Method Article

Identificación de reguladores de factores de transcripción mediante la proyección de rendimiento medio de bibliotecas de matriz y un reportero basado en la doble luciferasa

DOI:

10.3791/60582

⸱

March 27th, 2020

 , 
1Department of Molecular & Cellular Physiology, Albany Medical College

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para identificar nuevos reguladores de los factores de transcripción, desarrollamos un enfoque para las bibliotecas de ARN lentivirales o retrovirales arrayed utilizando un ensayo de reportero transcripcional basado en doble luciferasa. Este enfoque ofrece una forma rápida y relativamente económica de examinar a cientos de candidatos en un solo experimento.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los factores de transcripción pueden alterar la expresión de numerosos genes diana que influyen en una variedad de procesos posteriores, por lo que son buenos objetivos para las terapias contra el cáncer. Sin embargo, apuntar directamente a los factores de transcripción es a menudo difícil y puede causar efectos secundarios adversos si el factor de transcripción es necesario en uno o más tejidos adultos. La identificación de reguladores ascendentes que activan aberrantemente los factores de transcripción en las células cancerosas ofrece una alternativa más factible, especialmente si estas proteínas son fáciles de drogar. Aquí, describimos un protocolo que se puede utilizar para combinar bibliotecas lentivirales a escala media y un ensayo de reportero transcripcional basado en doble luciferasa para identificar nuevos reguladores de factores de transcripción en las células cancerosas. Nuestro enfoque ofrece una manera rápida, fácil y económica de probar cientos de genes en un solo experimento. Para demostrar el uso de este enfoque, realizamos una pantalla de una biblioteca de ARN lentiviral esampliatizada que contiene varios reguladores de proteína asociada al Sí (YAP) y coactivadora transcripcional con motivo de unión a PDZ (TAZ), dos coactivadores transcripcionales que son los efectores descendentes de la vía Hippo. Sin embargo, este enfoque podría modificarse para detectar a los reguladores de prácticamente cualquier factor de transcripción o cofactor y también podría utilizarse para examinar las bibliotecas CRISPR/CAS9, cDNA u ORF.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El propósito de este ensayo es utilizar bibliotecas virales para identificar reguladores de los factores de transcripción de una manera relativamente rápida y económica. La actividad transcripcional aberrante se asocia con el cáncer y la metástasis1,2,3,4,5,6, por lo que la orientación a los factores de transcripción en las células cancerosas es un enfoque terapéutico prometedor. Sin embargo, los factores de transcripción son a menudo difíciles de atacar farmacológicamente7 y muchos son necesarios para la función celular normal en los tejidos adultos8,9,10. Dirigirse a las vías asociadas al cáncer que activan aberrantemente los factores de transcripción para impulsar la enfermedad es un enfoque más factible con el potencial de tener efectos secundarios menos graves. La disponibilidad comercial de las bibliotecas arrayed lentiviral y retroviral RNAi, CRISPR/CAS9, cDNA o ORF permite a los investigadores probar la importancia de numerosos genes en un solo experimento. Sin embargo, se requiere una lectura confiable para la actividad transcripcional alterada.

Aquí, describimos el uso de un ensayo de reportero transcripcional basado en doble luciferasa y bibliotecas lentivirales arrayed para identificar proteínas que regulan los factores de transcripción en las células cancerosas. En este ensayo, los shRNA que se dirigen a los genes asociados al cáncer se entregan a las células cancerosas de los mamíferos a través de la transducción lentiviral y las células se seleccionan para una integración estable mediante puromicina. Las células se transtroculan a continuación con una construcción de reportero que expresa luciferasa de luciérnaga impulsada por un promotor específico para el factor de transcripción que se está investigando y una construcción de control que expresa Renilla luciferasse de un promotor constitutivamente activo que no responde al factor de transcripción que se está investigando. Demostramos este enfoque con una pantalla de prueba de concepto para reguladores de YAP y TAZ, los efectores descendentes críticos de la vía Hippo8,10,11. La actividad anormal de YAP y TAZ promueve varios pasos de la cascada metastásica11 y se observa en muchos cánceres11,,12,13. Sin embargo, aún no se entiende completamente cómo YAP y TAZ se activan aberrantemente en algunas células cancerosas. YAP y TAZ no unen EL ADN, sino que son reclutados a promotores por otros factores de transcripción. Los miembros de la familia de factores de transcripción del dominio TEA (TEAD) son los principales socios vinculantes para YAP y TAZ, y son críticos para la mayoría de las funciones dependientes de YAP y TAZ. Nuestra construcción de reportero expresa la luciferasa de la luciosel de un promotor yAP/TAZ-TEAD-responsive y estudios anteriores han demostrado que detecta fielmente los cambios en la actividad transcripcional YAP-TEAD y TAZ-TEAD2,14,15.

