Aquí, presentamos un protocolo para la detección de proteínas mediadas por anticuerpos fluorescentes en preparaciones enteras de embriones y larvas de peces cebra.
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Artículo de método
Inmunohistoquímica de montaje completo en embriones y larvas de pez cebra
En este artículo
Resumen
Resumen
La inmunohistoquímica es una técnica ampliamente utilizada para explorar la expresión y localización de proteínas durante los estados normales de desarrollo y enfermedad. Aunque muchos protocolos de inmunohistoquímica se han optimizado para secciones de tejido y tejido de mamíferos, estos protocolos a menudo requieren modificación y optimización para organismos modelo no mamíferos. El pez cebra se utiliza cada vez más como sistema modelo en la investigación básica, biomédica y traslacional para investigar los mecanismos biológicos moleculares, genéticos y celulares de los procesos de desarrollo. Zebrafish ofrece muchas ventajas como sistema modelo, pero también requieren técnicas modificadas para una detección óptima de proteínas. Aquí, proporcionamos nuestro protocolo para la inmunohistoquímica de fluorescencia de montaje completo en embriones y larvas de peces cebra. Este protocolo también describe varias estrategias de montaje diferentes que se pueden emplear y una visión general de las ventajas y desventajas que proporciona cada estrategia. También describimos modificaciones a este protocolo para permitir la detección de sustratos cromogénicos en el tejido de montaje completo y la detección de fluorescencia en el tejido larvario seccionado. Este protocolo es ampliamente aplicable al estudio de muchas etapas de desarrollo y estructuras embrionarias.
Introducción
El pez cebra (Danio rerio) ha surgido como un modelo poderoso para el estudio de los procesos biológicos por varias razones, incluyendo el corto tiempo de generación, el desarrollo rápido, y la amenabilidad a las técnicas genéticas. Como resultado, el pez cebra se utiliza comúnmente en pantallas de moléculas pequeñas de alto rendimiento para la investigación toxicológica y el descubrimiento de fármacos. El pez cebra también es un modelo atractivo para el estudio de los procesos de desarrollo, ya que una sola hembra puede producir rutinariamente 50-300 huevos a la vez y los embriones ópticamente claros se desarrollan externamente permitiendo una visualización ....
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Protocolo
Los procedimientos para trabajar con adultos y embriones reproductores de peces cebra descritos en este protocolo fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal de la Universidad Estatal de Murray.
1. Recogida y fijación de embriones
- Prepare tanques de desove colocando parejas de sexo mixtas de pez cebra adultos en tanques con una malla o un revestimiento ranurado lleno de agua del sistema durante la noche.
- En las luces encendidas, cambie el agua del tanque de desove para agua fresca del sistema para eliminar las heces. Utilice un ciclo de luz oscura de 14 h/10 h con luces encendidas a las 9 am.
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Resultados
La inmunohistoquímica de montaje completo utiliza anticuerpos para detectar el patrón espacial de expresión de proteínas en el animal intacto. El flujo de trabajo básico de la inmunohistoquímica (representado en la Figura 1)consiste en la cría de peces cebra, la cría y preparación de embriones, el bloqueo de antígenos no específicos, el uso de un anticuerpo primario específico del antígeno para apuntar a la proteína de interés, la detección de ese anticuerpo .......
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Discusión
La inmunohistoquímica es una herramienta versátil que se puede utilizar para caracterizar la expresión espacio-temporal de prácticamente cualquier proteína de interés en un organismo. La inmunohistoquímica se utiliza en una amplia variedad de tejidos y organismos modelo. Este protocolo ha sido optimizado para su uso en peces cebra. La inmunohistoquímica en diferentes especies puede requerir diferentes técnicas de fijación y manipulación, bloqueando las soluciones dependiendo de las especies y la presencia de peroxidasas .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen información que revelar.
