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Artículo de método

Evaluación de la cicatrización aguda de heridas utilizando los modelos de esponja de alcohol de polivinilo subcutáneo dorsal y modelos de herida sin piel de cola excisional.

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DOI:

10.3791/60653

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25 de marzo de 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Microbiology & Immunology, Brown University, 2Division of Surgical Research, Department of Surgery, Rhode Island Hospital and The Warren Alpert School of Medicine of Brown University

En este artículo

Resumen

Aquí, se describen dos modelos de cicatrización de heridas murinas, uno diseñado para evaluar las respuestas de cicatrización de heridas celulares y citoquinas y el otro para cuantificar la tasa de cierre de heridas. Estos métodos se pueden utilizar con modelos de enfermedades complejas como la diabetes para determinar los mecanismos de varios aspectos de la cicatrización deficiente de heridas.

Resumen

La cicatrización de heridas es un proceso complejo que requiere la progresión ordenada de la inflamación, la formación de tejido de granulación, la fibrosis y la resolución. Los modelos murinos proporcionan una valiosa visión mecanicista de estos procesos; sin embargo, ningún modelo solo aborda completamente todos los aspectos de la respuesta de cicatrización de heridas. En su lugar, es ideal utilizar varios modelos para abordar los diferentes aspectos de la cicatrización de heridas. Aquí, se describen dos métodos diferentes que abordan diversos aspectos de la respuesta de cicatrización de heridas. En el primer modelo, las esponjas de alcohol polivinílico se implantan por vía subcutánea a lo largo del dorso del ratón. Después de la recuperación de la esponja, las células pueden ser aisladas por interrupción mecánica, y los fluidos se pueden extraer por centrifugación, lo que permite una caracterización detallada de las respuestas celulares y de citoquinas en el ambiente agudo de la herida. Una limitación de este modelo es la incapacidad de evaluar la tasa de cierre de la herida. Para ello, se utiliza un modelo de escisión de la piel de la cola. En este modelo, una pieza rectangular de 10 mm x 3 mm de piel de cola se extirpada a lo largo de la superficie dorsal, cerca de la base de la cola. Este modelo se puede fotografiar fácilmente para el análisis planimétrico para determinar las tasas de curación y se puede extirpar para el análisis histológico. Ambos métodos descritos se pueden utilizar en cepas de ratón genéticamente alteradas, o en combinación con modelos de condiciones comorbilidades, como diabetes, envejecimiento o infección secundaria, con el fin de dilucidar los mecanismos de cicatrización de heridas.

Introducción

Hay muchos sistemas de modelos murinos disponibles para examinar los procesos de cicatrización de heridas, cada uno posee ventajas y limitaciones específicas1,,2. Los siguientes métodos presentan dos modelos de heridas murinas, cada uno de los cuales aborda un aspecto particular de la respuesta de cicatrización de heridas, y que se pueden utilizar para identificar la causa y el efecto de las perturbaciones en la respuesta a la lesión. El proceso de cicatrización de heridas ocurre en fases distintas. La primera fase es inflamatoria, caracterizada por la rápida afluencia de plaquetas, neutrófilos y monocitos/macrófagos, así como la producción de citoquinas proinflamatorias y quimioquinas. Tras la resolución de la inflamación, el medio ambiente pasa a un estado más reparador con la inducción de citoquinas y factores de crecimiento profisóxicos y proangiogénicos. El tejido de granulación se deposita y los neovasculares se forman con la migración de miofibroblastos, fibroblastos, células epiteliales y células endoteliales. En las etapas finales, se remodela la matriz extracelular provisional, y la formación de cicatrices y el cierre de la herida procede2,3,4,5,6,7,8.

Ningún modelo murino proporciona un sistema para estudiar todas las etapas de la cicatrización de heridas2. Aquí, se describen dos modelos quirúrgicos de heridas: uno aclara las respuestas agudas de cicatrización celular y citoquina, y el otro permite la evaluación del cierre de la herida, así como análisis histológicos. Estos dos métodos pueden emplearse de manera complementaria para evaluar los efectos de una perturbación o comorbilidad en diferentes aspectos de la respuesta de cicatrización de heridas. La implantación dorsal subcutánea de esponjas de alcohol polivinílico (PVA) es un sistema que se ha utilizado en modelos de roedores durante décadas para esclarecer numerosos aspectos de las respuestas celulares y granulados de tejidos9,,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 ,21,22,23,24. Este enfoque permite la recuperación de líquidos de heridas ricos en citoquinas e infiltrados celulares. En este modelo, 1 cm x 1 cm x 0,5 cm trozos de esponja PVA se colocan en bolsillos subcutáneos a través de una incisión de 2 cm realizada en la línea media dorsal posterior. La incisión se cierra con clips quirúrgicos, y las esponjas se pueden recuperar en puntos de tiempo posteriores para el aislamiento celular y fluido. El ambiente celular y citoquina de las esponjas aisladas refleja las etapas normales de la cicatrización aguda de heridas hasta unos 14 días después de la implantación. En los puntos de tiempo posteriores el modelo es más ventajoso para el estudio de la formación de tejido de granulación y la respuesta del cuerpo extraño1. Con este sistema, es posible aislar >106 células, lo que ofrece una clara ventaja para ensayos fenotípicos y funcionales y aislamiento de ARN, sobre células de aislamiento de otros métodos basados en biopsias1,22,23,25,26.