Nuestro enfoque es rápido, de rendimiento medio, y no requiere instalaciones de cribado, robots automatizados o secuenciación profunda de bibliotecas agrupadas. Los costos son relativamente bajos y hay numerosas bibliotecas disponibles comercialmente para elegir. Los equipos y reactivos requeridos también son relativamente estándar en la mayoría de los laboratorios. Se puede utilizar para detectar reguladores de prácticamente cualquier factor de transcripción si existe o se genera un reportero basado en luciferasa. Utilizamos este enfoque para examinar los shRNA en las células cancerosas, pero cualquier línea celular que pueda ser transllenada con una eficiencia razonable podría ser utilizada con cualquier tipo de biblioteca de matriz.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTA: En la Figura 1se muestra un resumen esquemático de este protocolo.

1. Preparación de la biblioteca de vectores Lentivirales

NOTA: La pantalla demostrada utilizaba una biblioteca de shRNA en matriz comprada como acciones de glicerol en placas de 96 pocillos, pero las bibliotecas también se pueden ensamblar manualmente en función de una lista de candidatos. Los controles adecuados deben ser considerados e incluidos en cualquier biblioteca. Esto incluye un shRNA de control no objetivo (shNTC), un shRNA de control dirigido al factor de transcripción que se está investigando y, si es posible, un ARNH dirigido a la luciferas de luciérnaga.

  1. Añadir 1,3 ml de caldo de luria (LB) (1% bacto-trypton, 0,5% extracto de levadura, 1% de NaCl, pH 7,5) que contiene 100 g/ml de ampicilina a cada pocil de una placa de pozo de 96 pocillos. Inocular cada pocal con 2 ml de culata de glicerol y crecer a 37 oC durante la noche con agitación constante a 225 rpm.
  2. Transfiera cada cultivo bacteriano a un tubo centrífugo de 1,5 ml y pelete las bacterias por centrifugación a 21.000 x g a 4 oC durante 10 min.
  3. Purifica cada vector usando un kit de mini-preparación bacteriana siguiendo el protocolo del fabricante.
  4. Determinar la concentración de cada vector utilizando un espectrofotómetro.
  5. Almacenar los plásmidos a -20oC.
    NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.

2. Embalaje de la biblioteca lentiviral arrayed

NOTA: Todo trabajo relacionado con el lentivirus, incluyendo el empaquetado, la infección y el posterior cultivo de células infectadas debe seguir estrictamente las normas y regulaciones institucionales de bioseguridad.

  1. Expanda las células 293FT utilizando medios de crecimiento completos (medio águila modificado de Dulbecco (DMEM) que contiene 4 mM de L-glutamina, 4.500 mg/L de glucosa y piruvato sódico, complementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 100 unidades/ml de penicilina, 100 g/ml de estreptomicina y 2 mM de antibiótico de glutaticina y 2 mM de lglutinamina).
  2. Para cada vector de la biblioteca del paso 1.4, aseque un 24-well con 1 x 105 celdas 293FT.
    NOTA: Se recomienda empaquetar y utilizar algunos pozos adicionales de un vector viral de control para probar el mosaico del virus antes de continuar con el paso 3 (ver más abajo).
  3. Incubar las células a 37oC con un 5% deCO2 durante 24 h.
    NOTA: Un protocolo general para empaquetar lentivirus que se describió anteriormente14 se ha reducido a 24 pozos para este protocolo. Utiliza psPAX2 para envases lentivirales y VSVG como proteína de capa. Si se desea un virus ectropic, se puede utilizar un vector que entrega Eco en lugar de VSVG. Se recomienda encarecidamente que este protocolo esté optimizado para lograr un titer viral que dé entre el 30%-70% de eficiencia de infección de las células objetivo (ver Discusión). Consulte la Tabla suplementaria 1 para obtener una lista de todos los vectores utilizados.
  4. Configure una mezcla de transfección para cada vector viral del paso 1.4 como se describe a continuación. Cada transfección debe contener 250 ng del vector viral, 125 ng de psPAX2, 125 ng de VSVG, 1,25 ml de reactivo de transfección 1 y 23,75 l de tampón de transfección (ver Tabla de materiales).
    1. Diluir cada vector lentiviral a 50 ng/L con agua libre de nucleasas, y luego transferir 5 l (250 ng) en un pozo de una placa de PCR de 96 pocillos.
    2. Haga la súper mezcla de transfección mezclando 1.25 éL * X del reactivo de transfección 1 y 23.75 l * X de tampón de transfección precalentado donde "X" es el número total de transfecciones más varios adicionales para tener en cuenta la pérdida de volumen durante el pipeteo.
    3. Incubar la súper mezcla de transfección a temperatura ambiente durante 5 min.
    4. Añadir 125 ng * X de psPAX2 y 125 ng * X de VSVG al tubo de transfección super mezcla desde el paso 2.4.3 y canalizar suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Proceda rápidamente al paso 2.4.5.
    5. Alíce inmediatamente la mezcla del paso 2.4.4 en cada tubo de una tira de PCR, y luego utilice la pipeta multicanal para transferir 25 l de la mezcla a cada pozo que contenga un vector viral del paso 2.4.1.
    6. Incubar a temperatura ambiente durante 20 min.
    7. Transfiera los 30 ol de cada 96-bien del paso 2.4.6 a un pozo de los 24-bien que contienen 293 células FT del paso 2.3.
  5. Incubar las células a 37 oC con un 5% deCO2 durante 24 h y luego reemplazar los medios en cada pocal de la placa de 24 pocillos con 500 oC de medios de crecimiento completos frescos. Incubar las células a 37oC con un 5% deCO2 para otros 24 h.
  6. Usando una pipeta multicanal, recoge el sobrenadante viral de cada pozo y la alícuota 220 l (suficiente para 1 infección en el paso 3 más un poco de volumen adicional) en dos 96 pocillos cada uno. Estas son las placas de sobrenadantes virales.
  7. Almacene las placas de sobrenadantes virales arrayed a -80 oC.
    NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. También se recomienda probar algunos de los virus de control adicional que se empaquetaron (ver arriba) en las células que se infectarán antes de continuar con el paso 3. Esto es para asegurar que el titer es suficiente para lograr al menos 30% de eficiencia de infección.

