El objetivo de este protocolo es detallar un método novedoso para la evaluación de la función cardíaca segmentaria en peces cebra embrionarios tanto en condiciones fisiológicas como patológicas.
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Artículo de método
El análisis de desplazamiento de la deformación mecánica miocárdica (DIAMOND) revela la heterogeneidad segmentaria de la función cardíaca en el pez cebra embrionario
En este artículo
Resumen
Resumen
Los peces cebra se utilizan cada vez más como organismo modelo para cardiomiopatías y regeneración. Los métodos actuales que evalúan la función cardíaca no detectan de forma fiable la mecánica segmentamental y no son fácilmente factibles en el pez cebra. Aquí presentamos un método semiautomatizado de código abierto para la evaluación cuantitativa de la función cardíaca segmental de cuatro dimensiones (4D): análisis de desplazamiento de la deformación mecánica miocárdica (DIAMOND). El pez cebra embrionario transgénico se imágenó in vivo utilizando un sistema de microscopía de fluorescencia de láminas de luz con sincronización de movimiento cardíaco 4D. Los corazones digitales 3D adquiridos fueron reconstruidos a finales de sístole y end-diastole, y el ventrículo se segmentó manualmente en conjuntos de datos binarios. Luego, el corazón se reorientó e isotrópicamente remuestreó a lo largo del verdadero eje corto, y el ventrículo se dividió uniformemente en ocho porciones (I-VIII) a lo largo del eje corto. Debido a los diferentes planos de remuestreo y matrices en la sistole final y la diastola final, se aplicó una matriz de transformación para el registro de imágenes para restaurar la relación espacial original entre las matrices de imágenes sistólicas y diastólicas remuestreadas. Después del registro de la imagen, el vector de desplazamiento de cada segmento de la sistole final a la diastole final se calculó sobre la base del desplazamiento de centroides de masa en tres dimensiones (3D). DIAMOND muestra que los segmentos miocárdicos basales adyacentes al canal auriculoventricular experimentan la deformación mecánica más alta y son los más susceptibles a lesiones cardíacas inducidas por doxorubicina. En general, DIAMOND proporciona información novedosa sobre la mecánica cardíaca segmentaria en embriones de pez cebra más allá de la fracción de eyección tradicional (EF) en condiciones fisiológicas y patológicas.
Introducción
La toxicidad cardíaca inducida por quimioterapia y la insuficiencia cardíaca subsiguiente son una de las principales razones de la interrupción de la quimioterapia1. Por lo tanto, la evaluación funcional cardíaca desempeña un papel crucial en la identificación de la toxicidad cardíaca y, lo que es más importante, en la predicción de una lesión cardíaca temprana después de la quimioterapia2. Sin embargo, los enfoques actuales para la evaluación funcional cardíaca encuentran limitaciones. Métodos como la fracción de eyección ventricular izquierda (LVEF) proporcionan sólo mecánica cardíaca global y a menudo retrasada después de la lesión3,4. Las imágenes Doppler de tejido proporcionan información segmental de deformación miocárdica, pero sufre de una variabilidad intraobservador e interobservador significativa, en parte debido a la dependencia del ángulo del haz de ultrasonido5. El seguimiento de manchas bidimensionales (2D) utiliza el modo B de ecocardiografía, que teóricamente elimina la dependencia del ángulo, pero su precisión está limitada por el movimiento fuera del plano6. Por lo tanto, falta un enfoque riguroso para cuantificar la función cardíaca segmental tanto en la investigación como en los entornos clínicos.
En este contexto, desarrollamos un método de cuantificación 4D para el análisis de la función cardiaca segmental que denominamos análisis de desplazamiento de deformación mecánica miocárdica (DIAMOND), para determinar los vectores de desplazamiento de los centroides de masa miocárdica en el espacio 3D. Aplicamos DIAMOND para la evaluación in vivo de la función cardiaca y la toxicidad cardíaca inducida por doxorubicina con pez cebra (Danio rerio) como modelo animal, elegido debido a su miocardio regenerador y genes de desarrollo altamente conservados7. Además, comparamos el desplazamiento segmentario DIAMOND con la determinación de la fracción de eyección global (EF) y la deformación unitaria 2D tras el tratamiento con doxorubicina. Al integrar el desplazamiento DIAMOND con la microscopía fluorescente de hoja de luz 4D (LSFM) adquirida renderización de corazones de peces cebra embrionarios, DIAMOND muestra que los segmentos miocárdicos basales adyacentes al canal auriculoventricular sufren la deformación mecánica más alta y son los más susceptibles a lesiones cardíacas doxorubicinaagudas 8.
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Protocolo
Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de UCLA, y los experimentos se realizaron de conformidad con los protocolos aprobados por la Oficina de Investigación Animal de UCLA.
