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Artículo de método

Preparación de SNS Cobalt(II) Pincer Model Complexes of Liver Alcohol Dehydrogenase

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DOI:

10.3791/60668

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19 de marzo de 2020

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1Department of Chemistry and Biochemistry, Fairfield University, 2Department of Chemistry, Keene State College

En este artículo

Resumen

Aquí se presenta la preparación de los complejos modelo de pinza SNS(II) de alcohol deshidrogenasa hepática. Los complejos se pueden preparar reaccionando el precursor de ligando con CoCl2s 6H2O y luego se pueden recristalizar permitiendo que el éter de dietil se difunda lentamente en una solución de acetonitrilo que contiene el complejo de cobalto.

Resumen

Los complejos de modelos químicos están preparados para representar el sitio activo de una enzima. En este protocolo, una familia de precursores de ligando de pinza tridentato (cada uno posee dos funcionalidades de átomo de donante de azufre y un nitrógeno (SNS) y se basa en compuestos de bis-imidazol o bis-triazol) se metalizan con CoCl2s 6H2O para permitir complejos tridentatos de cobalto pinza SNS(II). La preparación de los complejos modelo cobalto(II) para el alcohol hepático deshidrogenasa es fácil. Basado en un cambio de color rápido al agregar el CoCl2s 6H2O a la solución de acetonitrilo que contiene el precursor de ligando, las formas complejas rápidamente. La formación del complejo metálico se completa después de permitir que la solución se refluya durante la noche. Estos complejos de cobalto (II) sirven como modelos para el sitio activo de zinc en alcohol deshidrogenasa hepática (LADH). Los complejos se caracterizan utilizando difracción de rayos X de cristal único, espectrometría de masas de electrospray, espectroscopia visible ultravioleta y análisis elemental. Para determinar con precisión la estructura del complejo, se debe determinar su estructura cristalina única. Los cristales individuales de los complejos que son adecuados para la difracción de rayos X se cultivan a través de la difusión lenta de vapor de éter dietílico en una solución de acetonitrilo que contiene el complejo cobalto(II). Para cristales de alta calidad, la recristalización normalmente tiene lugar durante un período de 1 semana, o más. El método se puede aplicar a la preparación de otros complejos de coordinación modelo y se puede utilizar en laboratorios de enseñanza de grado. Finalmente, se cree que otros pueden encontrar este método de recristalización para obtener cristales únicos beneficiosos para su investigación.

Introducción

El propósito del método presentado es preparar análogos de moléculas pequeñas de LADH para comprender mejor la actividad catalítica de las metalózimas. LADH es una enzima dimerica que contiene un dominio de unión a cofactores y undominiocatalítico que contiene zinc(II) 1 . LADH, en presencia de cofactor NADH, puede reducir cetonas y aldehídos a sus respectivos derivados del alcohol2. En presencia de NAD+, LADH puede realizar catálisis inversa de oxidación de alcoholes a cetonas y aldehídos2. La estructura cristalina del sitio activo de LADH muestra que su centro metálico de zinc (II) está unido a un átomo de nitrógeno, proporcionado por una cadena lateral de histidina y dos átomos de azufre y ofrecido por dos ligandos de cisteína3. Investigaciones posteriores han demostrado que el centro de metal de zinc está ligado con una molécula de agua lábil, lo que resulta en geometría pseudo-tetraédrica alrededor del centro metálico4.

Hemos informado y utilizado previamente precursores de ligando pinza SNS, así como metalizado los precursores de ligando con ZnCl2 para formar complejos Zn(II) que contienen el precursor de ligando tridentato5,6,7. Estos precursores de ligandose se muestran en la Figura 1. Estos complejos de zinc(II) mostraron actividad para la reducción estequiométrica de los aldehídos pobres en electrones y, por lo tanto, son complejos modelo para LADH. Posteriormente, se han notificado la síntesis y caracterización de una serie de complejos de cobre(I) y cobre(II) que contienen precursores de ligando SNS8,9,10.

