Visualización de la muerte de células líticas de macrófagos durante la infección micobacteriana en embriones de pez cebra a través de la microscopía intravital

Se ha demostrado que la infección micobacteriana causa la muerte de células inmunitarias del huésped¹. Por ejemplo, una tensión atenuada desencadenará apoptosis en los macrófagos y contendrá la infección. Sin embargo, una cepa virulenta desencadenará la muerte de células líticas, causando diseminación bacteriana^1,2. Teniendo en cuenta el impacto que estos diferentes tipos de muerte celular tienen en la respuesta antimicobacteriana del huésped, se necesita una observación detallada de la muerte de las células de macrófagos durante la infección micobacteriana in vivo.

Los métodos convencionales para medir la muerte celular son utilizar manchas de células muertas, como Annnexin V, TUNEL o acridina naranja/yoduro propidium manchado^3,4,5. Sin embargo, estos métodos son incapaces de arrojar luz sobre el proceso dinámico de muerte celular in vivo. La observación de la muerte celular in vitro ya ha sido facilitada por imágenes en vivo^6. Sin embargo, si los resultados imitan con precisión las condiciones fisiológicas sigue sin estar claro.

El pez cebra ha sido un excelente modelo para estudiar las respuestas anti-mycobacterium del huésped. Tiene un sistema inmunológico altamente conservado similar al de los seres humanos, un genoma fácilmente manipulado, y los embriones tempranos son transparentes, lo que permite imágenes en vivo^7,8,9. Después de la infección con M. marinum, peces cebra adultos forman estructuras típicas de granuloma maduro, y peces cebra embrionarios forman granuloma temprano como estructuras^9,10. El proceso dinámico de interacción inmune innata de células-bacterias ha sido explorado previamente en el pez cebra M. marinum infección modelo^11,12. Sin embargo, debido al alto requisito de resolución espacio-temporal, los detalles que rodean la muerte de las células inmunitarias innatas permanecen en gran medida indefinidos.

Aquí describimos cómo visualizar el proceso de muerte celular lítica de macrófagos desencadenada por la infección micobacteriana in vivo. Este protocolo también se puede aplicar a la visualización del comportamiento celular in vivo durante el desarrollo y la inflamación.

El pez cebra se crió en condiciones estándar de acuerdo con las directrices de animales de laboratorio para la revisión ética del bienestar animal (GB/T 35823-2018). Todos los experimentos de pez cebra en este estudio fueron aprobados (2019-A016-01) y llevados a cabo en el Centro Clínico de Salud Pública de Shanghai, Universidad de Fudan.

1. Preparación del inóculo de célulaúnica M. marinum (Figura 1)

1. Descongelar el material de Glicerol de Cerulean-fluorescentM. marinum a -80 oC e inocular una placa de agar 7H10 con 10% (v/v) OADC, 0.25% glicerol y 50 ég/ml de higromicina. Incubar la placa a 32oC durante unos 10 días.
2. Seleccione una colonia que exprese fluorescencia positiva e inocule 3 ml de medio 7H9 con 10% de OADC, 0,5% de glicerol y higromicina de 50 g/ml.
   1. Incubar la inoculación a 32 oC y 100 revoluciones por minuto (rpm) durante 4-6 días hasta que el cultivo alcance la fase logarítmica (OD₆₀₀ a 0,6–1,0).
   2. Subcultura (1:100) en 30 ml de medio fresco 7H9 con 10% de OADC, 0,5% de glicerol, 0,05% de Tween-80 y 50 g/ml hasta que el OD₆₀₀ alcance el 1,0.
      NOTA: Para obtener la más alta calidad de cultivo, se recomienda un paso de subcultura en este punto. En nuestra experiencia, la adición del clon directamente a un gran volumen de medio conducirá a la formación de grumos bacterianos.
3. Recoger células de M. marinum como se describe a continuación.
   1. Centrífuga a 3.000 x g durante 10 min para recoger el M. marinum como un pellet. Deseche todo excepto 300 l del sobrenadante y utilícelo para resuizar el pellet.
   2. Añadir 3 mL de medio 7H9 con 10% de glicerol para resuspender aún más el pellet, luego sonicar la suspensión en un baño de agua a 100 W a 15 s ON, 15 s OFF durante un total de 2 min.
      NOTA: El propósito de la sonicación es lograr un homogeneizado de una sola célula para el inóculo, lo que evitará el bloqueo de la aguja de microinyección.
4. Transfiera la suspensión bacteriana a una jeringa de 10 ml y, a continuación, pase a través de un filtro de 5 m para eliminar cualquier grumos bacterianos.
5. Mida la densidad óptica (OD) de la suspensión utilizando un espectrofotómetro y diluyala a OD₆₀₀ a 1,0 con medios 7H9 que contengan 10% de glicerol. Divida la suspensión en alícuotas de 10 l y guárdela en un congelador de -80 oC para su uso futuro.
6. Confirmar la concentración bacteriana del inóculo (cfu/ml) mediante dilución en serie y chapado de la culata bacteriana en una placa de agar 7H10 que contenga 10% (v/v) de OADC, 0,5% de glicerol y 50 g/ml de higromicina.