3. Infección de las células de la pantalla

NOTA: Las células del melanoma humano (A375) se utilizaron para demostrar este enfoque, pero este método se puede aplicar a cualquier célula adherente que infecte con lentivirus. Sin embargo, el cultivo celular y las condiciones de chapado deben optimizarse para cada línea de celda (consulte Discusión).

  1. Expanda las células que se infectarán en medios de crecimiento completos.
  2. Placas de semilla de 24 pocillos con 1 x 105 células en 0,5 ml de medios de crecimiento completos por poca. Semilla un pozo para cada vector viral a ser probado (incluyendo controles) e incluyen un pozo adicional que no se infectará que servirá como un control para la selección de fármacos en el paso 3.7.
  3. Incubar las células a 37oC con un 5% deCO2 durante 24 h.
  4. Infectar cada pozo del paso 3.2 con un sobrenadante viral diferente del sobrenadante lentiviral de matriz congelada de la siguiente manera.
    1. Preparar medios de crecimiento completos que contengan 20 g/ml de polibreno.
    2. Descongelar los sobrenantes de la biblioteca lentiviral arrayed desde el paso 2.7 hasta la temperatura ambiente.
    3. Aspirar los medios de crecimiento de las placas de 24 pocillos del paso 3.2 y añadir inmediatamente 200 l de medios de crecimiento que contienen polibrino a cada pocal.
    4. Usando una pipeta multicanal, transfiera 200 ml de sobrenadante viral de cada 96 pozos del paso 3.4.2 a los 24 pozos del paso 3.4.3.
  5. Incubar las células a 37oC con 5% deCO2 durante 24 - 48 h.
    NOTA: Algunas líneas celulares pueden requerir más de 24 h para expresar los shRNA y volverse resistentes a la puromicina. El vector viral utilizado aquí proporciona un Turbo-GFP-IRES-puroR con un shRNA basado en miR30 en el 3'UTR de puroR (Figura 1). La eficiencia de la infección y la expresión del gen de resistencia a la puromicina y el ARNH fueron controlados por proteínas fluorescentes verdes.
  6. Preparar medios de crecimiento completos que contengan 2,5 g/ml de puromicina.
    NOTA: La concentración de selección de puromicina varía entre líneas celulares. Se recomienda realizar una curva de eliminación de antibióticos para cada línea celular que se va a probar antes de la pantalla.
  7. Aspirar los medios de cada pocal y reemplazarlo con 500 l de medios de crecimiento completos que contengan puromicina.
    NOTA: Asegúrese de añadir también puromicina a un pozo de control no infectado que se puede utilizar en pasos posteriores para asegurarse de que la selección de puromicina se haya completado.
  8. Incubar las células a 37oC con un 5% deCO2 durante 48 h.
    NOTA: Lo mejor es seleccionar para 48 h, por lo que la densidad de chapado y el título viral deben optimizarse para que las células no sean sobreconfluentes antes de 48 h.
  9. Asegúrese de que las células infectadas estén verdes bajo el microscopio fluorescente, y que las células de un control no infectado estén bien tratadas con puromicina antes de continuar con el paso 4.

