Aquí, presentamos un protocolo para medir rápida y fácilmente el factor nuclear kappa-light-chain-enhancer de la activación de células B activadas (NF--B) en líneas celulares que expresan las construcciones de reporteronf-B::luciferase, a través de mediciones de luminiscencia en el lisado celular. Además, la expresión génica se determina a través de RT-qPCR aislado de células infectadas con Salmonella Typhimurium.
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Artículo de método
Activación y cuantificación de la expresión génica dependiente de NF--B en células de cultivo de tejido infectado por Salmonella
En este artículo
Resumen
Resumen
El factor de transcripción dimerica NF--B regula muchas vías de respuesta celular, incluyendo vías inflamatorias induciendo la expresión de varias citoquinas y quimioquinas. NF--B se expresa constitutivamente y es secuestrado en el citosol por el factor nuclear de proteína inhibitoria del potenciador del gen de polipéptido ligero kappa en el inhibidor de las células B, alfa (I-B). La activación de NF--B requiere la degradación de I-B, que luego expone una señal de localización nuclear en NF-B y promueve su tráfico al núcleo. Una vez en el núcleo, NF-B se une a la región promotora de los genes diana NF-B, como la interleucina 6 (IL-6) y la IL-23, para promover su expresión.
La activación de NF-B se produce independientemente de la transcripción o la traducción. Por lo tanto, el estado de activación de NF-B debe medirse mediante la cuantificación de NF-B específicamente en el núcleo, o mediante la cuantificación de la expresión de los genes diana NF-B. En este protocolo, las células transfectó de forma estable con una construcción de reportero NF-B::luciferase para la activación de NF-B utilizando técnicas de cultivo de tejido in vitro. Estas células están infectadas con Salmonella Typhimurium para activar NF-B, que se trafica con el núcleo y se une a los sitios B en la región promotora de la luciferasa, induciendo su expresión. Las células se lysed y analizan con el sistema de ensayo luciferase. La cantidad de luciferasa producida por las células se correlaciona con la intensidad de la señal de luminiscencia, que es detectada por un lector de placas. La señal de luminiscencia generada por este procedimiento proporciona un método rápido y altamente sensible para evaluar la activación NF-B bajo una serie de condiciones. Este protocolo también utiliza PCR de transcripción inversa cuantitativa (RT-qPCR) para detectar niveles relativos de ARNm que son indicativos de expresión génica.
Introducción
La familia de proteínas del factor nuclear B (NF-B) son importantes activadores de transcripción que regulan la expresión génica en varias vías biológicas. La activación de NF-B induce la transcripción de genes diana, muchos de los cuales son importantes para las respuestas inmunitarias e inflamatorias, la proliferación celular, las respuestas al estrés y la progresión del cáncer1,2. Nf--B desempeña un papel integral en la mediación de los primeros resultados inflamatorios para el aclaramiento de patógenos. Dados los muchos procesos biológicos mediados por la activación nf-B, las interrupciones en su señalizac....
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Protocolo
1. Passaging y Sembrado celular
- Mantener las células HeLa 57A en un matraz de 75 cm2 que contenga 10 ml de medios Eagle 's modificados de Dulbecco (DMEM) complementados con un 5% de suero bovino fetal activado por calor (FBS) a 37 oC en una incubadora de CO2 al 5%.
- Aspirar los medios de cultivo celular y lavar con 1 ml de solución de trippsina-EDTA al 0,05%. Aspirar trippsina y reemplazar con 1 mL adicional. Colocar el matraz en una incubadora de 37oC durante 4-5 min para permitir que las células se sepárense del matraz.
- Agregue 9 ml de medios de cultivo celular y lave suavemente la parte inferior del matraz unas cua....
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Resultados
El ensayo descrito aquí se centra en la activación del factor de transcripción NF-B utilizando un reportero de luciferasa dependiente de NF-B que está establemente transctado en una línea de células de HeLa. La NF-B activada se traslada al núcleo donde se une a los sitios de unión B de los genes diana, incluidas las citoquinas proinflamatorias IL6 e IL23. En la Figura 1se muestra una descripción general de la activación NF-B. La bacteria gra.......
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Discusión
La contribución principal del protocolo descrito es que proporciona un método rápido y fácil para detectar la activación NF-B en las células, lo que permite un análisis de alto rendimiento de múltiples condiciones estimulantes o fármacos que afectan a la activación NF-B. Aquí, describimos un protocolo para la activación NF-B en las células HeLa infectadas por Salmonella. Estas células se pueden utilizar para la infección con otros patógenos, así como para estudiar el impacto de la infección bacteriana en la acti.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
La investigación en el laboratorio Keestra-Gounder está respaldada por subvenciones del NIAID del NIH bajo el número de premio R21AI122092 y de la Asociación Americana de la Diabetes bajo el Premio Número 1-18-JDF-035.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Película adhesiva | VWR International | 60941-070 | |
| Cloroformo | Fisher Bioreactivos | C298-500 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11665092 | |
| kit de tratamiento de ADNasa | Qiagen | 79254 | |
| dNTPs | Promega | U1511 | |
| Etanol | Fisher Bioreactivos | BP2818100 | |
| células FBS | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| HeLa 57A | Ref # 15 | ||
| Kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad Applied | Biosystems | 4368814 | |
| Kanamicina | Biorreactivos | Fisher BP906-5 | |
| LB | agar Fisher Biorreactivos | BP1425-500 | |
| Caldo de lisogén | Fisher Bioreactivos | BP1426-500 | |
| MgCl2 | Fisher Chemical | ||
| NanoDrop ND-1000 | Espectrofotómetro | Thermo Scientific | |
| Sistema de ensayo de luciferasa | Promega | E1501 | Tampón de lisis celular y sustrato |
| de luciferinaHexámeros aleatorios | Thermo Scientific | SO142 | |
| Imprimación | 5'-CCAGGAAATGAGCTTGAC AAAGT-3'Imprimación | ||
| inversa GAPDH en tiempo real | 5-'CCCACTCCTCCACCT TTGAC-3'Imprimación | ||
| directa IL-23 en tiempo real | 5-'GAGCCTTCTCTGCTCCC TGAT-3'En | ||
| tiempo real Imprimación inversa IL-23 | 5'-AGTTGGCTGAGGCCCAGTAG-3'Imprimación | ||
| Scientific | EO0381 | ||
| RT buffer | Promega | A3561 | |
| SL1344 | Ref # 17 | ||
| SL1344 Δ sipA sopB::MudJ sopE2::p SB1039 | Ref # 18 | ||
| SL1344 Δ sopE y Delta; sipA sopB::MudJ sopE2::p SB1039 | Ref # 18 | ||
| SYBR verde | Applied Biosystems | 4309155 | 2x mastermix |
| Tri-reactivo Centro de | Investigación Molecular | TR 118 | tiocianato de guanidina |
| Tripsina -EDTA | Thermo Fisher | 25300054 | 0.05% Tripsina-EDTA |
| Agua ultrapura | Biorreactivos | Fisher | |
| Placa de pocillos para PCR | VWR International | 89218-294 | Placa de 384 pocillos |
Referencias
- Liu, T., Zhang, L., Joo, D., Sun, S. C. NF-kappaB signaling in inflammation. Signal Transduction and Targeted Therapy. 2, (2017).
- Piva, R., Belardo, G., Santoro, M. G. NF-kappaB: a stress-regulated switch for cell survival. Antioxidants & Redox Signaling. 8....
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Reimpresiones y permisos