2. Preparación de embriones de pez cebra

1. Uno el día antes del desove, establecer parejas de cría de peces cebra en la cámara de cría.
   NOTA: Agregue solo un par a cada cámara de cría.
2. Recoger embriones a la mañana siguiente dentro de 1 h después de la fertilización (hpf). Lave cuidadosamente los embriones con agua destilada y transfiera hasta 100 embriones a una placa Petri de 100 mm que contenga 30 ml de medio E3. Incubar a 28,5oC.
3. Después de las 12 h, observe bajo un microscopio y deseche los huevos no fecundados o dañados.
4. A 24 hpf, cambie el medio a fresco del medio E3 con N-feniltiourea (PTU, 0,2 nM concentración final) para evitar el desarrollo de pigmento. Incubar los embriones a 28,5 oC hasta que los embriones estén listos para la microinyección.

3. Infección por microinyección bacteriana

1. Prepare agujas de inyección microcapilarde vidrio borosilicato como se describió anteriormente en la referencia¹³.
2. Embriones zebrafish que se montan para la infección
   1. Microondas 100 mL de 1% (p/v) y 100 mL de agarosa de fusión baja al 0,5% (p/v) en un medio E3 autoclave hasta que la agarosa esté completamente derretida. Dividir en tubos de alícuota de 1 ml y almacenar a 4 oC para su uso futuro.
   2. Antes de su uso, calentar la agarosa en un bloque de calentamiento de 95 oC hasta que esté completamente derretida. Mantener la agarosa en forma líquida colocándola en un bloque de calentamiento de 45oC(Figura 2).
   3. Montaje para infección intramuscular en la región troncal
      1. Crea la capa inferior de agarosa vertiendo 0,5 ml de agarosa al 1% (p/v) uniformemente sobre un portaobjetos de vidrio. Colocar sobre una caja de hielo o superficie fría durante 3 minutos para solidificar.
      2. Anestetizar los embriones de pez cebra (48-72 hpf) en agua de huevo con tricaína (200 g/ml) y PTU durante 5 minutos antes del montaje. Coloque hasta 60 embriones de pez cebra en la capa inferior de agarosa y colóquelos cuidadosamente en dos filas(Figura 2B).
      3. Retire el agua restante en la capa inferior de agarosa con papel tisú antes de añadir 0,3 ml de agarosa de 0,5% (p/v) para crear la capa superior. Asegúrese de que los embriones estén completamente incrustados en la agarosa. Vuelva a devolver el portaobjetos de vidrio a la caja de hielo para solidificar la agarosa y evitar la deshidratación.
      4. Mantenga húmeda la capa superior de agarosa cubriendo la superficie con agua de huevo E3 adicional.
   4. Montaje para la infección por cerebro medio
      1. Cubra la ranura de una sola diapositiva de microscopía de vidrio de concavidad con agarosa del 1% (p/v) y, a continuación, transfiera los embriones anestetizados con tricaína 4-6 a la agarosa.
      2. Coloque la cabeza de cada embrión hacia arriba cuidadosamente con una aguja de 10 G(Figura 2C).
      3. Una vez fijadas todas las posiciones de los embriones, transfiera el portaobjetos de vidrio a una caja de hielo o a una superficie fría para dejar que la agarosa se solidifique.
         NOTA: Evite la dilución de la agarosa de baja fusión minimizando el volumen de transferencia de agua de huevo con los embriones.
3. Preparación de bacterias para la infección
   1. Añadir 1 l de color rojo fenol filtrado estérilmente (10x) a una alícuota de 10 l de material bacteriano (hecho en el paso 1) y mezclar vórtice brevemente.
      NOTA: La concentración final se puede ajustar utilizando PBS estéril.
   2. Sonicar la preparación usando 100 W a 10 s ON, 10 s OFF durante 1 min para romper cualquier grupo que pueda haber formado¹⁴.
4. Infección por microinyección