4. Células de sembración para la transfección del reportero de doble luciferasa

NOTA: Se debe realizar una prueba de transfección para determinar la densidad de sembrado óptima para cada nueva línea celular.

  1. Intente probar cada pozo desde el paso 3.9 y transfiera aproximadamente 1 x 105 células en pozos en la posición correspondiente en la nueva placa de 24 pocillos de la siguiente manera.
    NOTA: Este protocolo está diseñado para la detección de bibliotecas con cientos de shRNA por lo que no es factible contar todos los pozos de células infectadas. Por lo tanto, los pasos siguientes se utilizaron para estimar los números de celda en cada pozo para ayudar a garantizar aproximadamente la misma densidad de chapado.
    1. Agrupe los pozos del paso 3.9 en 3 - 4 grupos de modo que todos los pozos de un grupo tengan una densidad de celda similar.
    2. Trippsinizar 1 bien representativo de cada grupo con 200 l de trippsina-EDTA (1x PBS complementado con 0,5 mM EDTA y 0,1% de trippsina) durante 5 min a 37 oC. A continuación, neutralice la trippsina-EDTA añadiendo 400 l de puromicina que contenga medios de crecimiento completos.
    3. Cuente bien cada representante para determinar el número total de células y diluir la suspensión celular de cada representante a 2 x 105 células/ml de uso de medios de crecimiento completos.
    4. Semilla 0,5 ml (1 x 105 celdas) de cada pozo desde el paso 4.1.3 en la posición correspondiente en una nueva placa de 24 pocillos e incubar esta nueva placa de 24 pocillos a 37oC con 5%co2 durante 24 horas.
    5. Para cada grupo del paso 4.1.1, utilice el número de celda total determinado en el paso 4.1.3 para calcular el volumen de trippsin-EDTA que se agregará a cada pozo de modo que la suspensión celular resultante sea de 1 x 106 células/ml.
    6. Añadir el volumen adecuado de trippsina-EDTA a cada pocal e incubar durante 5 min a 37 oC.
      NOTA: Para una pantalla más grande, se recomienda que las placas de 24 pocillos se triprinen y se vuelvan a encargar en grupos en lugar de todas a la vez para garantizar la viabilidad de las células.
    7. Durante la incubación anterior, utilice una pipeta multicanal para añadir 400 ml de medios de crecimiento completos que contengan puromicina a los pozos correspondientes en una nueva placa de 24 pocillos.
    8. Transfiera 100 l de suspensión celular (aproximadamente 1 x 105 células) de cada pocal a la posición correspondiente en las nuevas placas de 24 pocillos preparadas en el paso 4.1.7.
    9. Repita los pasos 4.1.6 a 4.1.8 para todas las placas de pozos agrupados del paso 4.1.1, una placa a la vez.
  2. Incubar las células a 37oC con un 5% deCO2 durante 24 h.

5. Transfección del reportero de doble luciferasa

  1. Transfect cada uno bien del paso 4.2 con las construcciones de reportero de doble luciferasa de la siguiente manera.
    NOTA: Antes de iniciar este ensayo, se debe determinar la cantidad total de ADN y la proporción óptima del vector de reportero de luciferasa de luciérnaga para controlar el vector Renilla luciferase. Aquí, se utilizaron 400 ng de una mezcla de ADN que contiene 20 partes de reportero luciferasa luciérnaga y 1 parte de control Renilla luciferase.
    1. Realizar la mezcla de dilución de transfección (tubo A) y la mezcla de dilución de reportero (tubo B) mezclando los volúmenes indicados de cada reactivo(Tabla 1) multiplicados por el número total de transfecciones (más varios adicionales).
      NOTA: Este protocolo está optimizado para el reactivo de transfección 2 (ver Tabla de Materiales). Si se utiliza un reactivo de transfección diferente, el transfecto debe optimizarse antes de este paso.
    2. Mezclar la mezcla de dilución de transfección (Tubo A) con la mezcla de dilución del reportero (Tubo B) e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos para producir la mezcla de transfección.
    3. Durante la incubación anterior, enjuague cada 24 pocillos desde el Paso 4.2 con 0,25 ml de solución salina tampón de fosfato (PBS) y agregue 447 ml de medios de crecimiento completos a cada poca.
    4. Después de la incubación de 15 minutos, utilice una pipeta multicanal para distribuir 53 ml de mezcla de transfección a cada pocal de las placas de 24 pocillos.
  2. Incubar las células a 37oC con un 5% deCO2 durante 24 h.

