Artículo de método

Diferenciación neuronal eficiente utilizando el cultivo monocelular de células madre embrionarias humanas

DOI:

10.3791/60571

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18 de enero de 2020

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1Immunity, Inflammation and Disease Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health, 2NIH Stem Cell Unit, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí se presenta un protocolo para la generación de un cultivo de una sola célula de células madre embrionarias humanas y su posterior diferenciación en células progenitoras neuronales. El protocolo es simple, robusto, escalable y adecuado para aplicaciones de detección de drogas y medicina regenerativa.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La diferenciación in vitro de células madre embrionarias humanas (HESC) ha transformado la capacidad de estudiar el desarrollo humano a nivel biológico y molecular y ha proporcionado células para su uso en aplicaciones regenerativas. Los enfoques estándar para el cultivo de hESC utilizando el cultivo de tipo colonia para mantener los hESC indiferenciados y la formación de rosetas y cuerpo embrionario (EB) para la diferenciación en diferentes capas germinales son ineficientes y consumen mucho tiempo. Aquí se presenta un método de cultivo de una sola célula que utiliza hESC en lugar de una referencia cultural de tipo colonia. Este método permite el mantenimiento de las características características de los hESC indiferenciados, incluida la expresión de marcadores hESC a niveles comparables a los hESC de tipo colonia. Además, el protocolo presenta un método eficaz para la generación de células progenitoras neuronales (NPC) a partir de hESC de tipo de una sola célula que produce NPC dentro de 1 semana. Estas células expresan altamente varios genes marcadores NPC y pueden diferenciarse en varios tipos de células neurales, incluyendo neuronas dopaminérgicas y astrocitos. Este sistema de cultivo de una sola célula para hESCs será útil para investigar los mecanismos moleculares de estos procesos, estudios de ciertas enfermedades y pantallas de descubrimiento de fármacos.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las células madre embrionarias humanas (HESC) tienen el potencial de diferenciarse en las tres capas primarias de gérmenes, que luego se diferencian en varios linajes de células progenitoras multipotentes. Estos linajes posteriormente dan lugar a todos los tipos de células en el cuerpo humano. Los sistemas de cultivo hESC in vitro han transformado la capacidad de estudiar el desarrollo embrionario humano y han servido como una valiosa herramienta para obtener nuevos conocimientos sobre cómo estos procesos se regulan a nivel biológico y molecular. Del mismo modo, los estudios de células madre pluripotentes inducidas (IPSC) generadas a partir de la reprogramación de células somáticas aisladas de pacientes humanos proporcionan nuevos conocimientos sobre diversas enfermedades. Además, el progenitor y las células diferenciadas derivadas de los HEC pueden ser útiles para la investigación que involucra terapia con células madre y detección de drogas1,2,3,4.

Los hESC se pueden inducir a diferenciarse en células progenitoras neuronales (NCC), que son células multipotenciales con una amplia capacidad de autorenovación. Posteriormente, estas células se pueden diferenciar en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos5,6. Los PNJ también ofrecen un sistema celular para estudios in vitro de biología del neurodesarrollo y diversas enfermedades neurológicas. Sin embargo, los métodos actuales de cultivo de tipo colonia que implican heSC y su diferenciación en NNP son ineficientes y a menudo implican cocultivo, así como formación de cuerpo embrionario (EB) y formación de rosetas5,7,8,9. Estos protocolos presentan tasas de supervivencia más bajas y diferenciación espontánea y consumen más tiempo.

Aquí se presenta un sistema de cultivo mejorado y robusto que es fácilmente escalable y utiliza el cultivo de tipo de una sola célula de alta densidad de hESCs10. La inclusión del inhibidor de la roh-quinasa (ROCK) contribuyó a mejorar significativamente la eficiencia de supervivencia durante el cultivo de tipo de célula única de hESC10,11,12,13,14. En este sistema de cultivo, los hESC se pueden mantener y ampliar fácilmente. Además, el protocolo presenta un método eficiente para generar PNJ a partir del cultivo de tipo de una sola célula de hESC, lo que permite la producción de PNJ altamente puros.