La tasa de cierre de la herida se determina utilizando el modelo de escisión de la piel de la cola. En este modelo, como se describe inicialmente por Falanga et al. e informado por otros27,28,29,30, una sección de espesor completo de 1 cm x 0,3 cm de la piel de la cola se elimina cerca de la base de la cola. El área de la herida se visualiza fácilmente y se puede medir con el tiempo. Alternativamente, el tejido de la cola se puede aislar para el análisis histológico. Este enfoque se puede utilizar como una alternativa o en conjunto con el método de biopsia de punzonado dorsal bien establecido. Las principales distinciones entre estos dos modelos son la tasa de cierre de2la herida, la presencia o ausencia de piel, y la estructura de la piel2,31,,32. Las heridas de la piel de la cola ofrecen un plazo más largo para evaluar el cierre de la herida, ya que se necesitan aproximadamente 21 días para que se produzca un cierre completo. Esto se opone a las biopsias de punzón dorsal sin esplinar, que sanan mucho más rápido (7-10 días), principalmente por contracción debido a la acción del panniculus carnosus. Las biopsias de punzón dorsal astillado sanan más lentamente y disminuyen los efectos de la curación contráctela, pero dependen de la presencia de un cuerpo extraño para restringir los mecanismos basados en contrámenes1,,2,27,30,31,33.

Los modelos de heridas descritos son informativos para entender los procesos normales de cicatrización de heridas en ausencia de perturbación. Mientras que la curación de la piel de los roedores difiere de maneras muy significativas de la piel humana, incluyendo la estructura suelta, la dependencia de la curación contráctea, y otras diferencias anatómicas, el sistema murino ofrece ciertas ventajas para los estudios mecanicistas y de cribado. El principal de ellos es la disponibilidad de cepas endogámicas y mutantes genéticos, la tractabilidad genética y un menor costo. La visión mecanicista obtenida de los estudios murinos se puede traducir a modelos animales complejos que imitan más de cerca la cicatrización de la piel humana, como el sistema porcino2,,31.

Además de examinar las respuestas de cicatrización de heridas en el estado estacionario, estos modelos se pueden combinar con condiciones comorbilidades para entender la base de los defectos de cicatrización de heridas a nivel celular, citoquina y tejido bruto. Es en este entorno particular que los dos modelos se pueden utilizar en concierto para evaluar los efectos de una condición comorbilidad particular, como la neumonía postoperatoria, tanto en la respuesta de cicatrización de heridas celulares agudas como en la tasa de cierre de la herida30.

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Protocolo

Todos los estudios en animales descritos aquí fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Brown y llevados a cabo de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de los Institutos Nacionales de Salud.  NOTA: en el vídeo, la cortina quirúrgica se ha omitido con fines de demostración.