6. Cuantificación de la actividad de la dual-luciferasa

  1. Mida la actividad de la luciferasa usando un lector de placas y un kit de ensayo de reportero de doble luciferasa como se describe a continuación.
    NOTA: Este protocolo está optimizado para el kit de ensayo de reportero indicado (consulte Tabla de materiales)y sigue el protocolo recomendado por el fabricante.
    1. Preparar suficiente tampón de lisis pasiva 1x para todos los pozos más varios adicionales (se necesitan 75 l por pocto) diluyendo 5 x tampón de lisis pasiva (proporcionado en kit) 1 a 5 con agua desionizada. También se necesita el reactivo de descongelación A y el reactivo B Buffer (proporcionado en el kit, se necesitan 100 ml de cada uno para cada pociembre).
    2. Aspirar los medios de cada pozo de la placa de 24 pocillos del Paso 5.2.
    3. Añadir 75 l de 1x tampón pasivo de lisis a cada poca y incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos con agitación ocasional.
    4. Preparar el reactivo B diluyendo el sustrato B del reactivo 50x (proporcionado en el kit) 1:50 con tampón B del reactivo desalidedo.
    5. Añadir 30 l de 1 x tampón de lisis pasiva a 4 pozos para el vaciado (ver Tabla Suplementaria 2).
    6. Transfiera 30 ml de lisado desde el paso 6.1.3 a pozos duplicados de una placa de ensayo blanca inferior plana de 96 pocillos.
    7. Utilice una pipeta multicanal para añadir 50 ml de reactivo A a cada poca y lea la señal de luciferasa de luciérnaga con un lector de placas.
    8. Utilice una pipeta multicanal para añadir 50 ml de reactivo B del paso 6.1.4 a cada poca y lea la señal de Renilla luciferase con un lector de placas.
  2. Procese los datos sin procesar de la siguiente manera (para obtener una descripción detallada, véase Tabla suplementaria 2).
    1. Excluya las muestras con una señal de Renilla luciferasa muy baja, ya que los valores bajos indican que la construcción viral fue tóxica o que se analizaron muy pocas células transinfectadas.
      NOTA: Como se explica en la discusión, significativamente "baja" señal de Renilla luciferasa puede resultar en resultados anómalos. Aquí, se excluyeron los pozos en los que la señal de Renilla luciferase era más de 1 desviación estándar por debajo de la media (véase el Cuadro Suplementario 2). Esto se basó en estudios previos realizados utilizando este sistema de reportero en estas celdas14,pero puede diferir en otras líneas celulares.
    2. Normalizar el valor de la luciferasa de luciérnaga cruda de cada pocal al valor crudo de Renilla luciferasa del mismo pozo para obtener la relación luciérnaga/Renilla.
    3. Promedio de las relaciones de luciérnaga /Renilla de todos los pozos de control de réplica y luego dividir la relación luciérnaga /Renilla de cada otro pozo por ese número para obtener un cambio de pliegue.
    4. Asigne la muestra de control y establezca su valor de relaciónfirefly/Renilla en 1.
    5. Promedio de las relaciones deluciérnaga/Renilla de los pozos duplicados y traza con la desviación estándar.