En resumen, el protocolo de cultivo de tipo de una sola célula que utiliza hESCs ofrece un modelo atractivo para estudiar la diferenciación de estas células en varios linajes, incluidos los PNJ. Este protocolo es fácilmente escalable y por lo tanto adecuado para generar células para la investigación que involucra terapia regenerativa y cribado de drogas.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Preparación de placas recubiertas de matriz de membrana de sótano calificadas por hESC

  1. Descongelar lentamente la matriz de membrana de sótano calificada por hESC (ver Tabla de Materiales)solución a 4 oC durante al menos 2-3 h o durante la noche para evitar la formación de un gel.
  2. Para preparar placas recubiertas con matriz de membrana de sótano, diluya la matriz en frío DMEM/F12 a una concentración final del 2%. Mezclar bien y cubrir cada pocal de una placa de 6 pocillos con 1 ml de la solución de matriz diluida.
  3. Incubar las placas recubiertas con matriz de membrana del sótano a temperatura ambiente (RT) durante al menos 3 h o a 4 oC durante la noche.
    NOTA: Las placas con matriz de membrana de sótano se pueden almacenar a 4 oC durante 1 semana antes de retirar la solución de matriz y utilizar las placas.

2. Adaptación de los hESC de tipo Colonia a la cultura hESC de una sola célula

  1. Para pasar los cultivos libres de comederos de los heSC de tipo colonia H9 (WA09) cultivados en la matriz de membrana del sótano, aspirar el medio de los pozos(Figura 1A)9.
  2. Lavar 1x con 1 mL de DPBS. Añadir 1 ml de solución de dosificación (1 U/ml) por poca e incubar a 37oC durante 20 min.
  3. Retire la dosis, lave las células 1x suavemente con 2 ml de DMEM/F12, retire el medio y agregue 2 ml de DMEM/F12 a cada placa.
  4. Separe suavemente las colonias pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo y transfiera a un tubo de 15 ml.
  5. Centrifugar los pellets durante 2 min a 370 x g y aspirar el medio.
  6. Para disociar los gránulos celulares en células individuales, añadir 2 ml de solución de desprendimiento celular (1x concentración, ver Tabla de materiales)e incubar a 37 oC durante 10 min.
  7. Células centrífugas durante 2 min a 370 x g y retire la solución de desprendimiento.
  8. Agregue el medio ESC humano mTeSR1 fresco y disocia las células en células individuales mediante un suave pipeteo hacia arriba y hacia abajo.
  9. Para adaptar los hESC de tipo colonia a un cultivo de tipo de una sola célula, placa aproximadamente 1,5–2,0 x 106 hESC en cada pocel de la placa de 6 pocillos recubiertos con matriz de membrana del sótano en 2 ml de mTeSR1 que contiene 10 m de inhibidor de ROCK para 24 h(Figura 1A).
  10. Después de 24 h, reemplace el medio hESC por mTeSR1 fresco sin inhibidor DE ROCK y permita que los hESC crezcan como un tipo de una sola célula durante 3 días. Cambia el medio a diario.
  11. En el día 4, cuando los cultivos alcanzan casi el 100% de confluencia, disocia las células en la solución de desprendimiento, luego se vuelve a enredar como se describe en el paso 2.6.
    NOTA: El inhibidor DE ROCK mejora la supervivencia celular durante las 24 horas iniciales del cultivo hESC de tipo de una sola célula.

3. Formación y diferenciación del cuerpo embrioide en tres capas de gérmenes (Figura 2)

  1. Para formar EBs, primero resuspenda las células en 3 ml de medio mTeSR1 con inhibidor de 10 M ROCK durante las primeras 24 horas, luego incubadurante durante la noche en platos de fijación baja de 60 mm en una incubadora de 37 oC para permitir la agregación.
  2. Después de 24 h, los pequeños EB se transfieren a un tubo de 15 ml. Deje que los EB se asienten en la parte inferior del tubo y retire suavemente el medio con una pipeta. Transfiera los EB s a un medio EB (knockout-DMEM complementado con un 20% de reemplazo sérico, 1 x suplemento de glutamina [ver Tabla de Materiales],1% NEAA [aminoácidos no esenciales; ver Tabla de Materiales],y 0,2% de mercaptoetanol) y permitirles expandirse en platos de baja fijación durante 7 días. El medio se puede cambiar cada dos días como se describió anteriormente(Figura 2A).
  3. El día 7, recoger los EB s de los platos y transferirlos a un tubo de 15 ml. Retire suavemente el medio con una pipeta y transfiera los EB a una placa de 6 pocillos recubierta con matriz de membrana de sótano.
  4. Permitir que los EB se adhieran a la placa e incuban durante 12 días en medio EB, durante los cuales se diferenciarán en las tres capas germinales(Figura 2B). Cambia el medio cada dos días.
    NOTA: Durante la agregación de células, la placa de unión baja ayuda a evitar la fijación de EB.