Aunque LADH es una enzima zinc (II), estamos interesados en preparar complejos modelo de cobalto (II) de LADH con el fin de obtener más información espectroscópica sobre los análogos de cobalto (II) de LADH. Los complejos cobalto(II) son de color, mientras que los complejos de zinc(II) son blanquecinos. Dado que los complejos de cobalto (II) están coloreados, también se pueden obtener espectros ultravioleta visibles de los complejos, en los que también se puede recopilar información sobre la fuerza del campo de ligandoen en los complejos de cobalto(II). Mediante el uso de información de cálculos gaussianos y los espectros visibles ultravioletas obtenidos experimentalmente, se puede deducir información sobre la fuerza del campo de ligando. El cobalto (II) es un buen sustituto del zinc (II), ya que ambos iones tienen radios iónicos similares y acidezes Lewis similares11,12.

El método presentado consiste en sintetizar y caracterizar complejos de modelos para intentar imitar el comportamiento catalítico natural de LADH5,,6. Anteriormente hemos metalizado una familia de ligandos precursores con ZnCl2 para formar complejos modelo de zinc (II) de LADH, que modeló la estructura y reactividad del sitio activo de zinc en LADH4. A través de múltiples experimentos, estos ligandos de pinza han demostrado ser robustos bajo diferentes condiciones ambientales y se han mantenido estables con una colección diversa de grupos R adjuntos. 5,6

Los ligandos tridentatos son preferibles en comparación con los ligandos monóditados, porque se ha encontrado que tienen más éxito con la metalización debido a los fuertes efectos quelatos de los ligandos tridentitatos. Esta observación se debe a una entropía más favorecida de la formación de ligando pinza tridentita en comparación con un ligando monodentate13. Además, es probable que los ligandos de pinza de tridente eviten la dimerización de los complejos metálicos, lo que se favorece porque es probable que la dimerización difiacere la actividad catalítica de un complejo14. Por lo tanto, el uso de ligandos de pinza tridente se ha demostrado exitoso en la química organometálica en la preparación de complejos catalíticos activos y robustos. Los complejos de pinzas SNS han sido menos estudiados que otros sistemas de pinzas, ya que los complejos de pinzas suelen contener metales de transición de segunda y tercera fila15.

Esta investigación sobre metaloenzimas puede ayudar a comprender aún más su actividad enzimática, que se puede aplicar a otras áreas de la biología. Este método de síntesis de complejos de modelos en comparación con el método alternativo (sintetizar toda la proteína de LADH) es favorable por una serie de razones. La primera ventaja es que los complejos modelo son bajos en masa molecular y todavía son capaces de representar con precisión la actividad catalítica y las condiciones ambientales del sitio activo de la enzima natural. En segundo lugar, los complejos de modelos son más sencillos de trabajar y producir datos fiables y relacionables.

Este manuscrito describe la preparación sintética y caracterización de dos complejos modelo de pinza de cobalto (II) de LADH. Ambos complejos cuentan con un ligando de pinza que contiene átomos de donantes de azufre, nitrógeno y azufre. El primer complejo (4) se basa en un precursor de imidazol, y el segundo (5) se basa en un precursor de triazol. Los complejos muestran reactividad para la reducción de estequiometría de aldehídos pobres en electrones en presencia de un donante de hidrógeno. Estos resultados de reactividad se notificarán en un manuscrito posterior.