   1. Ajuste el microinyector y el micromanipulador a la posición adecuada y ajuste de la microinyección como se ha indicado anteriormente¹³.
   2. Transfiera 3 l de la preparación bacteriana utilizando un microcargador a la aguja preparada (ver paso 3.1). Pipetear lentamente y con cuidado para evitar la formación de burbujas de aire.
   3. Para la infección de la región troncal, inyecte 100 cfu en la región troncal(Figura 3A). Evite inyectar bacterias en el notochord.
      NOTA: El cfu para inyección se estima por la fórmula cfu - concentración bacteriana de stock x factor de dilución x volumen de gotas de inyección. El cfu real se confirma enchapando una gota de inóculo bacteriano en una placa de agar 7H10 que contiene 10% (v/v) de OADC, 0,5% de glicerol y 50 g/ml de higromicina.
   4. Para la infección del cerebro medio, inyectar alrededor de 500 cfu en la región del cerebro medio(Figura 3B).
   5. Después de la microinyección, enjuague cuidadosamente los embriones de pez cebra en agua fresca de huevo con una pipeta de plástico.
      NOTA: Monte los embriones en la placa inferior de vidrio tan pronto como sea posible para cubrir la observación de la respuesta innata de las células inmunitarias muy tempranas.

4. Imágenes en vivo de la infección

1. Montaje de peces para imágenes en directo
   1. Transfiera hasta 10 embriones anestetizados con tricaína a la mitad de un plato de 35 mm con fondo de vidrio. Deseche el medio E3 adicional.
   2. Cubra el plato con un 1% de agarosa de bajo punto de fusión y oriente los embriones de pez cebra cuidadosamente usando una aguja de 10 G. Incubar el plato inferior de vidrio en hielo durante 10 s para solidificar la agarosa.
      NOTA: Para la inyección en el cerebro medio, los embriones deben montarse en la agarosa con la cabeza dirigida hacia arriba(Figura 4A). Para la infección intramuscular de la región troncal, los embriones deben montarse lateralmente en la agarosa(Figura 4B).
   3. Una vez que se haya solidificado por completo, cubra la agarosa con una capa de agua de huevo (más 1 x tricaína y PTU).
2. Microscopía confocal de lapso de tiempo de alta resolución de tres colores
   NOTA: Los siguientes pasos se operan en una microscopía confocal equipada con una lente objetivo UV de aceite de 63,0x 1,40.
   1. Ajuste la temperatura de la cámara ambiental a 28,5 oC. Coloque un poco de papel de tejido húmedo dentro de la cámara para proporcionar humedad y evitar la evaporación del agua del huevo(Figura Suplementaria 1).
   2. Coloque el plato inferior de vidrio de 35 mm con el pez cebra en la cámara ambiental.
   3. Abra el software confocal e inicialice el escenario. Cambie al objetivo UV de aceite de 63,0 x 1,40 y localice el pez cebra utilizando el canal de campo brillante con un filtro de contraste de interferencia diferencial (DIC).
   4. Abra el diodo 405, el argón (20% de potencia) y el láser DPSS 561 nm. Configure la potencia láser y los ajustes de espectro adecuados.
      NOTA: A continuación se indican los ajustes del espectro para Cerulean (excitación 405 nm; emisión a 456–499 nm), eGFP (excitación a 488 nm; emisión de 500–550 nm), DsRed2 (excitación a 561 nm; emisión a 575–645 nm)(Figura complementaria 2B).
   5. Elija el "XYZ" "Sequential Scan" modo de adquisición y establezca el formato de las imágenes en "512 x 512 píxeles"(Figura suplementaria 2A).
   6. Cambie a"Modo de datosen vivo". Apunte a la posición del primer pez cebra y marque la posición"Comenzar"y"Fin"Z. Repita este proceso para cada uno de los embriones restantes. A "Pausa" se puede agregar al final del programa(Figura Suplementaria 2C).
   7. Defina el bucle y el ciclo del programa.
   8. Guarde el archivo.