      NOTA: La desviación estándar no se utiliza para el análisis estadístico, sino como un medio para identificar pozos donde las réplicas difieren significativamente.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nuestra construcción de reportero YAP/TAZ-TEAD (pGL3-5xMCAT (SV)-492,14,15) contiene un promotor SV-49 mínimo con 5 repeticiones del elemento canónico TEAD binding element (MCAT)15 conduciendo el gen de la luciosa luciérnaga(Figura 1). Se co-tranfectó en células junto con el vector de control PRL-TK (Promega), que expresa Renilla luci...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En este estudio, demostramos un enfoque para la detección de rendimiento medio de bibliotecas virales en conjunto con un ensayo de reportero transcripcional basado en doble luciferasa que se puede utilizar para identificar y probar nuevos reguladores de factores de transcripción. Es fundamental caracterizar y optimizar el sistema de reportero para cada línea celular antes de cualquier pantalla. Se deben realizar experimentos para confirmar que el reportero responde a la actividad alterada del factor de transcripción que ...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nos gustaría dar las gracias a Emily Norton y Mikaelan Cucciarre-Stuligross por ayudar en la preparación de vectores de ARNH. Este trabajo fue apoyado en parte por una beca Susan G. Komen Career Catalyst que otorgó a J.M.L. (#CCR17477184).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Placa de polipropileno de 2,0 ml para pocillos profundos de 96 pocillosUSA Scientific1896-2000Para mini-preparación bacteriana
Tripsina - 2.50%Gibco15090-046Componente de tripsina-EDTA
96 pocillo placa de ensayo blanca de fondo planoCorning3922Para ensayo de luciferasa dual
Ampicilina - 100 mg/mlSigma-Aldrich45-10835242001-EAPara mini-preparación bacteriana
Bacto-triptona - polvoSigma-Aldrich95039Componente del caldo LB
Sistema de ensayo reportero de luciferasa dual, que incluye reactivo LAR II (reactivo A), Stop & Sustrato Glo (sustrato de reactivo B) y Stop & Tampón Glo (tampón reactivo B) - KitPromegaE1960Para el ensayo de luciferasa dual
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco sin rojo/calcio, magnesio y fenol - 9,6 g/LHimediaTS1006Para PBS
EDTA - 0,5 MVWR97061-406Componente de tripsina-EDTA
Etanol - 100%Pharmco-AAPER111000200Para la mini-preparación bacteriana
Fetal Suero bovino - 100%VWR97068-085Componente de un medio de crecimiento completo
Bromuro de hexadimetrina (polibreno) - 8 mg/mlSigma-Aldrich45-H9268Para infección viral
HyClone DMEM/Glucosa alta - 4 mM L-glutamina; 4500 mg/L de glucosa; piruvato de sodioGE Healthcare ciencias de la vidaSH30243.01Componente de medios de crecimiento completos
I3-P/i3 Microplaca multimodo/EADispositivosPara el ensayo de luciferasa dual
L-Glutamina - 200 mMGibco25030-081Componente de un medio de crecimiento completo
Lipofectamine 3000 (Reactivo de transfección 2) - 100%Life technologiesL3000008Para transfecciones
Biología Molecular Agua - 100%VWR02-0201-0500Para la dilución de vectores de shRNA para el empaquetamiento de virus
NaCl - polvoBDHBDH9286Componente del caldo LB
NanoDrop One Microvolumen Espectrofotómetro UV-VisThermo scientificPara medir la concentración de ADN vectorial
Opti-MEM (Tampón de transfección) - 100%Gibco31985-062Para transfecciones
Penicilina Estreptomicina - 10.000 Unidad/ml (Penicilina); 10.000 y micro; g/ml (Estreptomicina)Gibco15140-122Componente de un medio de crecimiento completo
PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit - KitThermo Fisher ScientificK210010Para mini-preparación bacteriana
Puromicina - 2,5 mg/mlSigma-Aldrich45-P7255Para la selección de antibióticos después de una infección
TC20 contador de células automatizadoBio-RadPara el recuento
de célulasX-tremeGENE 9 Reactivo de transfección de ADN (Reactivo de transfección 1) - 100%Roche6365787001Para el empaquetamiento de virus
Extracto de levadura - polvoVWRJ850Componente del caldo LB
P3000 (Reactivo de transfección 3) - 100%Life technologiesL3000008Para transfecciones
moleculares