1. Crianza Tg(cmlc2:mCherry) pez cebra y colección de embriones
- Siga los procedimientos de alojamiento, cría y recolección de embriones descritos en las prácticas de cría y cría previamente establecidas. Para obtener más información, véase Messerschmidt et al.9.
- Tratar los embriones recogidos con 0.003% 1-fenil-2-tiourea (PTU) en E3 medio 18 h postfertilización para mantener la transparencia de los embriones para la toma de imágenes LSFM.
2. Tratamiento con doxorubicina para inducir lesiones cardíacas
- A los 3 días de postfertilización (dpf), tratar los embriones con doxorubicina a una concentración de 10 m en el medio de agua de pescado E3. Después de un tratamiento de 24 horas a 4 dpf, reemplace el medio de doxorubicina por un medio E3 fresco.
ADVERTENCIA: La doxorubicina es un medicamento de quimioterapia. Se requiere un equipo de protección personal (EPP) adecuado y los residuos deben eliminarse en contenedores de residuos de riesgo biológico.
3. Modulación de la vía de la muesca
- Tratar embriones de pez cebra con el inhibidor de la vía de la muesca (2S)-N-[(3,5-difluorofenil)acetil]-L-aanyl-2-fenil]glycine 1,1-dimetiletilo éster (DAPT) a una concentración de 10 m en el medio de agua de pescado E3 de 3-6 dpf.
- Microinyectar los efectos de la muesca aguas abajo Notch dominio intracelular (NICD) y Neuregulin-1 (Nrg-1) mRNA a concentraciones de 10 pg/nL y 5 pg/nL, respectivamente, en los embriones de pez cebra de 1 célula8,10.
NOTA: La microinyección se realiza bajo un microscopio con el apoyo de una bomba de aire para controlar con precisión el volumen inyectado. La microinyección de ARNm en la célula se realiza cuando el óvulo fertilizado está en la primera etapa celular. Para obtener más información sobre la preparación y la secuencia de los ARNm, véase Chen et al.8. Para obtener más información sobre la microinyección y la preparación de agujas inyectables, véase Rosen et al.10.
4. Sincronización de imágenes Y post-imagen LSFM
- Para las técnicas de imagen LSFM y el algoritmo de sincronización post-imagen, ver detalles en las publicaciones anteriores9,11.
NOTA: Brevemente, nuestro sistema utiliza un láser de onda continua como fuente de iluminación para crear imágenes de todas las líneas transgénicas de peces cebra. El módulo de detección se compone de dos cámaras científicas complementarias de semiconductores de óxido metálico (sCMOS) y dos conjuntos de filtros para imágenes de doble canal. El módulo de detección se instala perpendicularmente en el plano de iluminación. Cada trama LSFM se adquiere dentro de un tiempo de exposición de 20 ms, mientras que la potencia de resolución en sección transversal es de 0,65 m y el tamaño del paso entre fotogramas consecutivos es de 2 m. Se utilizó un láser de 589 nm para excitar señales fluorescentes mCherry.
5. Reconstrucción del corazón sistólico y diastólico 3D
- Abra la carpeta creada por el algoritmo de sincronización posterior y, a continuación, abra la carpeta "Salida". Seleccione el plano central del corazón y cargue toda la carpeta en ImageJ. Encuentre la primera fase diastólica y sistólica y registre el número de fotograma.
- Abra la carpeta "Salida/Por estado" y busque las carpetas que tienen los mismos números que los números de fotograma que acaba de grabar. Convierta las imágenes de la carpeta en archivos TIFF 3D (formato de archivo de imagen etiquetado) y asímóceles "diastole.tif" y "systole.tif".
6. Segmentación del ventrículo
- Abra el software de análisis de imágenes (consulte Tabla de materiales). Haga clic en Archivo (File) ? Abra los datosy cargue "diastole.tif" y "systole.tif". Introduzca el tamaño del voxel de acuerdo con la configuración de imagen.
NOTA: Para el sistema LSFM utilizado, el tamaño típico de los vóxeles es de 0,65 ám x 0,65 ám x 2 m. - Haga clic en el panel "SEGMENTATION"y segmente manualmente la parte del ventrículo del corazón. La herramienta incorporada"Umbral"que puede seleccionar todas las regiones por encima de una cierta intensidad puede facilitar este proceso. El ventrículo es la cámara más gruesa con una fluorescencia más fuerte.
NOTA: Asegúrese de extraer el canal auriculoventricular y el tracto de salida en el ventrículo segmentado, ya que esto afecta el análisis de desplazamiento. - Una vez finalizada la segmentación, haga clic en el panel"Proyecto". Haga clic con el botón derecho en ladiastola .. Labels.tif" y "systole. Labels.tif" pestañas en la consola y haga clic en "Exportar datos como" para guardar los datos como archivos TIFF 3D.