4. Diferenciación de hESC de tipo de una sola célula en NNP(Figura 3)

  1. Para inducir la diferenciación de NPC, disociar los hESC de tipo una sola célula con 1 ml de solución de desprendimiento (1x) e incubar durante 10 min a 37oC.
  2. Centrifugar las células durante 2 min a 370 x g y retire el sobrenadante de solución de desprendimiento. Agregue 1 ml de DMEM/F12 y vuelva a suspender las células mediante pipeteo suave.
  3. Células de placa en una placa de 6 pocillos recubiertas con matriz de membrana de sótano a una densidad de 2 x 105 células/pozo en 2 ml de mTeSR1 que contiene 10 m de inhibidor DE ROCK.
  4. Después de 24 h, sustituya el medio de cultivo por medio de inducción neuronal (DMEM con 1% B27 menos vitamina A) complementado con 1 M de dorsomorforina y 5 M SB431542.
  5. Cambiar el medio cada dos días durante los primeros 4 días de inducción neuronal, luego todos los días hasta alcanzar la confluencia en el día 7 (Figura 3B).
    NOTA: (1) La dorsomorfina inhibe la vía BMP apuntando a los receptores ALK2,3,6 y también inhibe AMPK; SB431542 es un inhibidor de la vía TGF/Activin dirigiéndose a ALK5,7. (2) El mismo protocolo fue probado con otra línea ESC (WA01), que produjo resultados similares a WA0916. (3) Hemos utilizado generalmente Matrigel para la matriz de membrana del sótano; sin embargo, las células se pueden cultivar en Geltrex y luego diferenciarse en PNJ con resultados muy similares como se indica por la expresión de varios marcadores NPC(Figura 4D,E). Manipule Geltrex de la misma manera que Matrigel (ver sección 1).

5. Expansión y criopreservación de NPC

  1. Después de 7 días de inducción neuronal, disociar las células con 1 ml de solución de desprendimiento (1x) e incubar durante 10 min a 37oC.
  2. Centrifugar las células durante 2 min a 370 x g y retire el sobrenadante de solución de desprendimiento. Agregue 1 ml de medio de expansión NPC (ver Tabla de materiales)y resuspenda las células mediante pipeteo suave.
  3. Placa 1 x 105 células en 2 ml de medio de expansión NPC en placas de 6 pocillos recubiertas con matriz de membrana de sótano.
  4. Pasaje NPCs varias veces, según sea necesario, cuando las culturas alcanzan casi 90% de confluencia. Durante los primeros 3-4 pasajes, agregue el inhibidor de 10 M ROCK durante las 24 horas iniciales para evitar la muerte celular. Después de estos pasajes, las células se pueden pasar y cultivar sin inhibidor de ROCK. Cambie el medio cada dos días durante la expansión.
  5. Crioconserva los PNJ cuando las culturas alcancen la confluencia.
    1. Para la criopreservación, disociar las células en 1 ml de solución de desprendimiento (1x) durante 5 min a 37 oC, luego la suspensión centrífuga durante 2 min a 370 x g para eliminar la solución de desprendimiento.
    2. Añadir solución de congelación de células (ver Tabla de Materiales)a Los PNJ disociados a 1 x 106 células/ml y distribuir 1 mL de alícuotas a crioviales.
    3. Colocar los crioviales en un recipiente de congelación y guardarlos durante la noche en un congelador de -80 oC.
  6. Almacene los crioviales en el nitrógeno líquido.

