Diferenciación neuronal eficiente utilizando el cultivo monocelular de células madre embrionarias humanas

Summary

Aquí se presenta un protocolo para la generación de un cultivo de una sola célula de células madre embrionarias humanas y su posterior diferenciación en células progenitoras neuronales. El protocolo es simple, robusto, escalable y adecuado para aplicaciones de detección de drogas y medicina regenerativa.

Abstract

La diferenciación in vitro de células madre embrionarias humanas (HESC) ha transformado la capacidad de estudiar el desarrollo humano a nivel biológico y molecular y ha proporcionado células para su uso en aplicaciones regenerativas. Los enfoques estándar para el cultivo de hESC utilizando el cultivo de tipo colonia para mantener los hESC indiferenciados y la formación de rosetas y cuerpo embrionario (EB) para la diferenciación en diferentes capas germinales son ineficientes y consumen mucho tiempo. Aquí se presenta un método de cultivo de una sola célula que utiliza hESC en lugar de una referencia cultural de tipo colonia. Este método permite el mantenimiento de las características características de los hESC indiferenciados, incluida la expresión de marcadores hESC a niveles comparables a los hESC de tipo colonia. Además, el protocolo presenta un método eficaz para la generación de células progenitoras neuronales (NPC) a partir de hESC de tipo de una sola célula que produce NPC dentro de 1 semana. Estas células expresan altamente varios genes marcadores NPC y pueden diferenciarse en varios tipos de células neurales, incluyendo neuronas dopaminérgicas y astrocitos. Este sistema de cultivo de una sola célula para hESCs será útil para investigar los mecanismos moleculares de estos procesos, estudios de ciertas enfermedades y pantallas de descubrimiento de fármacos.

Introduction

Las células madre embrionarias humanas (HESC) tienen el potencial de diferenciarse en las tres capas primarias de gérmenes, que luego se diferencian en varios linajes de células progenitoras multipotentes. Estos linajes posteriormente dan lugar a todos los tipos de células en el cuerpo humano. Los sistemas de cultivo hESC in vitro han transformado la capacidad de estudiar el desarrollo embrionario humano y han servido como una valiosa herramienta para obtener nuevos conocimientos sobre cómo estos procesos se regulan a nivel biológico y molecular. Del mismo modo, los estudios de células madre pluripotentes inducidas (IPSC) generadas a partir de la reprogramación de cél....

Protocol

1. Preparación de placas recubiertas de matriz de membrana de sótano calificadas por hESC

1. Descongelar lentamente la matriz de membrana de sótano calificada por hESC (ver Tabla de Materiales)solución a 4 oC durante al menos 2-3 h o durante la noche para evitar la formación de un gel.
2. Para preparar placas recubiertas con matriz de membrana de sótano, diluya la matriz en frío DMEM/F12 a una concentración final del 2%. Mezclar bien y cubrir cada pocal de una placa de 6 pocillos con 1 ml de la solución de matriz diluida.
3. Incubar las placas recubiertas con matriz de membrana del sótano a temperatura ambiente (RT) durante al men....

Results

Aquí se presenta un protocolo mejorado para el mantenimiento y la expansión del cultivo de tipo de una sola célula de hESC y su diferenciación eficiente en células progenitoras neuronales, que posteriormente se diferencia en varios linajes neuronales aguas abajo, incluyendo neuronas dopaminérgicas y astrocitos.

Las imágenes representativas de contraste de fase muestran la morfología celular en diferentes pasos durante la adaptación de los hESC de tipo colonia al cultivo de tipo de una sola cél.......

Discussion

Los métodos escalables y eficientes para la diferenciación de los HEC en varios linajes y la generación de un número suficiente de células diferenciadas son criterios importantes para la detección de fármacos y la terapia con células madre. Se han publicado varios métodos de paso de una sola célula, en los que las células se cultivan en presencia de inhibidores de LA NAdo u otras moléculas pequeñas para mejorar la supervivencia, pero los productos finales de estos métodos de cultivo son los hESC de tipo colonia

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Placas M de 35 mm	ibidi	81156	Placa de cultivo celular
Placas de 6 pocillos	Corning	3516
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104-500	Solución de desprendimiento de células
Activin A	R& Sistema D	338-AC-050
Ácido ascórbico	Sigma Aldrich	A4403
B27 suplemento	Thermo Fisher	17504044
B27 (-Vit A)	Thermo Fisher	12587010
BDNF	Applied Biological Materials	Z100065
bFGF	Centrífuga Peprotech	100-18C
	DAMON/ICE	428-6759
Incubadora de CO2	Thermo Fisher	4110
Corning hESC Matrix (Magrigel)	Corning	354277	Matriz de membrana basal (utilizada para la mayor parte del protocolo aquí)
Cryostor CS 10	Stemcell Technologies	7930	Solución de congelación celular
Dispasa	Stemcell Technologies	7923
DMEM	Thermo Fisher	10569-010
DMEM/F12	Thermo Fisher	10565-018
Dorsomorphin	Tocris	3093
EGF	Peprotech	AF-100-16A
Suero Fetal Bovino	Fisher Scientific SH3007003HI
FGF8	Materiales Biológicos Aplicados	Z101705
GDNF	Materiales Biológicos Aplicados	Z101057
Geltrex matriz	Thermo Fisher	A1569601	Matriz de membrana basal
GlutaMax	Thermo Fisher	35050061	Suplemento de glutamina, 100X
H9 (WA09) línea de células madre embrionarias humanas	WiCell	WA09
Heregulina b-1	Peprotech	100-3
IGF	Peprotech	100-11
Knockout DMEM	Thermo Fisher	10829018
Knockout Serum Reemplazo	Thermo Fisher	10828028
Laminin	Sigma Aldrich	L2020
mTeSR1	Stemcell Technologies	85850	hESC medio de cultivo
N2 suplemento	Thermo Fisher	17502001
NEAA	Thermo Fisher	11140050
Neurobasal	Thermo Fisher	21103049
Poli-L-ornitina	Sigma Aldrich	P3655
Inhibidor	de ROCK Tocris	1254
SB431542	Tocris	1614
SHH	Materiales Biológicos Aplicados	Z200617
Medio progenitor neuronal Stemdiff Stemcell	Technologies	5833	NPC medio de expansión