7. Creación de paralelepípedos rectangulares para el registro de imágenes
- Ejecute "prepImage_1.m" en el entorno de programación (consulte Tabla de materiales). Abra "prepImage_1.m", "ImPath" en la línea 5 para que la carpeta contenga los archivos TIFF originales y segmentados, y cambie "sector" en la línea 4 al número de sectores de los archivos 3D tif.
- Después de ejecutar el código, generará cinco nuevos archivos TIFF 3D ("test.tif", "diastole_200.tif", "systole_200.tif", "diaLabel.tif" y "sysLabel200.tif") así como dos carpetas nuevas ("resample_dia" y "resample_sys").
8. Remuestrear los corazones 3D sistólicos y diastólicos a lo largo del plano de eje corto
- Importe los cinco archivos TIFF 3D al software de análisis de imágenes (consulte Tabla de materiales).
NOTA: El tamaño del voxel no cambia. - Vaya al panel MULTIPLANAR. Elija "diastole_200.tif" como datos principales. Alinee el eje X (la línea verde en el plano XY) con el eje largo vertical del ventrículo y alinee el eje Z (la línea roja en el plano YZ) con el eje largo horizontal del ventrículo.
NOTA: El eje largo vertical se determina mediante la búsqueda del eje más largo que conecta el ápice y el tracto de salida en el plano XY, y el eje largo horizontal se determina mediante la búsqueda del eje más largo que conecta el ápice y el tracto de salida en el plano YZ. Gire el eje colocando el cursor al final del eje. - Elija tres puntos aleatorios del plano YZ oblicuo (el plano de eje corto) en sentido contrario a las agujas del reloj y registre sus coordenadas de posición 3D.
NOTA: Asegúrese de que los puntos se eligen en sentido contrario a las agujas del reloj. - Repita los pasos 8.2 y 8.3 para "systole_200.tif".
- Haga clic en el panel "PROYECTO". Cree un objeto "Slice" para "diastole_200.tif" haciendo clic con el botón derecho en "diastole_200.tif" y buscando el objeto"Slice". Haga clic izquierdo en el objeto Slice que acaba de crear, y en el panel Propiedades . Opciones, marque"Establecer plano"y elija tres puntos en "Definiciónde plano ". Introduzca las coordenadas de los tres puntos del paso 7.3.
- Repita el paso 8.5 para "systole_200.tif".
NOTA: El objeto de sector creado debe tener el nombre "Slice 2". - Haga clic con el botón derecho en "diastole_200.tif" y busque"Remuestretransform Transformed Image"y cree el objeto. En el panel Propiedades, elija "Sector" como la "Referencia" y haga clic en Aplicar. Esto debería generar un objeto denominado "diastole_200.transformed".
- Haga clic con el botón derecho en "diastole_200.transformed" y busque "Resample" y cree el objeto. Elija " Tamaño deVoxel" como el "Modo" y cambie " Tamaño deVoxel" para ser x - 1, y - 1, y z - 1 en el panel Propiedades.
- Haga clic en "Aplicar". Esto debería generar un objeto denominado "diastole_200.resampled". Haga clic con el botón derecho en "diastole_200.resampled" y guárdelo como un archivo TIFF 3D.
- Repita el mismo paso para "diaLabel.tif" y "test.tif". Guarde "diaLabel.resampled" y "test.resampled" como archivos TIFF 3D. Repita el mismo paso para "systole_200.tif", "sysLabel.tif" y "test.tif" usando "Slice 2" como referencia y guarde "systole_200.resampled", "sysLable.resampled" y "test2.resampled" como archivos TIFF 3D.
NOTA: Asegúrese de que hay un total de seis archivos TIFF guardados en este paso.
9. División del corazón remuestreado
- Importe los seis archivos remuestreados del paso 8 a ImageJ. Seleccione una rebanada de "systole_200.remuestreado" en la que se visualice claramente el canal auriculoventricular. Registre el número del sector.
- Utilice la"Imagen" Transformar ? Gire" función de ImageJ para que el canal auriculoventricular sea vertical. Aplique la misma rotación a todos los archivos. Cierre todas las ventanas y guarde todos los cambios.
- Mueva "diastole_200.resampled", "diaLabel.resampled" y "test.resampled" a la carpeta "resample_dia" y mueva "systole_200.resampled", "sysLable.resampled" y "test2.resampled" a la carpeta "resample_sys".
- Abra "divider_2_8_pieces.m". Cambie "ImPath" en la línea 5 y "ImPath" en la línea 395 al directorio de imágenes. Cambie la variable"Medio"en la línea 22 y la línea 411 a los números de la rebanada donde el canal auriculoventricular se visualiza claramente en "systole_200.remuestreado" y "diastole_200.remuestreado".
