Artículo de método

ANÁLISis de metilación de LINE-1 en células madre mesenquimales tratadas con vesículas extracelulares derivadas de osteosarcoma

DOI:

10.3791/60705

⸱

1 de febrero de 2020

 ,  ,  , 
1Department of Oral and Maxillofacial Diseases, University of Helsinki, 2Helsinki University Hospital

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí se describe el uso de un método de amplificación de sonda específico para metilación para analizar los niveles de metilación de los elementos LINE-1 en células madre mesenquimales tratadas con vesículas extracelulares derivadas de osteosarcoma. También se demuestra la ultracentrifugación, un procedimiento popular para separar vesículas extracelulares del suero bovino fetal.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La amplificación de sonda específica de metilación (MSPA) es una técnica simple y robusta que se puede utilizar para detectar diferencias relativas en los niveles de metilación de las muestras de ADN. Es ingenioso, requiere pequeñas cantidades de ADN y toma alrededor de 4-5 h de trabajo práctico. En la técnica presentada, las muestras de ADN se desnaturalizan primero y luego se hibridan a sondas que apuntan al ADN en sitios metilados o de referencia como control. El ADN hibridado se separa en reacciones paralelas, una sometida únicamente a la ligadura y la otra sometida a ligadura seguida de la digestión mediada por HhaI en secuencias GCGC no metiladas. Los fragmentos de ADN resultantes son amplificados por PCR y separados por electroforesis capilar. Los sitios de GCGC metilados no son digeridos por HhaI y producen señales máximas, mientras que los sitios GCGC no metilados se digieren y no se generan señales máximas. La comparación de los picos normalizados de control de las versiones digeridas y no digeridas de cada muestra proporciona la relación de dosificación de metilación de una muestra de ADN. Aquí, MSPA se utiliza para detectar los efectos de las vesículas extracelulares derivadas del osteosarcoma (EV) en el estado de metilación del elemento nuclear intercalado largo-1 (LINE-1) en células madre mesenquimales. Los LINE-1 son elementos repetitivos del ADN que normalmente sufren hipometilación en el cáncer y, en esta capacidad, pueden servir como biomarcadores. La ultracentrifugación también se utiliza como método rentable para separar las vesículas extracelulares de los fluidos biológicos (es decir, al preparar suero bovino fetal agotado por EV [FBS] y aislar los vehículos eléctricos de los medios condicionados por osteosarcoma [centrifugación diferencial]). Para el análisis de metilación, las sondas line-1 personalizadas están diseñadas para dirigirse a tres sitios de metilación en la secuencia de promotor es tinoya y siete sitios de control. Este protocolo demuestra el uso de MSPA para el análisis de metilación LINE-1 y describe la preparación de FBS agotado por EV por ultracentrifugación.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La metilación del ADN es una modificación epigenética importante que se produce en las células humanas. La metilación del ADN se refiere a la vinculación de los grupos metilo con los residuos de citosina en los dinucleótidos de CpG. Estos dinucleótidos se encuentran generalmente en grupos (islas CpG) en la región de 5' de genes1. En las células normales, la mayoría de estos dinucleótidos existen en un estado no metilado, lo que permite la transcripción del ADN. Por cierto, muchos cánceres se asocian con islas de CpG hipermetiladas y silenciamiento transcriptomo2,especialmente en genes supresores de tumores, que a su vez contribuyen a varias señas de identidad del cáncer3.

Por otro lado, los elementos nucleares intercalados largos-1 (LINE-1s o L1s) son elementos de ADN repetitivos y transposibles que normalmente tienen altos niveles de metilación en las islas CpG. La metilación de LINE-1 previene la translocación y ayuda a mantener la integridad del genoma. En varios tipos de cáncer, LINE-1 se hipotila, lo que resulta en activación y posterior inestabilidad cromosómica mediada por retroposición4. LINE-1 representa casi el 17% del genoma humano5, y su estado de metilación puede servir como un indicador de los niveles globales de metilación genómica6. Se considera que la hipometilación global de LINE-1 precede a la transición de las células a un fenotipo tumoral7; por lo tanto, es prometedor como un marcador potencial para el inicio temprano del cáncer.

