Este protocolo describe el aislamiento de células epiteliales de diferentes regiones anatómicas de la membrana amniótica humana para determinar su heterogeneidad y propiedades funcionales para su posible aplicación en modelos clínicos y fisiopatológicos.
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Artículo de método
Cultivo In Vitro de Células Epiteliales de Diferentes Regiones Anatómicas de la Membrana Amniótica Humana
En este artículo
Resumen
Resumen
Se han reportado varios protocolos en la literatura para el aislamiento y el cultivo de células epiteliales amnióticas humanas (HAEC). Sin embargo, estos suponen que el epitelio amniótico es una capa homogénea. El amnion humano se puede dividir en tres regiones anatómicas: reflejada, placentaria y umbilical. Cada región tiene diferentes funciones fisiológicas, como en condiciones patológicas. Aquí, describimos un protocolo para diseccionar el tejido amnión humano en tres secciones y mantenerlo in vitro. En el cultivo, las células derivadas del amnion reflejado mostraron una morfología cuboidal, mientras que las células de las regiones placentaria y umbilical eran escamosas. No obstante, todas las células obtenidas tienen un fenotipo epitelial, demostrado por la inmunodetección de la E-cadherina. Por lo tanto, debido a que las regiones placentarias y reflejadas in situ difieren en los componentes celulares y las funciones moleculares, puede ser necesario que los estudios in vitro consideren estas diferencias, ya que podrían tener implicaciones fisiológicas para el uso de HAEC en investigación biomédica y la aplicación prometedora de estas células en la medicina regenerativa.
Introducción
Las células del epitelio amniótico humano (HAEC) se originan durante las primeras etapas del desarrollo embrionario, alrededor de ocho días después de la fertilización. Surgen de una población de células epiteliales escamosas del epiblasto que derivan de la capa más interna de la membrana amniótica1. Por lo tanto, HAEC se consideran restos de células pluripotentes del epiblasto que tienen el potencial de diferenciarse en las tres capas germinales del embrión2. En la última década, diversos grupos de investigación han desarrollado métodos para aislar estas células de la membrana amniótica a término de gestación para caracterizar sus propiedades presuntas relacionadas con la pluripotencia en un modelo de cultivo in vitro3,4.
En consecuencia, se ha encontrado que HAEC presenta rasgos característicos de las células madre pluripotentes humanas (HPSC), como los antígenos superficiales SSEA-3, SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81; el núcleo de los factores de transcripción pluripotencia OCT4, SOX2 y NANOG; y el marcador de proliferación KI67, lo que sugiere que se autornuevan5,6,7. Además, estas células han sido desafiadas utilizando protocolos de diferenciación para obtener células positivas para marcadores específicos de linaje de las tres capas germinales (ectodermo, mesodermo y endoderm)4,5,8, así como en modelos animales de enfermedades humanas. Por último, HAEC expresa E-cadherin, que demuestran que conservan una naturaleza epitelial muy similar a la HPSC5,9.
Aparte de su origen embrionario, HAEC tiene otras propiedades intrínsecas que las hacen adecuadas para diferentes aplicaciones clínicas, como la secreción de moléculas antiinflamatorias y antibacterianas10,11, factores de crecimiento y citoquinaliberación 12,sin formación de teratomas cuando se trasplantan en ratones inmunodeficientes en contraste con HPSC2,y tolerancia inmunológica porque expresan HLA-G, lo que disminuye el riesgo de rechazo después de trasplante13.
Sin embargo, informes anteriores han supuesto que el amnion humano es una membrana homogénea, sin tener en cuenta que puede dividirse anatómica y fisiológicamente en tres regiones: placenta (el amnion que cubre la decidua basalis),umbilical (la parte que envuelve el cordón umbilical), y reflejado (el resto de la membrana no unida a la placenta)14. Se ha demostrado que las regiones placentarias y reflejadas del amnión muestran diferencias en morfología, actividad mitocondrial, detección de especies reactivas de oxígeno15,expresión de miRNA16,y activación de las vías de señalización17. Estos resultados sugieren que el amnion humano está integrado por una población heterogénea con una funcionalidad diferente que debe considerarse para estudios posteriores realizados en modelos in situ o in vitro. Mientras que otros laboratorios han diseñado protocolos para el aislamiento de HAEC de toda la membrana, nuestro laboratorio ha establecido un protocolo para aislar, cultivar y caracterizar células de diferentes regiones anatómicas.
