Artículo de método

Combinación de microdisección de captura láser y qPCR microfluídico para analizar perfiles transcripcionales de células únicas: un enfoque de biología de sistemas para la dependencia de opioides

DOI:

10.3791/60612

⸱

8 de marzo de 2020

 ,  ,  ,  , 
1Daniel Baugh Institute for Functional Genomics and Computational Biology, Department of Pathology, Anatomy, and Cell Biology, Thomas Jefferson University, 2Sidney Kimmel Medical College, Thomas Jefferson University, 3Department of Pharmacology & Physiology, Drexel University College of Medicine

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo explica cómo recoger neuronas individuales, microglia y astrocitos del núcleo central de la amígdala con alta precisión y especificidad anatómica utilizando microdisección de captura láser. Además, explicamos nuestro uso de RT-qPCR microfluídico para medir un subconjunto del transcriptoma de estas células.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La heterogeneidad transcripcional profunda en células individuales anatómicamente adyacentes sugiere que la funcionalidad sólida del tejido puede lograrse mediante la diversidad de fenotipos celulares. Experimentos de una sola célula que investigan la dinámica de la red de los sistemas biológicos demuestran respuestas celulares y tisulares a diversas condiciones a una resolución biológicamente significativa. En este documento, explicamos nuestros métodos para recopilar células individuales de ubicaciones anatómicamente específicas y medir con precisión un subconjunto de sus perfiles de expresión génica. Combinamos la microdisección de captura láser (LCM) con reacciones en cadena cuantitativas de la polimerasa de transcripción inversa microfluídica (RT-qPCR). También utilizamos esta plataforma microfluídica RT-qPCR para medir la abundancia microbiana de contenido intestinal.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La medición de los perfiles de expresión génica de células individuales ha demostrado una extensa heterogeneidad fenotípica dentro de un tejido. Esta complejidad ha complicado nuestra comprensión de las redes biológicas que gobiernan la función del tejido. Nuestro grupo y otros han explorado este fenómeno en muchos tejidos y condiciones1,2,3,4,5,6. Estos experimentos no sólo sugieren que la regulación de las redes de expresión génica subyace a tal heterogeneidad, sino tamb....

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con las recomendaciones del Comité de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Thomas Jefferson y la Facultad de Medicina de la Universidad de Drexel. El protocolo fue aprobado por la Universidad Thomas Jefferson y el Colegio de Medicina de la Universidad de Drexel IACUC.

1. Modelo animal

  1. Inserte dos pellets de sulfato de morfina de liberación lenta de 75 mg o dos pellets de placebo por vía subcutánea en ratas macho adultas de Sprague-Dawley.
    1. Use una bata y guantes apropiadamente para una cirugía estéril menor. Afeite el dorsum de rata con pinzas si es necesario.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La selección de las células individuales se validó tanto visual como molecularmente. Visualmente, la morfología celular fue vista antes de la recolección celular. Las células recogidas fueron vistas en la estación de control de calidad y la mancha de núcleos celulares (DAPI) se superpuso con el marcador de selección de una sola célula fluorescencia. La Figura 2A muestra imágenes representativas de una diapositiva con cerebro de rata hemisecti.......

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La biología de una sola célula ha demostrado la heterogeneidad de los fenotipos celulares y la robustez de la función tisular. Estos hallazgos han proporcionado información sobre la organización de sistemas biológicos tanto a escala macro como a microescala. Aquí, describimos la combinación de dos métodos, LCM y qPCR microfluídico, para obtener medidas de transcriptoma de una sola célula que proporcionen especificidad anatómica y precisión transcripcional a un costo relativamente bajo(Figura 1

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El trabajo presentado aquí fue financiado a través de NIH HLB U01 HL133360 otorgado a JS y RV, NIDA R21 DA036372 otorgado a JS y EVB, y T32 AA-007463 otorgado a Jan Hoek en apoyo de SJO'S.

....

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
20X Fluido de colorante de unión al ADNIGM100-7609NA
2x GE Ensayo Reactivo de cargaFluidigm85000802-RNA
48.48 Dynamic Array IFC para expresión génicaFluidigmBMK-M-48.48NA
96.96 Dynamic Array IFC para expresión génicaFluidigmBMK-M-96.96NA
anti-CD11β AnticuerpoGenway BiotechCCEC48Tinción de microglía
Anticuerpo anti-NeuN, clon A60EMD MilliporeMAB377Tinción neuronal
ArcturusXT Sistema de microdisección de captura láser ArcturusNA NA
Biomark HDFluidigmNAPlataforma RT-qPCR
Antígeno sérico bovinoSigma-AldrichB4287
CapSure Macro LCM CapsThermoFisher ScientificLCM0211NA
CellDirect qRT-PCR de un solo paso ThermoFisherScientific11753500Lysis Componentes de la solución tampón
DAPIThermoFisher Scientific62248Nucleus Stain
ADN Suspension BufferTEKnovaT0221
Exonucleasa INew Englnad BioLabs, Inc.M0293SNA
ExtracSure Dispositivo de extracción de muestrasThermoFisher ScientificLCM0208NA
Fisherbrand Superfrost Plus Portaobjetos de microscopioThermoFisher Scientific22-037-246Portaobjetos de vidrio liso
GeneAmp Tubo de reacción de pared delgadaThermoFisher ScientificN8010611
GFAP Anticuerpo monoclonalThermoFisher ScientificA-21294Tinción de astrocitos
de cabra anti-ratón IgG (H+L), superclonal™ Anticuerpo secundario recombinante, Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA28175Seconadry Anticuerpo
IFC ControllerFluidigmNANA
RNaseOutThermoFisher Scientific10777019
SsoFast EvaGreen Supermix con bajo RoxBio-RadPN 172-5211Rox
master mix SuperScript VILO Kit de síntesis de ADNcThermoFisher Scientific11754250contiene la proteína VILO y SuperScript
T4 gene 32 NewEnglnad BioLabs, Inc.M0300SNA
TaqMan PreAmp Master MixThermoFisher Scientific4391128NA
TE BufferTEKnovaT0225NA

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Park, J., et al. Inputs drive cell phenotype variability. Genome Research. 24, 930-941 (2014).
  2. Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single ....

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

An lisis de c lula nicaperfil transcripcionaln cleo central de la am gdalaexpresi n g nicaRT PCR microflu dicaaislamiento celularseccionamiento de tejidos

Artículos relacionados