Actualmente, existen varios métodos para el análisis de metilación, incluyendo pirosequencing, PCR específico de metilación, microarrays e inmunoprecipitación de cromatina1. El uso de la secuenciación de próxima generación también ha hecho posible incorporar enfoques para todo el genoma para la detección de la metilación del ADN. Muchos de estos métodos se basan en ADN tratado con bisulfito, en el que las citosinas no metiladas se convierten en uracilo y las citosinas metiladas permanecen sin cambios. Sin embargo, trabajar con ADN tratado con bisulfito tiene varios escollos, como conversiones incompletas de citosinas no metiladas en uracilo, amplificación sesgada de secuencias y errores de secuenciación8.

En la amplificación de sonda específica de metilación (MSPA), las sondas compuestas por dos oligonucleótidos se dirigen a secuencias de ADN que contienen un sitio de restricción (GCGC) para la enzima de restricción sensible a la metilación HhaI9. Después de que las sondas se hibridan al ADN, cada muestra se divide en dos conjuntos. Las sondas del primer conjunto sufren ligadura, mientras que las sondas del segundo conjunto sufren ligadura seguida de digestión mediada por HhaI en sitios de CGCG no metilados. Ambos conjuntos de muestras son amplificados por PCR, y los productos están separados por electroforesis capilar. Las sondas en sitios no metilados son digeridas por HhaI y no se amplifican durante la PCR, lo que resulta en señales máximas. Por el contrario, las sondas en sitios metilados están protegidas de la digestión y, por lo tanto, se amplifican durante la PCR, generando posteriormente señales máximas10.

MSPA tiene varias ventajas sobre los métodos alternativos. En primer lugar, requiere una cantidad baja de ADN (50-100 ng) y es adecuado para el análisis de ADN a partir de muestras incrustadas de parafina fija de formalina10. No requiere ADN tratado con bisulfito; de hecho, no es adecuado para el ADN que se modifica de esta manera. Muchas muestras se pueden analizar al mismo tiempo, y las sondas MSPA se pueden diseñar de manera que se dirijan a múltiples genes o secuencias simultáneamente. Además, las sondas son específicas y sensibles para el ADN metilado, ya que el sitio de restricción HhaI corresponde a una secuencia típica de las islas CpG10.

Este estudio investigó los efectos de las vesículas extracelulares derivadas del osteosarcoma (OS) en la metilación LINE-1 en células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo (AT-MSCs; Figura 1). Los vehículos eléctricos son vesículas a nanoescala unidas a membranas secretadas por la mayoría de los tipos de células. Llevan proteínas, lípidos, ARNm, microARN y moléculas adicionales de las células madre11,12. Los vehículos eléctricos median la comunicación intercelular y desempeñan un papel importante en varias condiciones fisiopatológicas13,14. Un estudio reciente mostró que los vehículos eléctricos derivados del cáncer pueden transferir LINE-1 activo a las células receptoras15. Se ha informado anteriormente que los vehículos eléctricos de la línea celular HOS-143B pueden alterar el estado de metilación de LINE-1 en los MSC, además de otros efectos genéticos16.

Al cultivar células para el aislamiento de EV, es importante utilizar suero bovino fetal agotado por EV [FBS] en el medio de crecimiento, ya que los vehículos eléctricos derivados del FBS pueden interferir con los vehículos eléctricos de otras fuentes y obstaculizar los resultados17,18. La ultracentrifugación es uno de los métodos más comunes para agotar los vehículos eléctricos de FBS. Es un procedimiento relativamente simple y rentable en comparación con alternativas como la ultrafiltración y el FBS19comercial, agotado por EV. Aquí, el protocolo también demuestra cómo preparar FBS agotado por EV por ultracentrifugación.

Este artículo presenta un protocolo detallado para las técnicas antes mencionadas, desde el aislamiento de los vehículos eléctricos de una línea celular del sistema operativo hasta el análisis de metilación de LINE-1 en los MSC tratados con OS-EV(Figura 1).