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Protocolo

1. Síntesis de cloro-(n3-S,S,N)-[2,6-bis(N-isopropyl-N'-metileimidazol-2-thione)piridina]cobalto(II)tetraclorocobaltato [4]

  1. Para preparar el complejo 4, añadir 0.121 g (3.12 x 10-4 mol) de 2,6-bis(N-isopropyl-N'-metilemidazol-2-thione)piridina (C19H25N5S2)6 a 15 mL de acetonitrilo en un matraz inferior redondo de 100 ml. A continuación, a esta solución, añadir 0,0851 g (3,58 x 10-4 mol) de cloruro de cobalto (II) hexahidrato (CoCl2x 6H2O). La solución de reacción debe cambiar de color de amarillo claro a verde esmeralda inmediatamente después de añadir el cloruro de cobalto(II) hexahidrato.
  2. Agregue una barra de agitación al matraz. Reflujo y agitación de la reacción durante 20 h para asegurar una reacción completa. Retire el disolvente con un rotovap bajo presión reducida.

2. Recristalización de cloro-(n3-S,S,N)-[2,6-bis(N-isopropyl-N'-methyleneimidazol-2-thione)piridina]cobalto(II)tetraclorocobaltato [4] por difusión lenta del vapor

  1. Disolver el soluto en acetonitrilo (7,5 ml), filtrar la solución y colocar la solución uniformemente en 1 dram viales. Llene cada vial con 1,5 ml de solución de acetonitrilo.
    1. Añadir algodón para tapar los viales, lo que permite una difusión lenta del vapor. Coloque el algodón cómodamente en la abertura en la parte superior del vial.
    2. Coloque los viales en un frasco de 240 ml que contenga 50 ml de éter dietílico. Cierre el frasco con una tapa.
    3. Permita que los cristales crezcan durante un período de 1 semana.
      NOTA: La recristalización puede tardar más de 1 día.

3. Síntesis de cloro-(n3-S,S,N)-[2,6-bis(N-isopropyl-N'-meethylenetriazol-2-thione)piridina]cobalto(II)tetraclorocobaltato [5]

  1. Para preparar el complejo 5, añadir 0.183 g (4.70 x 10-4 mol) de 2,6-bis(N-isopropyl-N'-methylenetriazol-2-thione)piridina (C17H23N7S2)6 a 15 mL de acetonitrilo en un matraz inferior redondo de 100 ml. A esta solución, añadir 0,223 g (9,37 x 10-4 mol) de cloruro de cobalto hexahidrato (CoCl2x 6H2O). La solución de reacción debe cambiar de color de amarillo claro a azul real inmediatamente después de añadir el cloruro de cobalto(II) hexahidrato.
    1. Agregue una barra de agitación al matraz. Reflujo y agitación de la reacción durante 20 h para asegurar una reacción completa. Retire el disolvente con un rotovap bajo presión reducida.

4. Recristalización de cloro-(n3-S,S,N)-[2,6-bis(N-isopropyl-N'-metiletriazol-2-thione)piridina]cobalto(II)tetraclorocobaltato [5] por difusión lenta del vapor

  1. Disolver el soluto en acetonitrilo (9,0 ml), filtrar la solución y colocar la solución uniformemente en 1 dram viales. Llene cada vial con 1,5 ml de solución de acetonitrilo.
    1. Añadir algodón para tapar los viales, lo que permite una difusión lenta del vapor. Coloque el algodón cómodamente en la abertura en la parte superior del vial.
    2. Coloque los viales en un frasco que contenga 50 ml de éter dietílico. Cierre el vial con una tapa.
    3. Permita que los cristales crezcan durante un período de 1 semana.
      NOTA: La recristalización puede tardar más de 1 día.

5. Cristalografía de rayos X

  1. Monte un cristal de 4 en un lazo de nylon. Recopile los datos de un difractómetro de difracción Oxford de Rigaku. Aquí, los datos de difracción de rayos X se recopilan en 173(2) K. Resolver la estructura cristalina utilizando Olex216 y ShelXT17 programas de solución de estructura utilizando métodos directos. Refine la estructura con el paquete de refinamiento ShelXL18 usando la minimización de mínimos cuadrados.
  2. Monte un cristal de 5 en un lazo de nylon. Recopile los datos de difracción de rayos X en un difractómetro de difracción Oxford de Rigaku. Aquí, los datos de difracción de rayos X se recopilan en 173(2) K. Resolver la estructura cristalina utilizando Olex216 y ShelXT17 programas de solución de estructura utilizando métodos directos. Refine la estructura con el paquete de refinamiento ShelXL18 usando la minimización de mínimos cuadrados.