Agradecimientos
Financiación de NIH subvención 8P20GM103436 14.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Agarosa | Fisher Scientific | BP160-100 | |
| Papel de aluminio, resistente | Kirkland | Cualquier marca puede ser sustituida Anticuerpo | |
| anti-NMDA | Millipore Sigma | MAB363 | |
| Anti-fosfo-histona H3 (Ser10), clon RR002 | Millipore Sigma | 05-598 | |
| Receptor anti-pan-AMPA (GluR1-4) | Millipore Sigma | ||
| Albúmina sérica bovina (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Nitrato de calcio [Ca(NO3)2] | Sigma Aldrich | C4955 | |
| Tubos de centrífuga, 1,5 mL | Esmalte de uñas Axygen | MCT150C | |
| Clear | Sally Hanson | Cualquier esmalte de uñas o endurecedor puede ser sustituido | |
| Portaobjetos de depresión (concavidad) | Electrónica Miscroscopy Sciences | 71878-01 | |
| Diaminobenzidina | Thermo Scientific | 1855920 | |
| Medio embrionario, Danieau, 30% | 17,4 mM NaCl, 0,21 mM KCl, 0,12 mM MgS04, 0,18 mM Ca(NO3)2, 1,5 mM HEPES en agua ultrapura. | ||
| Medio embrionario, E2 | 7,5 mM NaCl, 0,25 mM KCl, 0,5 mM MgSO4, 75 μ M KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0,5 mM CaCl2, 0,35 mM NaHCO3, 0,5 mg/L azul de metileno | ||
| Soporte de tubo flotante | |||
| Leica Biosystems | DMi8 | ||
| Microscopio estereoscópico de fluorescencia | Leica Biosystems | M165-FC | |
| Cubertades de vidrio 18 mm x 18 mm | Corning | 284518 | |
| Cubreobjetos de vidrio 22 mm x 60 mm | Thermo Scientific | 22-050-222 | |
| Portaobjetos de vidrio | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Glicerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Cabra anti-ratón IgG Alexa 488 | Invitrogen | A11001 | |
| Solución HEPES | Sigma Aldrich | H0887 | |
| Cámara húmeda con tapa | Simport | M920-2 | |
| Peróxido de hidrógeno, 30% | Fisher Scientific | H325-500 | |
| Pluma Pap Immunedge | Vector labs | H-4000 | |
| Alfileres para insectos, tamaño 00 | Stoelting | 5213323 | |
| Sulfato de magnesio (MgSO4 · 7H2O) | Sigma Aldrich | 63138 | |
| Colador de malla | Oneida | Cualquier marca puede ser sustituida | |
| por Metanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
| Azul de metileno | Sigma Aldrich | M9140 | |
| Cerradura de tapa de microtubo | Research Products International | 145062 | |
| Horno microondas | Toastmaster | ||
| Mouse IgG | Sigma Aldrich | I8765 | |
| Suero de cabra normal | Millipore Sigma S02L1ML | ||
| Mezclador nutante | Fisher Scientific | 88-861-044 | |
| Paraformaldehído | Fisher Scientific | 04042-500 | |
| Pipetas Pasteur | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| PBTriton | 1% TritonX-100 en 1x PBS | ||
| Medio de montaje Permount | Fisher Chemical | SP15-500 | |
| Placa de Petri (vidrio) | Pyrex | 3160100 | |
| Placa de Petri (plástico) | Fisher Scientific | ||
| 1-fenil 2-tiourea | Acros Organics | 207250250 | |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS), 10x, pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS), 1x | 1x hecha a partir de 10x caldo diluido en dH2O | ||
| Cloruro de potasio (KCl) | Sigma Aldrich | P9333 | |
| Hidróxido de potasio (KOH) | Fisher | P250-500 | |
| Fosfato de potasio monobásico (KH2PO4) | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Pronase | Sigma Aldrich | 10165921001 | |
| proteinasa K | Invitrogen | AM2544 | |
| Cloruro de sodio (NaCl) | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Dibásico de fosfato de sodio (Na2HPO4) | Sigma Aldrich | S7907 | |
| Tanque de desove con tapa e inserto | Aquaneering | ZHCT100 | |
| SuperBlock PBS | Thermo Scientific | 37515 | |
| Superfrost + correderas | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Superglue gel | 3M Scotch | ||
| TNT | 100 mM Tris, pH 8,0; 150 mM de NaCl; 0,1% Preadolescente20; fabricado en dH2 | ||
| O Pipeta de transferencia | Fisher | 13-711-7M | |
| Ácido tricloroacético (Cl3CCOOH) | Sigma Aldrich | T6399 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | S374-500 | |
| TritonX-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Tween20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Pinza ultrafina | Fisher Scientific | 16-100-121 | |
| Agua, ultrapura/doble destilada | Fisher Scientific | W2-20 |
Referencias
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nature Genetics. 26 (2), 216-220 (2000).
- Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. 3rd ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31
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Reimpresiones y permisos