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Protocolo

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Este estudio fue aprobado por el Comité de ética del distrito hospitalario de Helsinki y Uusimaa (aprobación ética D. No 217/13/03/02/2015).

1. Preparación de FBS agotado por EV por ultracentrifugación

  1. Tome FBS en tubos de centrífuga (ultra) y colóquelos en cubos de ultracentrífuga. Para garantizar que la ultracentrifugación funcione sin problemas y de forma segura, equilibre los cubos dentro de 10 mg entre sí.
  2. Cargue los cubos en un rotor oscilante (tipo SW28, factor k 246). Colocar el rotor en la ultracentrífuga y correr a 100.000 x g durante 19 h a 4oC.
  3. Recoja cuidadosamente la capa superior de color claro del sobrenadante (aproximadamente nueve décimas) y transfiera a un tubo de 50 ml. No moleste ni pipetee el pellet marrón oscuro, ya que contiene vehículos eléctricos de FBS.
  4. Pasar el sobrenadante a través de un filtro de 0,22 m en un nuevo tubo de 50 ml.
  5. Agregue el FBS con EV esterilizado por filtro salente al medio de cultivo celular al cultivar células para el aislamiento EV.

2. Aislamiento de vehículos eléctricos derivados del osteosarcoma

  1. Células de oSO de placa (línea celular HOS-143B) en un matraz T-175 con medio RPMI 1640, complementado con 10% de FBS normal y 1% de antibióticos (100 U/ml de penicilina, 0,1 mg/ml de estreptomicina). Colocar el matraz en una incubadora a 37oC y 5% CO2.
  2. Cuando el matraz es entre 70% y 80% de confluente, lave las células con solución salina con fosfato (PBS) y luego cultivarlas en medios que contengan 10% FBS agotado por EV (en adelante denominados medios agotados por EV).
    NOTA: 1 x 106 células HOS-143B chapadas en un matraz T175 alcanza una confluencia del 70% después de aproximadamente 60 h.
  3. Durante las siguientes 48 h, recoger los medios acondicionados de las células del osteosarcoma después de cada 24 h y añadir nuevos medios de EV agotados.
  4. Centrifugar el medio acondicionado a 2500 x g durante 20 min a 4 oC para eliminar las células y los residuos celulares. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo, dejando alrededor de 2 ml de medios en la parte inferior.
    NOTA: Si no se procede directamente con el aislamiento EV en esta etapa, el sobrenadante se puede almacenar a -80 oC.
  5. Vierta el sobrenadante en tubos ultracentrífugos y equilibre como antes. Centrifugar los tubos a 100.000 x g durante 2 h a 4oC.
  6. Deseche cuidadosamente el sobrenadante, dejando alrededor de 1 ml en la parte inferior. Añadir alrededor de 20 ml de PBS (0,1 m filtrados) al tubo y la pipeta suavemente para lavar y resuspender el pellet EV.
  7. Equilibre los tubos y realice otra ronda de ultracentrifugación con los mismos ajustes.
  8. Retire con cuidado el sobrenadante y resuspenda el pellet EV en 200 ml de PBS mediante un pipeteo suave. Almacene los vehículos eléctricos en tubos de unión baja.
    NOTA: Los vehículos eléctricos se pueden utilizar de inmediato o se almacenan en -80 oC hasta que se necesiten.

3. Caracterización de OS-EVs

NOTA: Los vehículos eléctricos purificados se pueden caracterizar por la hinchada occidental (WB), el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) y la microscopía electrónica de transmisión (TEM)16.

  1. Realice WB según el protocolo estándar16 con los marcadores EV CD63, TSG101 y Hsp70, y con calnexina como control negativo para indicar la pureza de la muestra EV20.
  2. Para NTA, primero diluir la muestra EV en PBS de Dulbecco filtrada de 0,1 m para obtener (idealmente) 30–100 partículas por fotograma.
    1. Tome alrededor de 500 ml de la muestra en una jeringa de 1 ml y cárguelo en el puerto de entrada del instrumento NTA. Compruebe que hay suficientes partículas por fotograma, para mediciones precisas.
    2. Abra el software NTA y grabe cinco vídeos de 60 s de duración, utilizando el nivel de cámara 13 a temperatura ambiente. Durante el análisis, utilice el umbral de detección 5 y la ganancia 10.
  3. Analice muestras EV por TEM como se describió anteriormente21.