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Protocolo
Este protocolo fue aprobado por el comité ético del Instituto Nacional de Perinatología en la Ciudad de México (Número de Registro 212250-21041). Todos los procedimientos realizados en estos estudios se ajustaron a las normas éticas del Instituto Nacional de Perinatología, la Declaración de Helsinki y las directrices establecidas en la Norma Oficial Mexicana del Ministerio de Salud.
1. Preparación
- Prepare una solución de 1x PBS con EDTA. Para ello, añada 500 ml de stock EDTA de 0,5 M en 500 ml de 1PBS para una concentración final de 0,5 mM EDTA.
- Prepare el medio de cultivo para HAEC. Tomar 450 ml de alto nivel de glucosa-DMEM, complementarlo con 5 ml de piruvato sódico (100 mM), 50 ml de suero bovino fetal inactivo por calor calificado para células madre, 5 ml de aminoácidos no esenciales (100x), 5 ml de antibiótico-antimicótico (100x), 5 ml de L-glutamina (200 mM), y 500 l de mercaptoetanol (1.000x).
- Esterilizar los recipientes para el transporte y procesamiento del tejido: un recipiente de acero inoxidable con tapa para transportar toda la placenta desde el quirófano hasta el laboratorio, una bandeja (20 cm x 30 cm x 8 cm) para lavar y extraer la sangre de toda la placenta antes de la disección de la membrana amniótica, y una tabla de cortar de plástico para separar la membrana amniótica en las tres regiones.
- Esterilice los instrumentos quirúrgicos (escalpelos, tijeras, fórceps y abrazaderas), vasos de 500 ml, gasas de algodón y solución salina.
2. Obtención de tejido placentario
NOTA: Las membranas amnióticas se obtuvieron de mujeres en gestación a término (37-40 semanas), bajo indicación de parto por cesárea, sin evidencia de trabajo activo, y sin características microbiológicas de la infección. Los procedimientos completos de aislamiento y cultivo se llevaron a cabo dentro de un gabinete de bioseguridad en condiciones estériles.
- En el quirófano, sujete el cordón umbilical para evitar el flujo sanguíneo al resto del tejido. Recoger toda la placenta con el cordón umbilical sujeto en el recipiente estéril.
- Añadir 500 ml de solución salina al recipiente para hidratar la placenta.
- Cierre el recipiente y transporte el tejido al laboratorio a temperatura ambiente.
- Coloque el recipiente con la placenta dentro del gabinete de bioseguridad.
NOTA: En caso de que la disección no se lleve a cabo dentro de los 15 minutos posteriores a la recolección de la placenta, guarde el recipiente con la placenta sobre hielo hasta su procesamiento. Evitar más de 1 h de tiempo transcurrido entre la obtención de la placenta y el inicio de la disección.
3. Separación mecánica por región de la membrana amniótica
NOTA: El procedimiento debe llevarse a cabo dentro de un armario de bioseguridad en condiciones estériles y a temperatura ambiente.
- Retire toda la placenta del recipiente y colóquela en la bandeja con el cordón umbilical hacia arriba.
- Con una gasa de algodón estéril, limpie los coágulos de sangre de la superficie del coro-amnion que cubre la placenta.
- Identificar las tres regiones de la membrana: el amnión umbilical que envuelve el cordón umbilical, el amnion placentario que cubre la decidua basalis, y la región reflejada, que es el resto de amnion que no está unido a la placenta(Figura 1).
- Diseccionar la región amnion umbilical(Figura 2A).
- Usando fórceps dissección, sostenga la porción de membrana amnion que cubre la unión de la placenta y el cordón umbilical.
- Con un bisturí, disecciona la región que rodea el cordón mientras se estira para separarlo del coro.
- Deposite el tejido separado en un vaso de precipitados etiquetado con 100 ml de solución salina.
- Diseccionar la región del amnión placentario(Figura 2B).
- Con una gasa de algodón estéril, retire los coágulos de sangre de la superficie del coro-amnion que cubre la placenta.
- Sostenga la membrana en la frontera entre la placenta y la región reflejada con fórceps disecantes.
- Corte a lo largo de la circunferencia de la placenta con el bisturí.
- Separar el amnion placentario del coro, teniendo cuidado de no cortar ningún vaso de la placenta.
- Coloque el tejido separado en otro vaso etiquetado con 300 ml de solución salina.
- Separe el resto de la membrana amniótica que no está unida a la placenta (es decir, la porción reflejada) del coro(Figura 2C).
- Recoja la región reflejada en otro vaso etiquetado con 300 ml de solución salina.
NOTA: Agregue la solución salina continuamente durante la disección para evitar que el tejido se seque.
- Recoja la región reflejada en otro vaso etiquetado con 300 ml de solución salina.