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chen, K. S., Lim, J. W. C., Richards, L. J., Bunt, J. The convergent roles of the nuclear factor I transcription factors in development and cancer. Cancer Letters. 410, 124-138 (2017).
  2. Lamar, J. M., et al. The Hippo pathway target, YAP, promotes metastasis through its TEAD-interaction domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), E2441-E2450 (2012).
  3. Liu, C. Y., Yu, T., Huang, Y., Cui, L., Hong, W. ETS (E26 transformation-specific) up-regulation of the transcriptional co-activator TAZ promotes cell migration and metastasis in prostate cancer. Journal of Biological Chemistry. 292 (22), 9420-9430 (2017).
  4. Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1: oxygen homeostasis and disease pathophysiology. Trends in Molecular Medicine. 7 (8), 345-350 (2001).
  5. Willmer, T., Cooper, A., Peres, J., Omar, R., Prince, S. The T-Box transcription factor 3 in development and cancer. Bioscience Trends. 11 (3), 254-266 (2017).
  6. Zhu, C., Li, L., Zhao, B. The regulation and function of YAP transcription co-activator. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 47 (1), 16-28 (2015).
  7. Dang, C. V., Reddy, E. P., Shokat, K. M., Soucek, L. Drugging the 'undruggable' cancer targets. Nature Reviews: Cancer. 17 (8), 502-508 (2017).
  8. Fu, V., Plouffe, S. W., Guan, K. L. The Hippo pathway in organ development, homeostasis, and regeneration. Current Opinion in Cell Biology. 49, 99-107 (2017).
  9. Hansen, C. G., Moroishi, T., Guan, K. L. YAP and TAZ: a nexus for Hippo signaling and beyond. Trends in Cell Biology. 25 (9), 499-513 (2015).
  10. Yu, F. X., Zhao, B., Guan, K. L. Hippo Pathway in Organ Size Control, Tissue Homeostasis, and Cancer. Cell. 163 (4), 811-828 (2015).
  11. Warren, J. S. A., Xiao, Y., Lamar, J. M. YAP/TAZ Activation as a Target for Treating Metastatic Cancer. Cancers. 10 (4), (2018).
  12. Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cellular Signalling. 28 (11), 1761-1772 (2016).
  13. Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S. YAP/TAZ at the Roots of Cancer. Cancer Cell. 29 (6), 783-803 (2016).
  14. Lamar, J. M., et al. SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis. Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).
  15. Mahoney, W. M., Hong, J. H., Yaffe, M. B., Farrance, I. K. The transcriptional co-activator TAZ interacts differentially with transcriptional enhancer factor-1 (TEF-1) family members. Biochemical Journal. 388 (Pt 1), 217-225 (2005).
  16. Codelia, V. A., Sun, G., Irvine, K. D. Regulation of YAP by mechanical strain through Jnk and Hippo signaling. Current Biology. 24 (17), 2012-2017 (2014).
  17. Cosset, E., et al. Glut3 Addiction Is a Druggable Vulnerability for a Molecularly Defined Subpopulation of Glioblastoma. Cancer Cell. 32 (6), 856-868 (2017).
  18. de Cristofaro, T., et al. TAZ/WWTR1 is overexpressed in papillary thyroid carcinoma. European Journal of Cancer. 47 (6), 926-933 (2011).
  19. Densham, R. M., et al. MST kinases monitor actin cytoskeletal integrity and signal via c-Jun N-terminal kinase stress-activated kinase to regulate p21Waf1/Cip1 stability. Molecular and Cellular Biology. 29 (24), 6380-6390 (2009).
  20. Eda, H., Aoki, K., Marumo, K., Fujii, K., Ohkawa, K. FGF-2 signaling induces downregulation of TAZ protein in osteoblastic MC3T3-E1 cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 366 (2), 471-475 (2008).
  21. Elbediwy, A., et al. Integrin signalling regulates YAP and TAZ to control skin homeostasis. Development. 143 (10), 1674-1687 (2016).
  22. Enomoto, M., Igaki, T. Src controls tumorigenesis via JNK-dependent regulation of the Hippo pathway in Drosophila. EMBO Reports. 14 (1), 65-72 (2013).
  23. Enomoto, M., Kizawa, D., Ohsawa, S., Igaki, T. JNK signaling is converted from anti- to pro-tumor pathway by Ras-mediated switch of Warts activity. Developmental Biology. 403 (2), 162-171 (2015).
  24. Fan, R., Kim, N. G., Gumbiner, B. M. Regulation of Hippo pathway by mitogenic growth factors via phosphoinositide 3-kinase and phosphoinositide-dependent kinase-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (7), 2569-2574 (2013).
  25. Feng, R., et al. MAPK and Hippo signaling pathways crosstalk via the RAF-1/MST-2 interaction in malignant melanoma. Oncology Reports. 38 (2), 1199-1205 (2017).
  26. Fisher, M. L., et al. Transglutaminase Interaction with alpha6/beta4-Integrin Stimulates YAP1-Dependent DeltaNp63alpha Stabilization and Leads to Enhanced Cancer Stem Cell Survival and Tumor Formation. Cancer Research. 76 (24), 7265-7276 (2016).
  27. Haskins, J. W., Nguyen, D. X., Stern, D. F. Neuregulin 1-activated ERBB4 interacts with YAP to induce Hippo pathway target genes and promote cell migration. Science Signaling. 7 (355), (2014).
  28. Hoeing, K., et al. Presenilin-1 processing of ErbB4 in fetal type II cells is necessary for control of fetal lung maturation. Biochimica et Biophysica Acta. 1813 (3), 480-491 (2011).