4. Cultura AT-MSC

NOTA: El tejido adiposo humano para el aislamiento de células madre mesenquimales se proporcionó como aspirado de liposucción (Departamento de Cirugía Plástica, Laser Tilkka Ltd., Finlandia). Se tomó el consentimiento informado por escrito de los donantes lipoaspirados, que estaban sometidos a procedimientos electivos de liposucción.

  1. Aísle los AT-MSC de los aspirados de liposucción utilizando métodos de aislamiento mecánicos y enzimáticos estándar22.
    NOTA: También se pueden utilizar MSC de otras fuentes (incluidas las líneas celulares comerciales).
  2. Células de cultivo en medios DMEM/F-12 suplementadas con 10% FBS y 1% antibióticos.

5. Tratamiento de los MSC con OS-EVs

  1. Placa 15.000 AT-MSCs por pozo en una placa de 24 pocillos.
  2. Después de las 24 h, retire el medio viejo, lave las células con PBS y cambie a medios agotados ev.
  3. Tratar las células con OS-EV (a una concentración de partículas de 1 x 106 EVs por célula) el día 1 (24 h después de la adhesión celular), día 3 (48 h después del día 1) y día 5 (96 h después del día 1).
    1. Detenga el tratamiento OS-EV para muestras de punto de tiempo (TP) 0 en muestras de día 1, TP 3 en muestras de día 3 y TP 7 el día 7 (48 h después del día 5).
      NOTA: También se pueden seguir otros horarios de puntos de tiempo según los planes experimentales.
  4. Extraiga ADN de los MSC utilizando un método apropiado. Incluya muestras de control positivas y negativas para el análisis de datos.

6. Ensayo de metilación LINE-1

  1. Diseñe las imprimaciones de sonda LINE-1 personalizadas, como las ha hecho anteriormente Pavicic et al.23. Para las sondas de metilación, seleccione tres secuencias que contengan el sitio de restricción HhaI dentro de la región promotora de LINE-1. Para sondeos de control, seleccione siete secuencias que carezcan del sitio de restricción HhaI del resto de la secuencia LINE-1.
    NOTA: La secuencia LINE-1 está disponible en la base de datos GenBank24 (L1.2, adhesión no. AH005269.2). Utilice las instrucciones del fabricante MSPA para diseñar las sondas25.
  2. Diluir 70 ng de la muestra de ADN en el tampón TE a un volumen de 5 l.
  3. Llevar a cabo los siguientes pasos de termociclismo y PCR como se menciona en el Cuadro 1. Calentar las muestras durante 10 min a 98 oC, luego enfriar a 25 oC.
  4. Añadir 3 l de mezcla de hibridación de sonda a cada muestra y ejecutar el termociclador para permitir que las sondas se hibridan al ADN.
  5. A temperatura ambiente (RT), añadir 13 l de mezcla post-hibridación a cada muestra. Transfiera 10 l a un segundo tubo.
  6. Colocar ambos conjuntos de tubos en el termociclador e incubar a 48oC durante al menos 1 min.
    1. Mientras que las muestras están a 48 oC, añadir 10 oC de la mezcla de ligadura al primer conjunto de tubos (serie no digerida) y 10 oL de la mezcla de ligación-digestión al segundo conjunto de tubos (serie digerida). Ejecute el siguiente programa termociclador.
  7. Gire por los tubos y ajuste simultáneamente el termociclador a 72 oC.
  8. Añadir 5 l de mezcla de polimerasa a cada tubo y colocar los tubos en el termociclador. Ejecute el programa PCR.
  9. Mientras se ejecuta el programa PCR, prepare una solución de 1 mL de formamida que contenga 2,5 l de tamaño estándar. Pipeta de 10 l de esta solución a cada pocal de una placa óptica de 96 pocillos (con código de barras).
  10. Después de la PCR, diluir las muestras no digeridas y digeridas a 1:100 y 1:200 respectivamente en agua ultrapura. Añadir 2 ml de producto PCR diluido a la placa de 96 pocillos. Centrifugar la placa a 200 x g durante 15-20 s para eliminar las burbujas de aire.
  11. Realizar análisis de fragmentos de muestras por electroforesis capilar.
    NOTA: La placa debe almacenarse a 4 oC en la oscuridad hasta el análisis.