4. Lavar las membranas
NOTA: El procedimiento debe llevarse a cabo dentro de un armario de bioseguridad en condiciones estériles a temperatura ambiente.
- Deseche la solución salina de cada región de membrana por separado.
- Añadir 100 ml de solución salina fresca a la región umbilical.
- Añadir 300 ml de solución salina fresca a las regiones placentarias y reflejadas respectivamente.
- Revuelva las membranas con la ayuda de disección de fórceps para eliminar los residuos de sangre.
- Deseche la solución salina.
- Repita los lavados y agitación al menos 3 veces hasta que las membranas sean translúcidas.
- Coloque y extienda las membranas en el tablero para limpiar con gasa estéril los coágulos de sangre que no se eliminaron con los lavados.
NOTA: Es muy importante eliminar tantos eritrocitos como sea posible, ya que su presencia afecta a la función de trippsina y la viabilidad de los cultivos celulares posteriores.
5. Digestión enzimática de las membranas de diferentes regiones
NOTA: El procedimiento debe llevarse a cabo dentro de un armario de bioseguridad en condiciones estériles.
- Cortar las regiones reflejadas y placentarias en dos o tres fragmentos.
- No corte la región umbilical.
- Coloque los fragmentos de cada región en tubos centrífugos. Añadir 20 ml de 0,5% de trippsina/EDTA a las regiones reflejadas y placentarias y 5 ml de 0,5% de trippsina/EDTA a la región umbilical, respectivamente.
NOTA: Es importante cortar las regiones reflejadas y placentarias en trozos más pequeños porque necesitan estar completamente sumergidas en la solución de tripina. - Agitar los tubos de centrífuga ligeramente durante 30 s. Deseche la trippsina.
- Añadir 30 ml de nueva trippsina/EDTA al 0,5% de trippsina/EDTA a las regiones reflejadas y placentarias y 15 ml de trippsina/EDTA nueva al 0,5% a la región umbilical, respectivamente.
- Coloque los tubos en un rotador dentro de la incubadora.
- Incubar con rotación (20 rpm) durante 40 min a 37oC.
NOTA: Si un rotador de tubo no está disponible, agite los tubos ligeramente manualmente cada 10 minutos. - Transfiera las soluciones de tripina/célula de cada región a nuevos tubos centrífugos.
- Añadir 2 veces el volumen de medios HAEC precalentados a 37 oC por tubo para inactivar la enzima.
- Almacene la primera digestión en hielo.
- Repita los pasos 5.6-5.8 durante un segundo período de digestión.
- Para cada región, sostenga un extremo de la porción de amnion usando fórceps disecantes, y con otro par aprieta a lo largo del tejido para eliminar filas de células epiteliales que no se despegaron completamente durante períodos de incubación anteriores.
- Recoger la segunda digestión en otro conjunto de tubos centrífugos e inactivar con 2 veces el volumen de medios HAEC.
- Deseche las membranas digeridas en un recipiente con riesgo biológico.
6. Aislamiento del HAEC
NOTA: El procedimiento debe llevarse a cabo dentro de un armario de bioseguridad en condiciones estériles.
- Centrifugar todos los tubos a 200 x g durante 10 min a 4oC.
- Deseche el sobrenadante y agregue 10 ml de medios HAEC precalentados (a 37 oC) por tubo y pipetee suavemente para desagregar cada pellet.
- Combinar las suspensiones celulares de las dos digestiones en un tubo individual para cada región de membrana.
- Filtrar las suspensiones celulares usando coladores celulares de 100 m para eliminar los desechos de matriz extracelular y obtener células individuales.
- Preparar tres alícuotas con 90 ml de trippan azul en un tubo de microcentrífuga.
- Añadir 10 l de suspensión celular por región de membrana en los tubos de microcentrífuga y mezclar.
- Cuente las células con un hemocitómetro bajo un microscopio de campo de luz.
7. Cultura de HAEC
- Semilla del HAEC de las tres regiones por separado a una densidad de 3 x 104 células/cm2 con medios HAEC precalentados, complementado con 10 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico humano (EGF).
- Sembrar las células en placas de 100 mm para mantenerlas in vitro o en 24 placas de pozo para análisis inmunoquímico.
- Incubar los platos a 37oC en condiciones normativas (5% CO2) en una incubadora humidificada.
- Añadir EGF diariamente y cambiar el medio cada tercer día.
NOTA: Las células se volverán confluentes después de 4 a 6 días. - Utilice las células para la inmunohistoquímica convencional, análisis de clasificación celular, criopreservación, ARN y extracción de proteínas, o para continuar el paso.