6. Preparación de poli-L-ornitina (PLO) y placas recubiertas de Laminin

  1. Para preparar placas recubiertas de OLP/laminina, diluya la solución de material de la OLP en PBS o agua hasta una concentración final de 10 g/ml. Mezclar bien y cubrir cada pocal de una placa de 6 pocillos con 1 ml de solución de OLP diluida.
  2. Incubar durante al menos 2 h a 37 oC o durante la noche a 4oC.
  3. Lave cada pocáea con PBS.
  4. Diluir la solución de laminina en PBS frío o agua a 10 g/ml. Mezclar bien la solución laminina. Retire el PBS y cubra inmediatamente cada pocón con 1 ml de la solución laminina. Conservar las placas a 4oC y utilizarlas en 1 semana. Lavar con PBS y añadir inmediatamente un medio de cultivo.
    NOTA: No deje que las placas recubiertas de OLP/laminina se sequen.

7. Diferenciación de PNJ derivados de hESC en neuronas dopaminérgicas (Figura 6A)

  1. Placa NpCs en platos recubiertos de OLP/laminines en medio de expansión NPC a una densidad de aproximadamente 50%.
  2. Después de 24 h, cambiar el medio a medio DA1 (medio neurobasal que contiene 2 mM de suplemento de glutamina, 1x NEAA, 1x B27, 200 ng/mL SHH, y 100 ng/mL FGF8) y cambiar el medio cada dos días.
  3. Pasar culturas cuando alcanzan la confluencia. Disociar las células con 1 ml de solución de desprendimiento (1x) e incubar durante 10 min a 37oC.
  4. Centrifugar las células durante 2 min a 370 x g y retire el sobrenadante de solución de desprendimiento. Añadir 1 mL de medio DA1 y resuspender las células mediante pipeteo suave.
  5. Placa 1 x 105 células en 2 mL de medio DA1 en placas de pozo sacadas por OLP/laminina.
  6. Después de 10 días, cambie a medio DA2 (medio neurobasal que contiene 2 mM de suplemento de glutamina, 1x NEAA, 1x B27, 200 m de ácido ascórbico, 20 ng/ml BDNF y 20 ng/mL GNDF) y cambie el medio cada dos días durante 20 días adicionales(Figura 6A).
    NOTA: Agregue ácido ascórbico fresco diariamente al medio DA2. Dentro de los primeros 14 días, las células diferenciadas deben pasarse cuando alcanzan una confluencia del 90%, pero ya no después de eso.

8. Diferenciación de los PNJ derivados de la ESC en Astrocitos

  1. Células progenitoras neuronales de placas en placas recubiertas de OLP/lamininen en medio de expansión NPC a una densidad de aproximadamente el 50%.
  2. Después de las 24 h, cambie el medio a medio de astrocito (medio DMEM/F12 incluyendo 1:100 N2, 1:100 B27, 200 ng/mL IGF, 10 ng/mL activin A, 10 ng/mL heregulin-1, y 8 ng/mL bFGF) y cambie el medio cada dos días.
  3. Pasar culturas cuando alcanzan la confluencia. Disociar las células con 1 ml de solución de desprendimiento (1x) e incubar durante 10 min a 37oC.
  4. Centrifugar las células durante 2 min a 370 x g y retire el sobrenadante de solución de desprendimiento. Añadir 1 ml de medio de astrocito y resuspender las células mediante pipeteo suave.
  5. Placa 1 x 105 células en 2 ml de medio de astrocito en OLP/laminina recubierta de 6 platos de pozos.
  6. Permitir que la diferenciación continúe durante un total de 5-6 semanas(Figura 6B).