5. Irradiación UV de una sola célula para inducir la apoptosis y las imágenes en vivo

1. Monte el pescado como se describe en el paso 4.1.
2. Imagen de la región del cerebro medio de 3 días después de la fertilización (dpf) macrofago específico Tg transgénico Tg(mfap4-eGFP) embrión¹⁵
3. Seleccione la región de interés de un solo macrófago con etiqueta fluorescente y escanee a una velocidad de 400 Hz y un 6% de potencia láser UV para 50 s.
   NOTA: La velocidad y el tiempo de escaneo deben optimizarse en función del microscopio individual. El tiempo de escaneo debe optimizarse para causar el daño extenso del ADN que posteriormente causará la apoptosis celular objetivo, pero no fotoblanquear toda la célula.
4. Repita el paso anterior para irradiar más células diana.
5. Realice imágenes de lapso de tiempo de la región del cerebro medio como se describe en la sección 4.

6. Procesamiento de imágenes

1. Realice"Proyección máxima"para las imágenes adquiridas.
2. Busque y marque la posición XY y el tiempo de las celdas de destino bajo la vista"Proyección máxima".
3. Vuelva a la vista estándar para buscar y marcar la posición Z de las celdas de destino.
4. Recortar la imagen de una sola capa de las celdas de destino.
5. Exporta el canal de superposición y el campo brillante como vídeos en formato AVI.
6. Recortar el área de interés del canal de superposición y el campo brillante en ImageJ.
7. Combina los dos vídeos en el último paso verticalmente y guárdalos como un vídeo en formato AVI en ImageJ.

La infección por Mycobacterium puede desencadenar diferentes respuestas del huésped en función de las vías de la infección. En este protocolo, los embriones de pez cebra se infectan por microinyección intramuscular de bacterias etiquetadas fluorescentes en el cerebro medio o el tronco(Figura 3)y se observan mediante imágenes en vivo confocales. La infección a través de estas dos vías restringirá localmente la infección que causa el reclutamiento innato de células inmunitarias y la posterior muerte celular.

Visualizar los detalles de la muerte innata de las células inmunitarias es un reto. La muerte celular lítica ocurre en una ventana de tiempo muy corta y requiere microscopía de alta resolución para observar. Además, la alta motilidad de las células inmunitarias innatas les permite migrar fuera del área de observación. En este protocolo, resolvemos este problema observando múltiples embriones en paralelo. Una serie de embriones de pez cebra se pueden montar en una sola diapositiva de microscopio de vidrio para la infección, y hasta 10 embriones se pueden montar en la misma placa inferior de vidrio de 35 mm para imágenes en vivo(Figura 4). Aprovechando un modelo de datos en vivo de microscopía confocal, se puede observar más de un embrión simultáneamente. Esto mejora la eficiencia de las imágenes en vivo y aumenta en gran medida la probabilidad de capturar todo el proceso de muerte de células líticas.