- Ejecute el código, y en las ventanas le orantes haga clic una vez en el centro del ventrículo y haga clic una vez en el centro del canal auriculoventricular. Esto debe hacerse dos veces para las imágenes de sístole y diastole.
10. Registro de matrices de imágenes sistólicas y diastólicas
- Abra "register_3.m" y cambie "ImPath"en la línea 4 a la ruta de la carpeta de imágenes. Puede tardar entre 5 y 20 minutos en ejecutar este código en función de la potencia de cálculo del sistema.
NOTA: Los paralepípedos rectangulares creados artificialmente en el paso 7 se utilizan para el registro rígido 3D que preserva la distancia entre dos puntos y ángulos suscritos por tres puntos. Cuando el paralelepípedo rectangular end-diastole (rojo) se registra en el paralelepípedo rectangular de la sistole final (verde), la ubicación 3D discreta subsiguiente permite la derivación de una matriz única de transformación rígida que consiste en la rotación y la traslación de la matriz de diástole final a la matriz de sistolia final(Figura 1H). Realizamos el registro y la minimización de energía regularizada para eliminar el ruido de la matriz después de la transformación utilizando una caja de herramientas de procesamiento de imágenes (ver Tabla de Materiales). Para una descripción matemática detallada, véase Chen et al.8.
11. Salida de los vectores de desplazamiento
- Abra "displacement_4.m" y cambie "ImPath" en la línea 4 a la ruta de la carpeta de imágenes.
- Ejecute "displacement_4.m", que genera un archivo "vector8.txt" en la carpeta "vectores". Una vez que el archivo "vector8.txt" está abierto, habrá una matriz de 8 x 4. Cada fila de la matriz tiene cuatro números, que son las magnitudes del componente X, el componente Y, el componente Z y la magnitud SUM del vector de desplazamiento de un segmento específico del ventrículo.
NOTA: El vector de desplazamiento se obtiene calculando el desplazamiento del centroide de masa de cada segmento en el espacio 3D. Calculamos
las coordenadas centroide de masa 3D (PS y PD) (donde k indica la coordenada X, Y o Z, respectivamente) de cada segmento (I-VI) en el dataset de segmentación desde la sístole a la diástole(Figura 1J). Definimos el centroide de masa en el espacio 3D de la siguiente manera:
donde Cx x X, Cy á Y, y Cz a Z, Mi , la masa de cada segmento (I - i - VI), m - el número de vóxeles de cada segmento, y - la función de densidad como la región segmentada es 1 mientras que el resto es 0. La norma L2 de los vectores de subdesplazamiento a lo largo de los ejes X, Y y Z y el vector de desplazamiento de suma se calculan durante el ciclo cardíaco. Hay un total de ocho filas en la matriz. La primera fila y la octava fila contienen el canal auriculoventricular y por lo tanto se ignoran en nuestro análisis. Los segmentos I a VI se representan mediante la segunda fila de la séptima fila.
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Resultados
El proceso mediante el cual se desarrolló EL DIAMANTE para evaluar la función cardíaca segmental 3D se presenta en la Figura 1. Tras la adquisición y reconstrucción de imágenes LSFM en 3D del corazón de pez cebra embrionario(Figura 1A),el plano de eje corto verdadero se determinó como el plano perpendicular a los ejes largos verticales y horizontales, ambos determinados en un visor multiplano(Figura 1B).
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Discusión
Una estrategia rigurosa para la cuantificación de la función miocárdica segmentada es fundamental para evaluar la mecánica cardíaca más allá de la EF tradicional, conocida por ser un indicador insensible y retardado de la lesión miocárdica1,4,12. Por lo tanto, ha habido un creciente interés en los marcadores de los primeros cambios miocárdcos, y un creciente cuerpo de literatura apoya los parámetros de deformación miocárdica com...
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Divulgaciones
Los autores han declarado que no existe ningún conflicto de intereses.
Agradecimientos
El presente trabajo fue financiado por las subvenciones de la Asociación Americana del Corazón 16SDG30910007 y 18CDA34110338, y por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones HL083015, HL111437, HL118650 y HL129727.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Amira6 | FEI | Software de análisis de imágenes | |
| DAPT | Millipore Sigma | D5942-5MG | |
| Clorhidrato de doxorrubicina | Millipore Sigma | D1515-10MG | |
| 3-aminobenzoato de etilo metanosulfonato | Millipore Sigma | E10521-10G | Tricaína |
| MATLAB | MathWorks | Entorno de programación | |
| Caja de herramientas de procesamiento de imágenes de MATLAB | Caja de herramientas de procesamiento de imágenes | MathWorks |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