9. Mancha de inmunofluorescencia

  1. Células de cultivo en platos de 35 mm como se describió anteriormente para cada tipo de célula. Aspirar el medio y añadir 1 mL de solución de PCA al 4% por plato e incubar durante 20 min a RT.
  2. Lavar 2x durante 5 min con PBS.
    NOTA: Una vez fijadas las células, las placas de ensayo se pueden sellar con parafilm y almacenarse a 4 oC. Mancha con un anticuerpo dentro de 1 semana después de la fijación.
  3. Añadir 300 l de solución de bloqueo (cabra o suero de burro en PBS) por plato e incubar a RT durante 30-60 min.
  4. Lave el plato 2x con PBS durante 5 min.
  5. Añadir 300 l de solución de anticuerpos primarios(Tabla 1) (diluido en solución de bloqueo) e incubar a RT durante 1,5 h o durante la noche a 4oC.
  6. Lavar 2x con PBS durante 10 min.
  7. Añadir 300 sl de anticuerpo secundario conjugado fluorescente(Tabla 1) en la solución de bloqueo e incubar en la oscuridad durante 1 h a RT.
  8. Lavar las células 2veces durante 10 min con PBS.
  9. Añadir la solución de tinción Hoechst (concentración final de 1 M en PBS) a los núcleos de manchas. Incubar las células en la oscuridad durante 5 minutos a RT.
  10. Lave las células 1x con PBS durante 5 min y luego agregue 500 s de PBS. Mantenga los platos en la oscuridad, luego observe la fluorescencia con un microscopio confocal(Figura 2B, Figura 5C, Figura 6Ay Figura 7B).

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí se presenta un protocolo mejorado para el mantenimiento y la expansión del cultivo de tipo de una sola célula de hESC y su diferenciación eficiente en células progenitoras neuronales, que posteriormente se diferencia en varios linajes neuronales aguas abajo, incluyendo neuronas dopaminérgicas y astrocitos.

Las imágenes representativas de contraste de fase muestran la morfología celular en diferentes pasos durante la adaptación de los hESC de tipo colonia al cultivo de tipo de una sola cél...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los métodos escalables y eficientes para la diferenciación de los HEC en varios linajes y la generación de un número suficiente de células diferenciadas son criterios importantes para la detección de fármacos y la terapia con células madre. Se han publicado varios métodos de paso de una sola célula, en los que las células se cultivan en presencia de inhibidores de LA NAdo u otras moléculas pequeñas para mejorar la supervivencia, pero los productos finales de estos métodos de cultivo son los hESC de tipo colonia

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no declaran conflictos de intereses.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos al Dr. Carl D. Bortner (NIEHS) por su asistencia con el análisis FACS. Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación Intramuros del Instituto Nacional de Ciencias de la Salud Ambiental, los Institutos Nacionales de Salud, Z01-ES-101585 a AMJ.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Placas M de 35 mmibidi81156Placa de cultivo celular
Placas de 6 pocillosCorning3516
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104-500Solución de desprendimiento de células
Activin AR& Sistema D338-AC-050
Ácido ascórbicoSigma AldrichA4403
B27 suplementoThermo Fisher17504044
B27 (-Vit A)Thermo Fisher12587010
BDNFApplied Biological MaterialsZ100065
bFGFCentrífuga Peprotech100-18C
DAMON/ICE428-6759
Incubadora de CO2Thermo Fisher4110
Corning hESC Matrix (Magrigel)Corning354277Matriz de membrana basal (utilizada para la mayor parte del protocolo aquí)
Cryostor CS 10Stemcell Technologies7930Solución de congelación celular
DispasaStemcell Technologies7923
DMEMThermo Fisher10569-010
DMEM/F12Thermo Fisher10565-018
DorsomorphinTocris3093
EGFPeprotechAF-100-16A
Suero Fetal BovinoFisher Scientific SH3007003HI
FGF8Materiales Biológicos AplicadosZ101705
GDNFMateriales Biológicos AplicadosZ101057
Geltrex matrizThermo FisherA1569601Matriz de membrana basal
GlutaMaxThermo Fisher35050061Suplemento de glutamina, 100X
H9 (WA09) línea de células madre embrionarias humanasWiCellWA09
Heregulina b-1Peprotech100-3
IGFPeprotech100-11
Knockout DMEMThermo Fisher10829018
Knockout Serum ReemplazoThermo Fisher10828028
LamininSigma AldrichL2020
mTeSR1Stemcell Technologies85850hESC medio de cultivo
N2 suplementoThermo Fisher17502001
NEAAThermo Fisher11140050
NeurobasalThermo Fisher21103049
Poli-L-ornitinaSigma AldrichP3655
Inhibidorde ROCK Tocris1254
SB431542Tocris1614
SHHMateriales Biológicos AplicadosZ200617
Medio progenitor neuronal Stemdiff StemcellTechnologies5833NPC medio de expansión

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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