitro que estudia el enjambre de neutrófilos humanos y proporcione un fácil acceso a las señales moleculares generadas durante el enjambre. Aquí, un proceso de microsello de varios pasos se utiliza para generar un microarray de biopartículas que estimula el enjambre imitando una infección in vivo. El microarray de biopartículas induce a los neutrófilos a enjambre de una manera controlada y estable. En el microarray, los neutrófilos aumentan en velocidad y forman enjambres estables alrededor de los cúmulos de biopartículas. Además, se analizó el sobrenadante generado por los neutrófilos y se descubrió que 16 proteínas se expresaron diferencialmente en el transcurso del enjambre. Esta plataforma de enjambre in vitro facilita el análisis directo de la migración de neutrófilos y la liberación de proteínas de una manera reproducible y controlada espacialmente.

Introducción

Los neutrófilos, el glóbulo blanco más abundante en el torrente sanguíneo¹, están ganando atención como posibles dianas diagnósticas y terapéuticas^2,3 porque pueden estar involucrados en una variedad de condiciones médicas incluyendo gota⁴, sepsis³, trauma^5,6, cáncer^1,7,8, y diversas enfermedades autoinmunes^5,9. El enjambre de neut....

Protocolo

Los autores reconocen a los voluntarios sanos que amablemente donaron su sangre. Los especímenes de sangre se obtuvieron después del consentimiento informado de los voluntarios de acuerdo con el protocolo de la Junta de Revisión Institucional (IRB) #2018H0268 revisado por el Comité de Ciencias Biomédicas de la Universidad Estatal de Ohio.

1. Microfabricación de microarray de biopartículas

1. Usando procedimientos de fotolitografía estándar, genere la oblea de silicio maestra.
   1. Genere una prueba del diseño deseado utilizando un software de diseño asistido por ordenador (CAD) y, a continuación, envíelo a un fabricante de fotomás....

Resultados

Cuando se añaden neutrófilos al microarray de biopartículas, los neutrófilos que contactan con los cúmulos de biopartículas se activan e inician la respuesta de enjambre. El microarray de biopartículas fue validado mediante microscopía fluorescente de lapso de tiempo para rastrear la migración de neutrófilos hacia los cúmulos de biopartículas (Video S1). La migración de núcleos de neutrófilos individuales se realiza un seguimiento a medida que migran hacia el cúmulo de biopartículas. Cuando los neutrófil.......

Discusión

Desarrollamos una plataforma de microsello para generar matrices uniformes de biopartículas para estimular el enjambre de neutrófilos in vitro. La naturaleza in vitro de nuestra plataforma nos permite eludir las complicaciones que surgen con los experimentos in vivo enjambre, a saber, la mala capacidad para analizar los mediadores liberados por los neutrófilos enjambres^5. Además, los modelos in vivo se realizan típicamente en roedores^11,12,

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
"The Big Easy" EasySep Magnet	STEMCELL Technologies	18001	Imán para usar con el kit de aislamiento de neutrófilos
Incubadora de células	Okolab	777057437 / 77057343	Incubadora de jaula Okolab para control de temperatura y CO2
Kit de aislamiento de neutrófilos humanos EasySep STEMCELL Technologies		17957	Kit para la selección inmunomagnética negativa de neutrófilos humanos
Eclipse Ti2	Nikon Instruments	MEA54010 / MEF55037	Microscopio de investigación invertido
Escherichia coli (cepa K-12) BioParticles Texas Red conjugado	Invitrogen	E2863	Biopartícula en polvo, se disuelve en agua antes de añadirlo a la matriz Zetag®
Harris Uni-Core Punzón de biopsia de 8 mm	Sigma Aldrich	Z708925	Para cortar sellos PDMS
HetaSep	STEMCELL Technologies	7906	Agente de agregación de eritrocitos para separar la capa leucocitaria de los glóbulos rojos en la sangre humana fresca
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570	Tinción fluorescente
de núcleo humano L1000 Array	Raybiotech Inc.	AAH-BLG-1000-4 Matriz de	alta densidad para detectar 1000 proteínas humanas
Albúmina sérica humana (HSA)	Sigma Aldrich	A5843	HSA de baja endotoxina, para preparar soluciones al 2 % en IMDM para neutrófilos aislados
Medio de Dulbeccos modificado de Iscove (IMDM)	Thermo Fisher Scientific	12440053	Para resuspender tubos de K2-EDTA de neutrófilos aislados
	Thermo Fisher Scientific	02-657-32	Tubos para la extracción de sangre
Fotomascarilla de cromo de baja reflexión	Fotomáscara de gama frontal	N/A	Dimensiones: 5" x 5" x 0,09" (largo x ancho x profundidad)
Escáner de microarrays	Perkin Elmer	ASCNGX00	Lector de fluorescencia de microdominios con patrones de proteínas
Microscopía Imagen Analsysis Software - Imaris	Bitplane	9.3.0	Software para el análisis
automático de seguimiento de célulasPaquete de software de investigación avanzada NiS Elements	de MQS31100	de Nikon Instruments	para la obtención automática de imágenes de células vivas y el cálculo del tamaño del enjambre
Isotiocianato de fluoresceína de poli-L-lisina (PLL-FITC)	Sigma Aldrich	P3069-10MG	30.000 - 70.000 MW PLL marcado con FITC, utilizado para etiquetar con fluorescencia la solución CP
SecureSeal Espaciador de imágenes de 8 pocillos	Grace Bio-Labs	654008	8 pocillos, 9 mm de diámetro, espaciador de imagen adhesivo
Silicon	Wafer University Wafer	590	Silicon 100 mm N/P (100) 0- 100 ohm-cm 500 μ m SSP test
Spin coater	Laurell	WS-650MZ-23NPPB	Se utiliza para hilar un 40-µ m capa de fotorresistencia sobre oblea de silicio
SU-8 2025	MicroChem	2025	Fotorreresistencia negativa para hacer oblea maestra de silicio
Revelador SU-8	MicroChem	Y020100	revelador fotorresistente. Retire el SU-8 2025 no reticulado de la oblea de silicio
Sylgard 184 (polidimetilsiloxano, PDMS)	Dow	1673921	kit de elastómero de silicona de 2 partes para la fabricación de microsellos y pozos de PDMS
Sistema de enmascaramiento de exposición UV	Kloé	UV-KUB 2	Se utiliza para reticular la fotorresistencia en una oblea de silicio a través de una máscara de cromo con luz ultravioleta
	Agua Thermo Fisher Scientific	A1287303	Agua de alta calidad para diluir biopartículas
Zetag 8185	BASF	8185	Polielectrolito catiónico (CP), polvo, copolímero de acrilamida y monómero catiónico cuaternizado, forma una "solución de entintado" para microestampado cuando se disuelve en agua
Zymosan A S. cerevisiae BioParticles Texas Red conjugado	Invitrogen	Z2843	Biopartícula en polvo, se disuelve en agua antes de agregarlo a la matriz Zetag

Software