Presentamos un protocolo para el aislamiento, el cultivo y la inducción adipogénica de células madre derivadas de cresta neural derivadas de la cresta adiposa (NCADSC) del tejido adiposorio periaortico de Wnt-1 Cre+/-; Ratones Rosa26RFP/+. Los NCADSC pueden ser una fuente de aXenatos de fácil acceso para modelar adipogénesis o lipogénesis in vitro.
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Artículo de método
Aislamiento, cultivo e inducción adipogénica de células madre originales adiposas de raíz de la cresta neuronal del tejido adiposorio
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En este artículo
Resumen
Resumen
Una cantidad excesiva de tejido adiposo que rodea los vasos sanguíneos (tejido adiposo perivascular, también conocido como PVAT) se asocia con un alto riesgo de enfermedad cardiovascular. Los ADSC derivados de diferentes tejidos adiposos muestran características distintas, y los del PVAT no han sido bien caracterizados. En un estudio reciente, informamos que algunos ADSC en el tejido adiposo del arco periaortico (PAAT) descienden de las células de la cresta neural (NCC), una población transitoria de células migratorias que se originan en el ectodermo.
En este artículo, describimos un protocolo para aislar los CNC etiquetados con proteína fluorescente roja (RFP) del PAAT de Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ ratones e inducir su diferenciación adipogénica in vitro. Brevemente, la fracción vascular estromal (SVF) se disocia enzimáticamente del PAAT, y los ADSC derivados de cresta neural RFP+ (NCADSC) se aíslan por la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Los NCADSC se diferencian en adipocitos marrones y blancos, pueden ser crioconservados, y conservan su potencial adipogénico para pasajes de 3-5 euros. Nuestro protocolo puede generar abundantes ADSC del PVAT para modelar la adipogénesis PVAT o la lipogénesis in vitro. Por lo tanto, estos NCADSC pueden proporcionar un sistema valioso para el estudio de los interruptores moleculares involucrados en la diferenciación PVAT.
Introducción
La prevalencia de la obesidad está aumentando en todo el mundo, lo que aumenta el riesgo de enfermedades crónicas relacionadas, incluidas las enfermedades cardiovasculares y la diabetes1. PVAT rodea los vasos sanguíneos y es una fuente importante de factores endocrinos y paracrinos involucrados en la función de la vasculatura. Los estudios clínicos muestran que el alto contenido de PVAT es un factor de riesgo independiente de enfermedad cardiovascular2,3, y su función patológica depende del fenotipo de las células madre derivadas de la adiposa constituyente (ADSC)4
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Protocolo
El protocolo animal ha sido revisado y aprobado por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad Jiao Tong de Shanghái.
1. Generación de Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ Ratones
- Cross Wnt-1 Cre+/- ratones16 con ratones Rosa26RFP/+ 18 para generar Wnt-1 Cre+/-; Ratones Rosa26RFP/+. Los ratones domésticos bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 h en una instalación libre de patógenos a 25 oC y 45% de humedad hasta que tengan 4-8 semanas de edad.
2. Disección del PAAT
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Resultados
Usando el protocolo descrito anteriormente, obtuvimos .0.5–1.0 x 106 ADSC de 5–6 Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ ratones (48 semanas de edad, hombres o mujeres).
El diagrama de flujo de la colección de PAAT de ratones se presenta en la Figura 1. La morfología de los NCADSC era similar a la ADSC de otros ratones tejidos adiposos. Los NCADSC cultivados alcanzaron una confluencia del 80-90% después de 7-8 días de cultivo, y los NCADSC tenía.......
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Discusión
En este estudio, presentamos un método fiable para el aislamiento, cultivo e inducción adipogénica de NCADSC extraídos del PVAT de Wnt-1 Cre+/-; Ratones transgénicos Rosa26RFP/+ diseñados para producir RFP+ ADSC. Los informes anteriores muestran que no hay ninguna diferencia significativa en la expresión de marcadores generales de células madre mesenquimales multipotentes (MSC) en NCADSCs y no NCADSCs22, y que los NCADSC tienen un fuerte potencial para diferenciars.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
National Key R&D Program of China (2018YFC1312504), National Natural Science Foundation of China (81970378, 81670360, 81870293), y la Comisión de Ciencia y Tecnología del Municipio de Shanghái (17411971000, 17140902402) proporcionó los fondos para este estudio .