  29. Hwang, J. H., et al. Extracellular Matrix Stiffness Regulates Osteogenic Differentiation through MAPK Activation. PloS One. 10 (8), e0135519(2015).
  30. Kaneko, K., Ito, M., Naoe, Y., Lacy-Hulbert, A., Ikeda, K. Integrin alphav in the mechanical response of osteoblast lineage cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 447 (2), 352-357 (2014).
  31. Kim, N. G., Gumbiner, B. M. Adhesion to fibronectin regulates Hippo signaling via the FAK-Src-PI3K pathway. Journal of Cell Biology. 210 (3), 503-515 (2015).
  32. Kuser-Abali, G., Alptekin, A., Cinar, B. Overexpression of MYC and EZH2 cooperates to epigenetically silence MST1 expression. Epigenetics. 9 (4), 634-643 (2014).
  33. Liu, N., et al. HDM2 Promotes NEDDylation of Hepatitis B Virus HBx To Enhance Its Stability and Function. Journal of Virology. 91 (16), (2017).
  34. Liu, X., et al. The EZH2- H3K27me3-DNMT1 complex orchestrates epigenetic silencing of the wwc1 gene, a Hippo/YAP pathway upstream effector, in breast cancer epithelial cells. Cellular Signalling. 51, 243-256 (2018).
  35. Omerovic, J., et al. Ligand-regulated association of ErbB-4 to the transcriptional co-activator YAP65 controls transcription at the nuclear level. Experimental Cell Research. 294 (2), 469-479 (2004).
  36. Pegoraro, S., et al. A novel HMGA1-CCNE2-YAP axis regulates breast cancer aggressiveness. Oncotarget. 6 (22), 19087-19101 (2015).
  37. Xia, H., et al. EGFR-PI3K-PDK1 pathway regulates YAP signaling in hepatocellular carcinoma: the mechanism and its implications in targeted therapy. Cell Death & Disease. 9 (3), 269(2018).
  38. Yan, F., et al. ErbB4 protects against neuronal apoptosis via activation of YAP/PIK3CB signaling pathway in a rat model of subarachnoid hemorrhage. Experimental Neurology. 297, 92-100 (2017).
  39. Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
  40. Bonilla, X., et al. Genomic analysis identifies new drivers and progression pathways in skin basal cell carcinoma. Nature Genetics. 48 (4), 398-406 (2016).
  41. Enger, T. B., et al. The Hippo signaling pathway is required for salivary gland development and its dysregulation is associated with Sjogren's syndrome. Laboratory Investigation. 93 (11), 1203-1218 (2013).
  42. Fausti, F., et al. ATM kinase enables the functional axis of YAP, PML and p53 to ameliorate loss of Werner protein-mediated oncogenic senescence. Cell Death and Differentiation. 20 (11), 1498-1509 (2013).
  43. He, J., et al. Positive regulation of TAZ expression by EBV-LMP1 contributes to cell proliferation and epithelial-mesenchymal transition in nasopharyngeal carcinoma. Oncotarget. 8 (32), 52333-52344 (2017).
  44. Huang, W., et al. The N-terminal phosphodegron targets TAZ/WWTR1 protein for SCFbeta-TrCP-dependent degradation in response to phosphatidylinositol 3-kinase inhibition. Journal of Biological Chemistry. 287 (31), 26245-26253 (2012).
  45. Imada, S., et al. Role of Src Family Kinases in Regulation of Intestinal Epithelial Homeostasis. Molecular and Cellular Biology. 36 (22), 2811-2823 (2016).
  46. Kim, N. G., Koh, E., Chen, X., Gumbiner, B. M. E-cadherin mediates contact inhibition of proliferation through Hippo signaling-pathway components. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (29), 11930-11935 (2011).
  47. Lai, J. K. H., et al. The Hippo pathway effector Wwtr1 regulates cardiac wall maturation in zebrafish. Development. 145 (10), (2018).
  48. Li, H., Gumbiner, B. M. Deregulation of the Hippo pathway in mouse mammary stem cells promotes mammary tumorigenesis. Mammalian Genome. 27 (11-12), 556-564 (2016).
  49. Pefani, D. E., O'Neill, E. Hippo pathway and protection of genome stability in response to DNA damage. The FEBS Journal. 283 (8), 1392-1403 (2016).
  50. Serrano, I., McDonald, P. C., Lock, F., Muller, W. J., Dedhar, S. Inactivation of the Hippo tumour suppressor pathway by integrin-linked kinase. Nature Communications. 4, 2976(2013).
  51. Vlug, E. J., et al. Nuclear localization of the transcriptional coactivator YAP is associated with invasive lobular breast cancer. Cellular Oncology (Dordrecht). 36 (5), 375-384 (2013).
  52. Xie, Q., et al. YAP/TEAD-mediated transcription controls cellular senescence. Cancer Research. 73 (12), 3615-3624 (2013).
  53. Yee, K. S., et al. A RASSF1A polymorphism restricts p53/p73 activation and associates with poor survival and accelerated age of onset of soft tissue sarcoma. Cancer Research. 72 (9), 2206-2217 (2012).
  54. Zhou, Z., et al. Oncogenic Kinase-Induced PKM2 Tyrosine 105 Phosphorylation Converts Nononcogenic PKM2 to a Tumor Promoter and Induces Cancer Stem-like Cells. Cancer Research. 78 (9), 2248-2261 (2018).
  55. Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay. Journal of Visualized Experiments. (88), (2014).

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