El sistema inmunitario innato es la primera línea de defensa contra la infección micobacteriana, y dos componentes clave son el macrófago y el neutrófilo. Aquí utilizamos Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2) y Tg(mpeg1:loxP-DsRedx-loxP-eGFP;lyz:eGFP) para distinguir los macrófagos y los neutrófilos in vivo16,17,18. Un macrófago muy engordado con bacterias se hizo redondo y mostró una motilidad reducida, con hinchazón citoplasmática eventual, rotura de la membrana celular y rápida diseminación del contenido citoplasmático. Estos eventos son cambios morfológicos típicos de la muerte celular lítica como se informó anteriormente(Figura 5A)16. La irradiación UV se ha utilizado para activar células para someterse a apoptosis en el pez cebra20,21. En consonancia con esta noción, los macrófagos irradiados por UV mostraron fenotipos típicos de células apoptóticas, como la contracción celular, la fragmentación nuclear y la condensación de cromatina (Figura 5B)22,23. Combinado con el uso de Cerulean-fluorescent M. marinum19, se logró in vivo imágenes en vivo de tres colores de la interacción entre macrófagos, neutrófilos y M. marinum. También observamos que los macrófagos pueden fagocitosa activamente y diseminar M. marinum (Figura suplementaria 3A). Sin embargo, los neutrófilos tenían una capacidad fagocítica limitada y rápidamente se sometieron a la muerte de células líticas sin engorgement bacteriano obvio(Figura suplementaria 3B). Los neutrófilos podrían ser desencadenados por la fagocitosis de sólo unos pocos M. marinum muertos que no expresan fluorescencia ceruleana, o simplemente por fagocitosis de escombros de células muertas limitadas.