1. Implantación subcutánea de esponjas de PVA

  1. Utilice tijeras para cortar láminas de esponja PVA en piezas de 8 mm x 8 mm x 4 mm. Rehidrata los trozos de esponja de PVA sumergiéndolas en 1pbS estéril en un vaso de precipitados.
  2. Autoclave las esponjas en 1x PBS para esterilizar, y enfriar completamente. Almacene las esponjas autoclavedas en 1pbS estéril a 4 oC.
  3. Antes de realizar la implantación quirúrgica, alícuota el número necesario de esponjas en un plato de cultivo estéril en condiciones estériles en una campana de flujo laminar. Almacene las esponjas adicionales en 1pbS estéril a 4 oC para su uso futuro. Asegúrese de que las esponjas se hinchan hasta 1 cm x 1 cm x 0,5 cm después de la rehidratación. En la Figura 1Ase muestra una imagen de las esponjas de PVA deshidratadas.
    NOTA: Para mantener la esterilidad del sitio quirúrgico, el procedimiento de implantación de la esponja PVA requiere que una persona manipule el ratón y prepare el sitio quirúrgico, y una segunda persona para realizar la implantación.
  4. Anestetizar un ratón C57BL/6J masculino de 8–12 semanas de edad por inyección intraperitoneal de 80 mg/kg de ketamina. Administrar 40 mg/kg de xilazina intraperitonealmente para analgesia.  Confirmar la profundidad de la anestesia por la pérdida de un reflejo del pedal. Preparar el sitio quirúrgico quitando el cabello a lo largo del dorso con cortadores. Usando gasa estéril, aplique la solución de povidona-yodo en el área de afeitado 2x, seguido de 70% de etanol.
  5. Coloque el ratón sobre cortinas quirúrgicas estériles. Coloque una almohadilla calentada debajo de las cortinas quirúrgicas para mantener la temperatura del núcleo del ratón.
  6. Use guantes quirúrgicos estériles para realizar la cirugía. Tire de la piel dorsal lejos del tejido subyacente con fórceps, y usando tijeras quirúrgicas estériles, haga una incisión de 2 cm a lo largo de la línea media dorsal aproximadamente 2 cm antes de la base de la cola. Mientras mantiene la incisión abierta con fórceps estériles, utilice tijeras quirúrgicas curvas estériles con puntas romas para formar un bolsillo subcutáneo a lo largo del dorso en una de las posiciones indicadas en la Figura 1B.
  7. Continúe usando fórceps para levantar la piel del tejido subyacente. Usando tijeras quirúrgicas estériles, apriete suavemente una esponja de PVA en el plato de cultivo para eliminar el exceso de PBS. Recoger la esponja PVA por una esquina usando tijeras quirúrgicas estériles y, llevando con la esquina sostenida por las tijeras, colocar la esponja en el bolsillo subcutáneo formado en el paso 1.4.
  8. Repita este proceso 5x, colocando un total de seis esponjas en bolsillos subcutáneos como se muestra en la Figura 1B.
  9. Pellizque la piel dorsal incisa junto con fórceps estériles y cierre la incisión con dos clips de herida de acero inoxidable.
  10. Utilice un nuevo conjunto de instrumentos quirúrgicos estériles para cada ratón. Alternativamente, utilice un esterilizador de cuentas para esterilizar instrumentos entre ratones.

2. Aislamiento de líquidos de esponjas DE PVA

  1. Para evaluar el ambiente agudo de citoquinas de la herida, aísle las esponjas entre 1-14 días después de la implantación.
  2. Preparar un tubo de recogida de fluidos anidando el barril de una jeringa de 5 ml en un tubo de cultivo de 16 ml.
  3. Euthanizar un ratón con esponjas de PVA implantadas por asfixia porCO2 seguida de luxación cervical.
  4. Retire las grapas quirúrgicas y abra la incisión con fórceps dentados. Utilice tijeras para extender la incisión a lo largo de la línea media dorsal.
  5. Usando fórceps, extraiga una esponja de su bolsillo subcutáneo y transfiérala al barril de jeringa preparado, teniendo cuidado de minimizar la presión a la esponja. Desasocie cualquier tejido conectivo que quede adherido a la superficie de la esponja. Use tijeras para diseccionar la esponja del tejido circundante si es necesario. Repita el proceso de eliminación de esponjas con las esponjas restantes. Coloque el tubo que contiene las esponjas sobre hielo.
  6. Para aislar el líquido de la herida, centrifugar el tubo de cultivo que contiene la jeringa de 5 ml con las esponjas a 700 x g durante 10 min.
  7. Después de la centrifugación, deseche la jeringa y las esponjas. El líquido de la herida se habrá acumulado en el tubo de cultivo de 16 ml. En la Figura 1Dse muestra una imagen representativa del líquido recogido de una herida del día 7. Transfiera el líquido de la herida a un tubo limpio para un almacenamiento a largo plazo a -80 oC.

