Este protocolo describe el aislamiento de células epiteliales de diferentes regiones anatómicas de la membrana amniótica humana para determinar su heterogeneidad y propiedades funcionales para su posible aplicación en modelos clínicos y fisiopatológicos.
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Artículo de método
Cultivo In Vitro de Células Epiteliales de Diferentes Regiones Anatómicas de la Membrana Amniótica Humana
En este artículo
Resumen
Resumen
Se han reportado varios protocolos en la literatura para el aislamiento y el cultivo de células epiteliales amnióticas humanas (HAEC). Sin embargo, estos suponen que el epitelio amniótico es una capa homogénea. El amnion humano se puede dividir en tres regiones anatómicas: reflejada, placentaria y umbilical. Cada región tiene diferentes funciones fisiológicas, como en condiciones patológicas. Aquí, describimos un protocolo para diseccionar el tejido amnión humano en tres secciones y mantenerlo in vitro. En el cultivo, las células derivadas del amnion reflejado mostraron una morfología cuboidal, mientras que las células de las regiones placentaria y umbilical eran escamosas. No obstante, todas las células obtenidas tienen un fenotipo epitelial, demostrado por la inmunodetección de la E-cadherina. Por lo tanto, debido a que las regiones placentarias y reflejadas in situ difieren en los componentes celulares y las funciones moleculares, puede ser necesario que los estudios in vitro consideren estas diferencias, ya que podrían tener implicaciones fisiológicas para el uso de HAEC en investigación biomédica y la aplicación prometedora de estas células en la medicina regenerativa.
Introducción
Las células del epitelio amniótico humano (HAEC) se originan durante las primeras etapas del desarrollo embrionario, alrededor de ocho días después de la fertilización. Surgen de una población de células epiteliales escamosas del epiblasto que derivan de la capa más interna de la membrana amniótica1. Por lo tanto, HAEC se consideran restos de células pluripotentes del epiblasto que tienen el potencial de diferenciarse en las tres capas germinales del embrión2. En la última década, diversos grupos de investigación han desarrollado métodos para aislar estas células de la membrana amniótica a término de gestación para carac....
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Protocolo
Este protocolo fue aprobado por el comité ético del Instituto Nacional de Perinatología en la Ciudad de México (Número de Registro 212250-21041). Todos los procedimientos realizados en estos estudios se ajustaron a las normas éticas del Instituto Nacional de Perinatología, la Declaración de Helsinki y las directrices establecidas en la Norma Oficial Mexicana del Ministerio de Salud.
1. Preparación
- Prepare una solución de 1x PBS con EDTA. Para ello, añada 500 ml de stock EDTA de 0,5 M en 500 ml de 1PBS para una concentración final de 0,5 mM EDTA.
- Prepare el medio de cultivo para HAEC. Tomar 450 ml de alto nivel de glucosa....
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Resultados
Los HAEC se aislaron de cada una de las tres regiones anatómicas de la membrana amniótica y se cultivaron individualmente in vitro. Después de 48 h de cultivo, las células con un fenotipo epitelial se adhirieron a la superficie de la placa, aunque el medio también contenía desechos celulares y células flotantes, que se eliminaron una vez que se cambió el medio(Figura 3).
Durante el procesamiento del cultivo primario (pasaje cero, P0), podrían surgir algunas compli.......
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Discusión
Implementamos un nuevo protocolo para aislar HAEC de las membranas de términos. Se diferencia de los informes anteriores en que cada membrana se dividió en sus tres regiones anatómicas antes del aislamiento para analizar las células de cada una.
Uno de los pasos más críticos en el protocolo es el lavado de la membrana para eliminar todos los coágulos sanguíneos, ya que pueden interferir con la actividad de la trippsina al separar las células epiteliales. No llevar a cabo este paso correctament.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Nuestra investigación fue apoyada por subvenciones del Instituto Nacional de Perinatología de México (21041 y 21081) y CONACYT (A1-S-8450 y 252756). Agradecemos a Jessica González Norris y Lidia Yuriria Paredes Vivas por el apoyo técnico.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| cultivo | |||
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21985023 | 55 mM |
| de Animales Recombinante Humano EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Antibiótico-Antimicótico | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 12430054 | Suplementado con alto contenido de glucosa y EDTA HEPES |
| Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9260G | 0,5 M | |
| Célula madre embrionaria FBS, calificado | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10439024 | |
| Aminoácidos no esenciales | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11140050 | 100X |
| Paraformaldehído | cualquier marca | ||
| Solución salina tamponada con fosfato | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| Solución salina (cloruro de sodio 0,9%) | cualquier marca | ||
| Piruvato de sodio | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11360070 100 mM | |
| Trypsin/EDTA 0,05% | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 25300054 | |
| Material desechable | |||
| 100 y micro; m Filtro de celdas | Corning/Falcon | 352360 | |
| Plato de cultivo tratado con TC de 100 mm | Corning | 430167 | |
| 24 pocillos Placas de pocillos múltiples transparentes tratadas con TC | Corning/Costar | 3526 | |
| Placas de pocillos múltiples transparentes con tratamiento TC de 6 pocillos | Corning/Costar | 3516 | |
| Tubo de centrífuga estéril no pirogénico | de cualquier marca | con fondo | |
| Puntas estériles no pirogénicas de 1.000 y micro; l, 200 y micro; l y 10 µl. | |||
| Gasas de algodón estériles | |||
| Pipetas serológicas estériles de 5, 10 y 25 mL de | cualquier marca | ||
| Guantes quirúrgicos estériles | de cualquier marca | ||
| Equipo | |||
| seguridad biológica | |||
| Centrífuga | |||
| Micropipetas | |||
| Llenador/dispensador | |||
| Vasos de precipitados estériles de 500 mL | |||
| cortar de plástico estéril | |||
| Bisturíes, tijeras, pinzas, pinzas estériles Recipiente | |||
| estéril de acero inoxidable | |||
| Bandeja | |||
| Tubo Rotador | MaCSmix | ||
| Anticuerpos y Kits | Anticuerpo ID | ||
| Anti-E-cadherina | BD Biosciences | 610181 | RRID:AB_3975 |
| Anti-KI67 | Santa Cruz | 23900 | RRID:AB_627859) |
| Anti-NANOG | Peprotech | 500-P236 | RRID:AB_1268274 |
| Anti-OCT4 | Abcam | ab19857 | RRID:AB_44517 |
| Anti-SOX2 | Millipore | AB5603 | RRID:AB_2286686 |
| Anti-SSEA-4 | Señalización Celular | 4755 | RRID:AB_1264259 |
| Anti-TRA-1-60 | Señalización Celular | 4746 | RRID:AB_2119059 |
| Cabra Anti-Ratón Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| Cabra Anti-Conejo Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Kit de ensayo de túnel | Abcam | 66110 |
Referencias
- Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).
- Garcia-Lopez, G., et al. Human amniotic epithelium (HAE) as a possible source of stem c....
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