Figura 1: Diagrama esquemático de la preparación de bacterias de una sola célula. Las poblaciones de Cerulean-fluorescentes M. marinum de una sola célula se generaron después del proceso descrito. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Diagrama del montaje de embriones de pez cebra para microinyección. (A) Diagrama esquemático del proceso de montaje. (B) Los embriones de pez cebra se montaron lateralmente para la infección de la región troncal. (C) Los embriones de pez cebra se montaron con la cabeza dirigida hacia arriba para la infección del cerebro medio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Posicionamiento para microinyección. (A) La flecha roja indica el lugar de inyección para la infección de la región del tronco. (B) La flecha roja indica el lugar de inyección para la infección por cerebro medio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Montaje de embriones de pez cebra para imágenes en vivo. (A) Para la infección del cerebro medio, los embriones de pez cebra se montaron con la cabeza dirigida hacia abajo. (B) Para la infección de la región troncal, los embriones de pez cebra se montaron lateralmente con el lugar de inyección cerca de la parte inferior de la placa inferior de vidrio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Cambios morfológicos típicos en la infección por M. marinum indujeron la muerte de células líticas de macrófagos y la apoptosis de macrófagos inducidapor por rayos UV. (A) Imágenes de lapso de tiempo de un macrófago (Mac) sometido a la muerte de células líticas una vez que está muy engordado con M. marinum. El cerebro medio del embrión de pez cebra de 3 dpf Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2) está infectado por el múndola fluorescente de Cerulean M. marinum (500 cfu) a través de la microinyección. Se proporcionan imágenes tanto para el canal de superposición (panel superior) como para el canal DIC (panel inferior). T 00:00 es 5 h 20 min después de la infección. Líneas discontinuas blancas - contorno de la membrana celular; líneas discontinuas negras - citoplasma de hinchazón; flechas negras - membrana celular rota; líneas discontinuas rojas: pérdida rápida de contenido citoplasma. (B) Imágenes de lapso de tiempo de macrófagos irradiados por UV. Una célula GFP+ en la región del cerebro medio de 3 dpf Tg(mfap4:eGFP) es irradiada por UV y seguida por imágenes de lapso de tiempo. Líneas discontinuas blancas - contorno de la membrana celular; flechas negras: fragmentación nuclear y condensación de cromatina. Barra de escala a 15 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura suplementaria 1: Cámara ambiental configurada para imágenes en vivo. (A) Ajuste el controlador digital para mantener la temperatura a 28,5 oC. (B) Ponga toallitas húmedas dentro de la cámara para proporcionar humedad y evitar la evaporación del agua del huevo. (C) Cierre la cubierta de la cámara y espere al menos 30 minutos para la estabilización de la temperatura antes de comenzar la toma de imágenes en vivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura suplementaria 2: Ajuste del panel confocal para imágenes en vivo. (A) Representación de la configuración del panel de adquisición. (B) Representación de la potencia láser y los ajustes del espectro. (C) Representación de varios trabajos y configuración de bucle en modo de datos en tiempo vivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura suplementaria 3: Los macrófagos diseminan la infección y los neutrófilos se someten a la muerte de células líticas después de la infección por M. marinum. (A) Macrofago que difunde M. marinum en el tronco de un empartidor de pecce ceruleano-fluorescente M. marinum (100 cfu). (B) Neufilo (Neu) a la muerte celular lítica sin M. marinum cargado evidentemente en la región troncal de 3 dpf Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP) embrión de pez cebra infectado por Cerulean-fluorescentM. marinum (100 cfu) a través de microinyección. El color verde se asigna a LRLG y el color rojo se asigna a eGFP para una mejor visualización del proceso de muerte de células líticas. Las flechas en cian indican las celdas de destino. Las flechas en rojo apuntan a las celdas que están a punto de liberar el contenido del citoplasma en el siguiente fotograma. Las flechas en verde apuntan a las células muertas que acaban de perder su contenido de citoplasma. Barra de escala a 25 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Video 1: Un macrófago cargado en gran medida con M. marinum sufre la muerte de células líticas, relacionada con la Figura 5A. Imágenes de lapso de tiempo (objetivo 63x) durante 9 min y 18 s a 3 fotogramas por segundo (fps) de la región del cerebro medio de un embrión de pez cebra de 3 dpf(coro1a:eGFP;lyzDsRed2) infectado con Cerulean-fluorescent M. marinum. Haga clic aquí para ver este video (Haga clic con el botón derecho para descargar).

Video 2: Un macrófago se somete a apoptosis después de la irradiación UV, relacionada con la Figura 5B. Imágenes de lapso de tiempo (objetivo 63x) de 74 min a 6 fps de la región del cerebro medio de un embrión de pez cebra de 3 dpf Tg(mfap4:eGFP). Una célula GFP+ en la región del cerebro medio de los embriones es irradiada por uv y seguida por imágenes de lapso de tiempo. Haga clic aquí para ver este video (Haga clic con el botón derecho para descargar).

Video 3: Un macrófago difunde M. marinum, relacionado con laFigura Suplementaria 3A. Imágenes de lapso de tiempo (objetivo 63x) de 24 min a 3 fps de la región troncal de 2 dpf Tg(coro1a:eGFP;lyz:DsRed2) embryol de pez cebra infectado con Cerulean-fluorescentM. marinum. Haga clic aquí para ver este video (Haga clic con el botón derecho para descargar).

Video 4: Un neutrófilo sufre la muerte celular lítica sin engorgement evidente de M. marinum, relacionado con la Figura Suplementaria 3B. Imágenes de lapso de tiempo (objetivo 63x) de 7 min 30 s a 3 fps de la región troncal de 3 dpf Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP) embrión de pez ceruleano-fluorescente M. marinum. Haga clic aquí para ver este video (Haga clic con el botón derecho para descargar).

Los autores no tienen nada que revelar.