3. Aislamiento de células de esponjas PVA

  1. Para evaluar el ambiente celular de cicatrización aguda de heridas, recoja las esponjas entre 1-14 días después de la implantación de la esponja. Las esponjas obtenidas de una herida 7 días después de la implantación se muestran en la Figura 1E.
  2. Prepare un medio de recolección que contenga 1 x HBSS (+calcio/+magnesio/rojo fenol) complementado con 1% de FBS, 1% de HEPES y 1% de penicilina-estreptomicina.
  3. Aliquot 5 mL de medio de recogida HBSS en un tubo cónico de 15 ml.
  4. Extraiga las esponjas de PVA de ratones eutanizados como se describe en 2.2–2.4. Coloque las esponjas en el tubo cónico que contiene 5 ml de medio de recogida de HBSS.
  5. Transfiera las esponjas y el medio de recogida HBSS a una bolsa de licuadora de 80 ml vertiendo. Cuelgue la bolsa de la licuadora de la escotilla de la licuadora de paletas, colocada de modo que las paletas golpeen las esponjas y los medios. Ajuste los ajustes de la licuadora de paletas para que funcionen en alto durante 60 s. Pulse inicio.
  6. Transfiera el medio de la bolsa de la licuadora de nuevo al tubo cónico de 15 ml con una pipeta, dejando las esponjas en la bolsa. Apriete las esponjas para liberar completamente los medios. Ajuste los ajustes de la licuadora de paletas para que funcionen durante 30 s en alto. Añadir 5 ml de medios a la bolsa de la licuadora y repetir el proceso de estómago 2x para un total de tres lavados de esponja.
  7. Centrifugar el tubo cónico a 250 x g durante 5 min. Un gránulo rojo de células y glóbulos rojos será visible en la parte inferior del tubo cónico después de la centrifugación.
  8. Deseche el sobrenadante y realice una lisis de glóbulos rojos: agregue 900 éL de dH2O al pellet celular y a la pipeta para mezclar. Neutralizar con 100 s de 10x PBS. Añadir 4 ml de 1x PBS al tubo para neutralizar completamente la lisis, luego centrifugar a 250 x g durante 5 min.
    NOTA: El paso de lisis debe ser breve; dejar el agua en contacto con las células durante más de 3-5 s podría resultar en lisis de glóbulos no rojos.
  9. Después de la centrifugación, un pellet de células blancas que contiene células de la herida desprovistas de glóbulos rojos estará presente en la parte inferior del tubo cónico. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en el medio deseado para los análisis posteriores.

4. Análisis opcional de citometría de flujo de leucocitos innatos aislados de heridas de esponja de PVA

  1. Resuspenda 0,5–1 x 106 células de la herida en 25 ml de una solución de bloqueo de 2 x que contenga 10 ég/ml anti-CD16/CD32 Anticuerpo FcR-II/III diluido en 1x PBS + 1% De BSA.
    NOTA: Todos los anticuerpos deben ser valorados para determinar las concentraciones óptimas para el análisis de citometría de flujo.
  2. Incubar las células con anticuerpos de bloqueo durante 10 minutos sobre hielo.
  3. Hacer una mezcla maestra 2 de anticuerpos que contengan 2,5 mg/ml de PerCP-eFluor710-Ly6G, 5 mg/ml de FITC-Ly6C, APC-Fire750-CD45.2, APC-R700-Siglec-F y 10 mg/ml de eFluor660-F4-80 diluido en 1x PBS + 1% BSA. Añadir directamente 25 l del cóctel de anticuerpos a las células que se incuban en el bloqueo de anticuerpos.
  4. Incubar las células durante 20 minutos sobre hielo, protegidas de la luz.
  5. Lavar las células 2veces con 1x PBS.
  6. Hacer una mezcla maestra de amina-reactiva reactiva de viabilidad fijable tinte-eFluor506 diluido 1:1,000 en 1x PBS. Resuspenda el gránulo celular en 50 ml de la solución de colorante de viabilidad.
    NOTA: El suero debe excluirse del paso de viabilidad fijable, ya que evitará la unión del tinte a las proteínas endógenas. Incubar las células durante 20 minutos sobre hielo, protegidas de la luz.
  7. Lavar las células 2veces con 1x PBS. Resuspenda el gránulo celular en 50 s de 1% de paraformaldehído.
  8. Incubar las células con 1% de paraformaldehído durante 15 minutos sobre hielo, protegidos de la luz.
  9. Lavar las células 1x con 1x PBS y resuspender el pellet en 1x PBS para el análisis citométrico de flujo.