7. Análisis de datos de fragmentos

  1. Abrir los resultados de la electroforesis capilar en un software de análisis de electroferograma.
    1. En la columna Panel, para uno de los ejemplos, elija MLPA en el menú. Haga clic en el encabezado Panel y presione Ctrl+D para aplicar MLPA a todos los ejemplos.
    2. Del mismo modo, establezca el método Analysis en Microsatellite default para todas las muestras.
    3. Seleccione todas las muestras y haga clic en el botón de reproducción verde para analizar las muestras según la configuración elegida.
    4. Seleccione todas las muestras y haga clic en el botón Gráfico para visualizar los picos de la sonda.
    5. Amplíe la región pico para obtener una mayor resolución de los picos de sonda individuales. Asegúrese de que los 10 picos correspondientes a las sondas de la mezcla de sondas LINE-1 estén etiquetados. Deseche picos adicionales (<95 bp y >160 bp).
    6. En la pestaña Genotipos, exporte los resultados en el formato de valores separados por comas (CSV).
  2. Abra el archivo CSV en un software de análisis de datos y ordene los datos en columnas.
    1. Etiquete los tres picos del sitio de metilación en función de sus tamaños aproximados (L1-1m a 153 bp, L1-2m a 119 bp, L1-3m a 133 bp). Los siete picos restantes corresponden a las sondas de control.
      NOTA: Aquí se utilizan los valores de los picos de sonda L1-2m, que tienen un tamaño de 117 bp, ya que esa región se ha utilizado en la mayoría de los ensayos de metilación LINE-123.
    2. Para cada muestra (sin digerir y digerida), calcule el área de pico de suma de los siete picos de control. Divida el área de pico de cada sonda LINE-1 por esta suma.
    3. Para cada muestra de ADN, divida el valor de la muestra digerida por el de la muestra no digerida para obtener la relación de dosificación de metilación (DM) utilizando la siguiente ecuación:
      figure-protocol-1
      Donde: DM es la relación de dosificación de metilación, Ax es el área bajo el pico x (por ejemplo, pico L1-2m), y Actrl es el área de pico de suma de las siete sondas de control.