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 4% PFA | BBI ciencias de la vida | E672002-0500 | Lote #: EC11FA0001 |
| Agarosa | ABCONE (China) | A47902 | 1% concentración |
| de trabajo Anti-cebp/α | ABclonal | A0904 | 1:1000 |
| concentración de trabajo IgG anti-ratón, CST 7076 ligado a HRP | 7076 | 1:5000 | |
| concentración de trabajo Anti-perilipina | Abcam | AB61682 | 1 μ concentración de trabajo g/mL; lote #: GR66486-54 |
| Anti-PPARy | SANTA CRUZ | sc-7273 | 0.2 μ g/mL de concentración de trabajo |
| Anti-conejo IgG, enlazada a HRP | CST | 7074 | 1:5000 |
| concentración de trabajo Anti-β-Tubulin | CST | 2146 | 1:1000 concentración de trabajo |
| BSA | VWR ciencias de la vida | 0332-100G | 50 mg/mL concentración de trabajo; lote #: 0536C008 |
| Colagenasa, Tipo I | Gibco | 17018029 | |
| Dexametasona | Sigma-Aldrich | D4902 | 0.1 y micro; M concentración de trabajo |
| Tampón de lisis eritrocitaria | Invitrogen | 00-4333 | |
| FBS | Corning | R35-076-CV | 50 mg/mL concentración de trabajo; lote #: R2040212FBS |
| HBSS | Gibco | 14025092 | |
| HDMEM | Gelifesciences | SH30243.01 | Lote #: |
| AD20813268 IBMX | Sigma-Aldrich | I7018 | 0.5 mM de trabajo concentración |
| Insulina | Sigma-Aldrich | I3536 | 1 μ g/mL |
| Pinzas microquirúrgicas | Suzhou Mingren Medical Equipment Co., Ltd. (China) | MR-F201A-1 | |
| Tijera microquirúrgica | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-H121A | |
| Red O solución | Sigma-Aldrich | O1516 | 0.3% concentración |
| de trabajo PBS (solución salina tamponada con fosfato) | ABCONE (China) | P41970 | |
| Penicilina-Estreptomicina | Gibco | 15140122 | |
| PrimeScript RT reactivo Kit | TAKARA | RR047A | Lote #: AK4802 |
| RNeasy kit | TAKARA | 9767 | Lote #: AHF1991D |
| Rosa26RFP/+ ratones | JAX | No.007909 | C57BL/6 backgroud; macho y hembra |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | 1 y mu; M concentración de trabajo |
| Pinzas estándar | Suzhou Mingren Medical Equipment Co., Ltd. (China) | MR-F424 | |
| Tijera quirúrgica | Suzhou Mingren Medical Equipment Co., Ltd. (China) | MR-S231 | |
| SYBR Premix Ex Taq | TAKARA | RR420A | Lote #: AK9003 |
| Triyodotironina | Sigma-Aldrich | T2877 | 10 nM concentración |
| de trabajoWnt1-Cre+; PPARγ flox/flox ratones | JAX | No.009107 | C57BL/6 backgroud; macho y hembra |
Referencias
- Afshin, A., et al. Health Effects of Overweight and Obesity in 195 Countries over 25 Years. New England Journal of Medicine. 377 (1), 13-27 (2017).
- Brown, N. K., et al.
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Reimpresiones y permisos
Etiquetas
Células madre derivadas de tejido adiposo de la cresta neuralAislamiento de tejido adiposo periaórticoFracción estromal vascularClasificación de células activada por fluorescenciaDiferenciación adipogénicaInducción de adipocitos marronesInducción de adipocitos blancosMarcaje con proteínas fluorescentesProtocolo de cultivo celularAlmacenamiento por criopreservación