5. Escisión de la piel de la cola

  1. Anestetizar un ratón C57BL/6J masculino de 8–12 semanas de edad por inyección intraperitoneal de 80 mg/kg de ketamina. Administrar 40 mg/kg de xilazina intraperitonealmente para analgesia. Confirmar la profundidad de la anestesia por la pérdida de un reflejo del pedal.
  2. Preparar el sitio quirúrgico en la cola del ratón anestesiado mediante el uso de gasa estéril para aplicar la solución de povidona-yodo 2x, seguido de una aplicación de 70% de etanol.
  3. Defina una sección de 10 mm x 3 mm en la superficie dorsal de la cola, a 10 mm de la base de la cola(Figura 1C)utilizando un marcador permanente para trazar desde una plantilla prefabricada.
  4. Coloque el ratón anestesiado en cortinas quirúrgicas estériles.
  5. Use guantes quirúrgicos estériles para realizar los procedimientos quirúrgicos. Con una cuchilla de bisturí estéril, haga una incisión de espesor completo a lo largo de los bordes derecho, inferior e izquierdo del área de la herida.
  6. Usando fórceps estériles, despega la piel extirpada lejos de la cola, y usa tijeras quirúrgicas estériles para cortar el borde superior del área de la herida.
  7. Aplique presión con gasa estéril para detener el sangrado.
  8. Aplique una película de barrera de pulverización en el lecho de la herida.
  9. Fotografíe las heridas a una distancia fija a intervalos de tiempo regulares. Analice las fotografías mediante análisis planimétrico para determinar las mediciones del área de la herida. Alternativamente, utilice pinzas para obtener medidas de longitud y anchura de la herida.

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Resultados

Respuesta inflamatoria sistémica tras la implantación de la esponja de PVA
La cirugía de implantación de esponja PVA generó una respuesta inflamatoria sistémica, como lo demuestra la inducción de IL-6 en el plasma 1 día después de la herida(Figura 2A). Otras citoquinas proinflamatorias, incluyendo TNF-o e IL-1, así como una serie de quimioquinas incluyendo CCL2 y CXCL1 fueron inducidas sistémicamente en los primeros 7 días después de la implantación de la esponja DE PVA, ...

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Discusión

Este artículo describe dos modelos de heridas murinas tractables que permiten la evaluación de la respuesta aguda de cicatrización de heridas. El primer método consiste en la implantación quirúrgica de esponjas de PVA en el espacio subcutáneo dorsal. Este enfoque ofrece una clara ventaja sobre los modelos de heridas basadas en biopsias para estudiar la respuesta de cicatrización de heridas celulares debido al gran número de células y la cantidad de líquidos de la herida obtenidos de las esponjas aisladas. Para la ejecuci...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores quieren agradecer a Kevin Carlson, de la Citometría de Flujo de la Universidad Brown y del Centro de Clasificación, la consulta y la asistencia con los experimentos de citometría de flujo. Las imágenes de las figuras 1B y C se crearon con BioRender. Kayla Lee y Gregory Serpa son agradecidos por su asistencia fotográfica. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los siguientes: Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) YFAA15 D15AP00100, Dean's Areas of Emerging New Science Award (Brown University), National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) 1R01HL126887-01A1, Instituto Nacional de Ciencias Ambientales (NIES) T32-ES7272 (Formación en Patología Ambiental), y el Premio Semilla de Investigación de la Universidad Brown.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
10x Tubos de centrífuga de 15 mL de solución salina tamponada con fosfatoFisher ScientificBP3991
OlympusGenesee28-103
1x HBSS (+Calcio, +Magnesio, – Rojo de fenol)ThermoFisher Scientific14025076
5ml JeringaBD309646
Anti-ratón CD45.2-APC Fire750BioLegend109852Clon 104
Anti-ratón F4/80-eFluor660ThermoFisher Scientific50-4801-82Clon BM8
Antiratón Ly6C-FITCBD Biosciences553104Clon AL-21
Anti-ratón Ly6G-PerCP-eFluor710ThermoFisher Scientific46-9668-82Clon 1A8-Ly6g
Anti-ratón Siglec-F-APC-R700BD Biosciences565183Clon E50-2440
Autoclip Aplicador de clips de acero inoxidableBraintree ScientificNC9021392
Autoclip de acero inoxidable, 9 mmBraintree Scientific NC9334081
Bolsa mezcladora, 80 mlFisher Scientific14258201
, 16 ml, 17x100Genesee Scientific21-130
- EstándarThermoFisher Scientific10437028
Tinte de viabilidad fijable eFluor506ThermoFisher Scientific65-0866-14
Solución para hepes, 1MGenesee Scientific25-534
ImageJ SoftwareNIH
Penicilina-estreptomicina (5000 U/mL)ThermoFisher Scientific15070-063
Esponja de alcohol polivinílico - tamaño de poro grandeIvalon/PVA Unlimitedwww.sponge-pva.com
Povidona solución de yodo, 10%Fisher Scientific3955-16
Película de barrera contra pulverización, Cavilon3M3346E
Stomacher 80 Biomaster, 110VSeward0080/000/AJ
, Autoclip Tubo de cultivo Suero fetal bovino

Referencias

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