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Resultados

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El objetivo principal de este estudio fue evaluar los efectos epigenéticos de los OS-EV en los CPE. La expresión de los marcadores EV típicos CD63, Hsp70 y TSG101 por la hincha occidental confirmó la presencia de OS-EV. (Figura 2A). La ausencia de señal de calnexina indica pureza del aislado OS-EV. Se observó una indicación adicional de pureza con TEM, con vesículas intactas de varios tamaños presentes(Figura 2B). La concentraci...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio ilustra cómo se puede utilizar la MSPA para detectar y cuantificar el estado de metilación de un elemento genético específico. LINE-1 fue el foco aquí, pero las sondas se pueden diseñar para apuntar a una gama de genes y secuencias. Además, hay una creciente lista de mezclas de sondas disponibles para diferentes aplicaciones. MSPA es una técnica simple y robusta para el análisis de metilación de ADN que no requiere conversión de bisulfito10. El procedimiento completo, desde la prepara...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue financiado por la financiación de proyectos de la Universidad de Helsinki (WBS490302, WBS73714112) Financiación estatal del Hospital Universitario de Helsinki para la investigación sanitaria a nivel universitario (Y1014SUL05, TYH2016130), la Fundación Médica Finlandesa-Noruega, y el Selma y Fondo Maja-Lisa Selander (Fundación Minerva). Agradecemos a Walter Pavicic por proporcionar el protocolo MSPA modificado y por el soporte técnico relacionado. Estamos agradecidos a Teemu Masalin (Universidad de Helsinki) por ayudarnos con la producción de vídeo.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Jeringa de 1 mLTerumoSS+01T1para placa NTA
de 24 pocillosCorning3524MSC Cell Culture
3730xl Analizador de ADNApplied Biosystems, ThermoFisher Scientific3730XL
Tubo de centrífuga de 50 mLCorning 430829
Beckman Ultracentrífuga Optima LE-80K Beckman
Marcador de proteínas preteñido BlueStarNippon GeneticsMWP03WB: marcador de proteínas
Calnexina (clon C5C9)Tecnología de señalización celular2679WB, dilución 1:800
CD63 (clon H5C6)BD Biosciences556019WB, dilución 1:1000
Centrífuga 5702R Eppendorf5703000010Para medios acondicionados y células
Centrífuga 5810Eppendorf5810000010Para el centrifugado de placas de 96 pocillos
Tubo de centrífuga (polialómero, 14x95 mm)Beckman331374Ultracentrifugación
DMEM/F-12 + Medio GlutaMAXGibco, Life Technologies31331-028Para cultivo AT-MSC
Suero fetal bovinoGibco, Life Technologies10270-106
GeneScan 500 LIZ tamaño estándarAplicado Biosystems, Life Technologies4322682para electroforesis capilar
GenomePlex Kit completo de amplificación del genoma completo (WGA)SigmaWGA2-10RXNpara el control negativo de MSPA
Formamida de alta difusiónBiosystems aplicado, Life Technologies4311320para electroforesis capilar
Línea celular HOS-143BATCCCRL-8303
Hsp70 (clon 5G10)BD Biosciences554243WB, dilución 1:1000
IRDye 800CW Cabra anti-ratónLi-Cor926-32210WB: secundario
IRDye 800CW Cabra anti-conejo Li-Cor926-32211WB:
secundario LINE-1 cebadores de mezcla de sondaIDTSecuencias en la Tabla 1
MicroAmp Optical Placa de reacción de 96 pocillos con código de barrasApplied Biosystems, Life Technologies4306737también requiere película de sellado
Micro BCA Kit de ensayo de proteínasThermoFisher Scientific23235medir la concentración de proteínas
MiniProtean TGX 10% gelesBio-Rad456-1034WB: electroforesis en gel
NanoSight LM14CMalvern Instrumentspara NTA
Membrana de nitrocelulosa 0.2 y micro; mBio-Rad1620112WB: transferencia de proteínas
NucleoSpin Tissue XSMacherey-Nagel740901.50para la extracción de ADN
Tampón bloqueante OdysseyLi-Cor927-40000WB: bloqueo, anticuerpos
PBS, 1XCorning21-040-CVR
Penicilina-estreptomicinaGibco, Life TechnologiesDE17-602EAntibióticos para medio de cultivo
Tubo LoBind de proteínas, 0,5 ml22431064 EppendorfPara el almacenamiento de Evs
REVERT Kit de solución de tinción y lavado de proteínas totalesLi-Cor926-11015WB: tinción de proteínas totales
Línea celular RKOATCCCRL-2577para control positivo MSPA
Medio RPMI 1640 + GlutaMAXGibco, Life Technologies61870-010para cultivo celular HOS-143B
SALSA MLPA HhaI enzimaMRC-HollandSMR50
SALSA MLPA kit de reactivosMRC-HollandEK1-FAM
SALSA MLPA P300 probe-mixMRC-HollandP300-100R
Rotor oscilante SW-28Beckman Coulter342207Ultracentrifugación Filtro
jeringa, 0,22 y micro; mJet BiofilFPE-204-030filtro estéril FBS
Tecnai 12FEI Empresaequipada con Gatan Orius SC
1000B CCD-camera
(Gatan Inc., EE. UU.); para TEM
TBS, 1X tabletasMedicago09-7500-100WB: tampón
Trans-Blot TurboBio-RadWB: transferencia
TermocicladorThermoFisher Scientific
TrypLE ExpressGibco12604-021para la tripsinización de células
TSG101 (clon 4A10)SigmaSAB2702167WB, dilución 1:500
de TCA0096

Referencias

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