Este método describe la evaluación de los cambios globales en la topología de la cadena de ubiquitina. La evaluación se realiza mediante la aplicación de un enfoque proteómico específico basado en espectrometría de masas.
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Artículo de método
Análisis de la cadena de ubiquitina por monitoreo paralelo de reacciones
En este artículo
Resumen
Resumen
La evaluación del perfil global de las topologías de la cadena de ubiquitina dentro de un proteoma es de interés para responder a una amplia gama de preguntas biológicas. El protocolo descrito aquí aprovecha la modificación di-glicina (-GG) que queda después de la digestión tríptica de ubiquitina incorporada en una cadena. Al cuantificar estos péptidos de topología-característica se puede determinar la abundancia relativa de cada topología de cadena de ubiquitina. Los pasos necesarios para cuantificar estos péptidos mediante un experimento paralelo de monitoreo de reacciones se informan teniendo en cuenta la estabilización de las cadenas de ubiquitina. La preparación de controles pesados, lisis celular y digestión se describen junto con el flujo de trabajo adecuado de configuración de espectrómetros de masas y análisis de datos. Se presenta un conjunto de datos de ejemplo con perturbaciones en la topología de ubiquitina, acompañado de ejemplos de cómo la optimización del protocolo puede afectar a los resultados. Siguiendo los pasos descritos, un usuario podrá realizar una evaluación global del panorama de la topología de ubiquitina dentro de su contexto biológico.
Introducción
La estrecha regulación de la función y estabilidad de las proteínas es de suma importancia, ya que son los principales impulsores del control fenotípico de la biología. La función de una proteína se construye a partir de dos componentes: su secuencia intrínsa de polipéptidos y cualquier modificación posttranslacional (PTM). Se han identificado varios PTMs químicos, incluyendo glicosilación, fosforilación, acetilación y metilación1. En 1975, Goldstein et al.2 identificaron una pequeña proteína y la llamaron ubiquitina debido a su naturaleza omnipresente. Se encontró que la ubiquitina era importante en la degradación de
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Protocolo
1. Preparación de un estándar de péptido pesado
- Dependiendo del proveedor y la calidad de los péptidos pesados comprados, los péptidos pesados tendrán que diluirse. Este protocolo utilizó las secuencias de péptidos notificadas en la Tabla 1,con el aminoácido C-terminal modificado a lisina(13C615N2-lisina) o arginina (13C615N4-arginina).
- Mezcle los péptidos pesados, diluyendo la mezcla con acetonitrilo (ACN) al 50% para crear una mezcla de péptidos con cada péptido a 10 μM.
- Crea alícuotas de la mezcla de péptidos y guárdalos a -80 °C.
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Resultados
Para demostrar el uso de un análisis de cadena de ubiquitina por PRM, se seleccionaron tres líneas celulares: una línea de células de melanoma de ratón B16, y las dos líneas celulares humanas comunes A549 (células epiteliales basales adenocarcinomicas alveolar) y HeLa (células cancerosas cervicales). Estos cultivos crecieron a fase midexponential en medios apropiados antes de ser tratados con 0, 10 o 100 mM MG-132 durante 4 h antes de la cosecha. MG-132 es un inhibidor del proteasoma que previene la degradación de las pr.......
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Discusión
El análisis del estado de ubiquitina dentro de un proteoma es de creciente importancia para una amplia variedad de cuestiones biológicas. La descripción del estado de ubiquitinación de una muestra debe centrarse no sólo en el perfil de las proteínas que se ubicuan, sino también en la topología de dicha ubiquitinación. La evaluación de esta topología por EM dirigida, como se describe aquí, tiene un papel en una amplia gama de investigaciones biológicas.
Debe entenderse que el protocolo descrito.......
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Divulgaciones
Los autores no declaran intereses en competencia.
Agradecimientos
Los autores quieren agradecer a Céline Jeanty su ayuda en la creación de pellets celulares con tratamiento de MG-132 como se describe en los resultados representativos y a Elise Mommaerts por su provisión de pellets E. coli utilizados en el protocolo.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Acetonitrilo (ACN) | Merck | ||
| Bicarbonato de amonio (ABC) | Centrífuga Fluka | 9830 | |
| Beckman Coulter | Microfuge 16 | ||
| Cloroacetamida (CAA) | Sigma | 22790 | |
| Eppendorf LoBind | Eppendorf | ||
| Ácido fórmico (FA) | Thermo Fisher Scientific | 85178 | |
| Péptidos pesados | JPT Peptide Technologies | ||
| HPLC | Dionex | Ulitimate 3000 | |
| LC Columna | Thermo Fisher Scientific | 160321 | |
| Lys C | Wako | 125-05061 | |
| Espectrómetro de masas | Thermo Fisher Scientific | Q-Exactive Plus | |
| (NEM) | ACROS Organics | 156100050 | |
| Cadena de Control Positivo K48 | Boston Biochem | UC-240 | |
| Cadena de Control Positivo K63 | Boston Biochem | UC-340-100 | |
| Cadena de Control Positivo M1 | Boston Biochem | UC-710B-025 | |
| Hidróxido de Sodio (NaOH) | Sigma | S5881 | |
| Sonificador | Branson | SFX 150 | |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer Comfort Ácido | |
| trifluoroacético (TFA) | Sigam | T6508 | |
| Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) | Thermo Fisher Scientific | 77720 | |
| Tripsina | Promega | V1511A | |
| Urea | Sigma | 51456 | |
| Aguas μ Placas de elución C18 | Aguas 186002318 |
Referencias
- Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database. Scientific Reports. 1, 90(2011).
- Goldstein, G., et al.
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Reimpresiones y permisos