8. Paso de HAEC
- Retire el medio HAEC y lave 2 veces con la solución PBS/EDTA 0.01M.
- Incubar con una solución PBS/EDTA 0.01M durante 15 min a 37oC.
- Retire el PBS/EDTA y agregue 1,5 ml de trippsina/EDTA al 0,5%.
- Incubar durante 5 x 8 min a 37oC.
- Inactivar la enzima con dos volúmenes de medios HAEC.
- Recoger la solución mixta y centrifugar durante 5 min a 200 x g.
- Cuente las celdas y continúe con los siguientes pasajes o utilice las celdas para su posterior análisis.
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Resultados
Los HAEC se aislaron de cada una de las tres regiones anatómicas de la membrana amniótica y se cultivaron individualmente in vitro. Después de 48 h de cultivo, las células con un fenotipo epitelial se adhirieron a la superficie de la placa, aunque el medio también contenía desechos celulares y células flotantes, que se eliminaron una vez que se cambió el medio(Figura 3).
Durante el procesamiento del cultivo primario (pasaje cero, P0), podrían surgir algunas compli...
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Discusión
Implementamos un nuevo protocolo para aislar HAEC de las membranas de términos. Se diferencia de los informes anteriores en que cada membrana se dividió en sus tres regiones anatómicas antes del aislamiento para analizar las células de cada una.
Uno de los pasos más críticos en el protocolo es el lavado de la membrana para eliminar todos los coágulos sanguíneos, ya que pueden interferir con la actividad de la trippsina al separar las células epiteliales. No llevar a cabo este paso correctament...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Nuestra investigación fue apoyada por subvenciones del Instituto Nacional de Perinatología de México (21041 y 21081) y CONACYT (A1-S-8450 y 252756). Agradecemos a Jessica González Norris y Lidia Yuriria Paredes Vivas por el apoyo técnico.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| cultivo | |||
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21985023 | 55 mM |
| de Animales Recombinante Humano EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Antibiótico-Antimicótico | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 12430054 | Suplementado con alto contenido de glucosa y EDTA HEPES |
| Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9260G | 0,5 M | |
| Célula madre embrionaria FBS, calificado | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10439024 | |
| Aminoácidos no esenciales | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11140050 | 100X |
| Paraformaldehído | cualquier marca | ||
| Solución salina tamponada con fosfato | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| Solución salina (cloruro de sodio 0,9%) | cualquier marca | ||
| Piruvato de sodio | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11360070 100 mM | |
| Trypsin/EDTA 0,05% | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 25300054 | |
| Material desechable | |||
| 100 y micro; m Filtro de celdas | Corning/Falcon | 352360 | |
| Plato de cultivo tratado con TC de 100 mm | Corning | 430167 | |
| 24 pocillos Placas de pocillos múltiples transparentes tratadas con TC | Corning/Costar | 3526 | |
| Placas de pocillos múltiples transparentes con tratamiento TC de 6 pocillos | Corning/Costar | 3516 | |
| Tubo de centrífuga estéril no pirogénico | de cualquier marca | con fondo | |
| Puntas estériles no pirogénicas de 1.000 y micro; l, 200 y micro; l y 10 µl. | |||
| Gasas de algodón estériles | |||
| Pipetas serológicas estériles de 5, 10 y 25 mL de | cualquier marca | ||
| Guantes quirúrgicos estériles | de cualquier marca | ||
| Equipo | |||
| seguridad biológica | |||
| Centrífuga | |||
| Micropipetas | |||
| Llenador/dispensador | |||
| Vasos de precipitados estériles de 500 mL | |||
| cortar de plástico estéril | |||
| Bisturíes, tijeras, pinzas, pinzas estériles Recipiente | |||
| estéril de acero inoxidable | |||
| Bandeja | |||
| Tubo Rotador | MaCSmix | ||
| Anticuerpos y Kits | Anticuerpo ID | ||
| Anti-E-cadherina | BD Biosciences | 610181 | RRID:AB_3975 |
| Anti-KI67 | Santa Cruz | 23900 | RRID:AB_627859) |
| Anti-NANOG | Peprotech | 500-P236 | RRID:AB_1268274 |
| Anti-OCT4 | Abcam | ab19857 | RRID:AB_44517 |
| Anti-SOX2 | Millipore | AB5603 | RRID:AB_2286686 |
| Anti-SSEA-4 | Señalización Celular | 4755 | RRID:AB_1264259 |
| Anti-TRA-1-60 | Señalización Celular | 4746 | RRID:AB_2119059 |
| Cabra Anti-Ratón Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| Cabra Anti-Conejo Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Kit de ensayo de túnel | Abcam | 66110 |
Referencias
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