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Resultados

Síntesis
Las síntesis de los complejos 4 y 5 se llevaron a cabo con éxito reaccionando una solución de acetonitrilo que contiene un precursor de ligando bis-tione con cloruro de cobalto (II) hexahidrato(Figura 2). Esta reacción se produjo a una temperatura de reflujo en presencia de aire. En general, se observó que los complejos 4 y 5 eran solubles en acetonitrilo, dimetilsulfóxido, diclorometano y metano...

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Discusión

La preparación de los complejos 4 y 5 es fácil. El paso clave es añadir el sólido CoCl2s 6H2O a una solución de acetonitrilo que contiene el precursor de ligando respectivo. La solución se vuelve verde oscuro en cuestión de segundos después de la adición de CoCl2s 6H2O para formar complejo 4. La solución se vuelve azul brillante después de la adición de CoCl2s 6H2O para formar complejo 5. ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

John Miecznikowski recibió apoyo financiero de lo siguiente para este proyecto: Connecticut NASA Space Grant Alliance (Número de Premio P-1168), el Fairfield University Science Institute, College of Arts and Sciences Publication Fund, Fairfield Estipendio de Investigación de Verano de la Facultad universitaria, y National Science Foundation-Major Research Instrumentation Program (Número de subvención CHE-1827854) para fondos para adquirir un espectrómetro NMR de 400 MHz. También agradece a Terence Wu (Universidad de Yale) por su ayuda en la adquisición de espectros de masas electrospray. Jerry Jasinski reconoce el Programa de Instrumentación de Investigación Mayor de la Fundación Nacional de Ciencias (Número de Subvención CHE-1039027) para fondos para comprar un difractómetro de rayos X. Sheila Bonitatibus, Emilse Almanza, Rami Kharbouch y Samantha Zygmont reconocen el Programa de Académicos Hardiman por proporcionar su estipendio de investigación de verano.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Matraz de fondo redondo de 100 mLChem GlassCG150691matraz de fondo redondo de un solo cuello de 100 ml, 19/22 junta exterior
acetonitriloFisherHB9823-4Enfriador de grado HPLC
para roto-vapLaudaL000638Alpha RA 8
Cloruro de cobalto hexahidratadoAcros OrganicsAC423571000Acros Organics
ÉterdietílicoFisherE-138-1Éter dietílico Anhydorus
cilindro graduadoFisherS6345625 mL
calefactoraFisher11-100-49SHIsotemp Basic Stirring Hotplate
Jars Fisher05-719-481250 mL frascos
Ligando----------Sintetizado anteriormente por el profesor Miecznikowski
medio bolas de algodónFisher22-456-80 bolas dealgodón medianas
un vial de dramFisher03-339viales de un dram con tapón forrado TFE
pipetaFisher13-678-20Bpipetas de 5,75 pulgadas
bombillas de pipetaFisher03-448-21Marca Fisher Bombilla de látex para pipeta
plato de recristalización para baño de arenaFisher08-741 D325 mL plato de recristalización para baño de arena
condensador de reflujoChem GlassCG-1218-A-22Condensador con junta interior 19/22
RotovapHeidolph Collegiate 36000090Brinkmann; Evaporador rotativo Heidolph Collegiate con baño ecológico Heidolph WB Evaporador rotativo Heidolph
arena de mar para bañode arena Acros Organics612355000arena de mar lavada para baño de arena
Barraagitadora Fisher 07-910-23Barra de agitación magnética en forma de huevo
Grasa de vacíoFisher14-635-5DDow Corning Bomba
para rotovapHeidolph Collegiate36302830Control de válvulas Heidolph Rotovac
placa de cilindro graduado de de vacío de grasa de alto vacío

Referencias

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