Imagen tridimensional de resolución de una sola célula de organoides intactos

El avance de nuevos métodos de cultivo, como la tecnología organoide, ha permitido el cultivo de órganos en un plato^1. Los organoides se convierten en estructuras tridimensionales (3D) que resecan su tejido de origen a medida que preservan los rasgos fenotípicos y funcionales. Los organoides son ahora fundamentales para abordar las cuestiones biológicas fundamentales^2,modelar enfermedades como el cáncer³y desarrollar estrategias de tratamiento personalizado^4,5,6,7. Desde el primer protocolo para la generación de organoides derivados de células madre adultas intestinales⁸, la tecnología organoides se ha extendido para incluir una amplia gama de tejidos sanos y cancerosos derivados²⁰de órganos como próstata^9,cerebro¹⁰, hígado^11,12, estómago¹³, mama^14,15, endometrio¹⁶, glándula salival¹⁷, papi yema¹⁸, páncreas¹⁹,

El desarrollo de organoides ha coincidido con el auge de nuevas técnicas de microscopía volumétrica que pueden visualizar la arquitectura de todo el tejido de montaje en 3D^{21,,22,,23,,24.} Las imágenes 3D son superiores a las imágenes tradicionales de la sección de tejido 2D al visualizar la compleja organización de muestras biológicas. La información 3D resulta ser esencial para entender la composición celular, la forma celular, las decisiones de destino celular y las interacciones célula-célula de muestras biológicas intactas. Las técnicas de seccionamiento óptico no destructivo, como la microscopía de escaneo láser confocal o multifon (CLSM y MLSM) y la microscopía de fluorescencia de láminas de luz (LSFM), ahora permiten la visualización combinada de detalles finos, así como la arquitectura general de tejidos, dentro de una sola muestra biológica. Este potente enfoque de imagen ofrece la oportunidad de estudiar la complejidad estructural que se puede modelar con organoides²⁵ y mapear la distribución espacial, la identidad fenotípica y el estado celular de todas las células individuales que componen estas estructuras 3D.

Recientemente publicamos un protocolo detallado para la imagen 3D de alta resolución de organoides fijos y despejados²⁶. Este protocolo está diseñado y optimizado específicamente para el procesamiento de delicadas estructuras organoides, a diferencia de metodologías para grandes tejidos intactos como DISCO^27,,28,CUBIC^29,,30,,31y CLARITY^32,,33. Como tal, este método es generalmente aplicable a una amplia variedad de organoides que difieren en origen, tamaño y forma y contenido celular. Además, en comparación con otros protocolos de imágenes volumétricas que a menudo requieren mucho tiempo y esfuerzo, nuestro protocolo no es exigente y se puede completar en un plazo de 3 días. Hemos aplicado nuestro protocolo de imagen 3D para visualizar la arquitectura y composición celular de los sistemas organoides recientemente desarrollados derivados de diversos tejidos, incluyendo vías respiratorias humanas^34,riñón^20,hígado^11,y organoides de cáncer de mama humano¹⁵. En combinación con el trazado de linaje fluorescente multicolor, este método también se ha utilizado para revelar la biopotencia de las células basales en organoides mamarios^{de ratón 14}.

Aquí, refinamos el protocolo introduciendo el agente de compensación no tóxico FUnGI³⁵. El claro FUnGI se logra en un solo paso de incubación, es más fácil de montar debido a su viscosidad y preserva mejor la fluorescencia durante el almacenamiento. Además, introducimos dodecil sulfato de sodio (SDS) en el tampón de lavado para mejorar las tinciones nucleares, así como un método de montaje basado en silicona para una fácil preparación de la diapositiva antes de la microscopía. La Figura 1 proporciona una visión general gráfica del protocolo (Figura 1A) y ejemplos de organoides de imagen 3D (Figura 1B-D). En resumen, los organoides se recuperan de su matriz 3D, fijos e inmunoetiquetados, ópticamente despejados, se obtienen imágenes mediante microscopía confocal y luego se renderizan en 3D con software de visualización.

El uso de organoides derivados de ratones se ajusta a las normas reglamentarias y fue aprobado por el Comité de ética animal del Instituto Walter y Eliza Hall (WEHI). Todas las muestras de organoides humanos fueron recuperadas de biobancos a través de la Tecnología Hubrecht Organoid (HUB, www.hub4organoids.nl). Las autorizaciones fueron obtenidas por el Comité ético Médico de UMC Utrecht (METC UMCU) a petición del HUB con el fin de garantizar el cumplimiento de la Ley de Investigación Médica Holandesa que involucra a sujetos humanos y el consentimiento informado se obtuvo de los donantes cuando sea apropiado.

1. Preparación de reactivos

1. Para preparar el paraformaldehído del 4% (p/v) (PFA), caliente 400 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) a poco menos de 60 oC en un baño de agua. Añadir 20 g de polvo de PFA y disolver con un agitador.
   1. A continuación, agregue unas gotas de 10 M NaOH. Dejar enfriar en hielo y añadir unas gotas de 10 M HCl para ajustar el pH a 7.4. Re cubra con PBS a 500 ml y alícuota (almacenar a -20 oC durante un máximo de 2 meses).
      NOTA: No caliente por encima de 60 oC para evitar la degradación del PFA. Tiempo de preparación a 4 h.
2. Para preparar PBS con Tween-20 (PBT) (0,1% v/v), agregue 1 ml de Tween-20 a 1 L de PBS (almacenar a 4 oC durante un máximo de 4 semanas).
   NOTA: Tiempo de preparación a 10 min.
3. Para preparar 100 ml de ácido etilendiaminetetraacético de 0,5 M (EDTA), añadir 18,6 g de EDTA y 2,5 g de NaOH a 80 mL de dH₂O. Ajustar el pH a 8 con 1 M NaOH y llenar a 100 mL con dH₂O.
4. Para preparar 500 mL de 1 M Tris, disolver 60,55 g de Tris con 42 ml de concentrado (36-38%) HCl en 300 mL de dH₂O. Ajuste el pH a 8 y llene a 500 mL.
5. Para preparar el tampón de lavado organoide (OWB), añadir 1 ml de Triton X-100, 2 ml de SDS al 10% (p/v) y 2 g de albúmina sérica bovina (BSA) a 1 L de PBS (almacenar a 4 oC hasta 2 semanas).
   NOTA: Tiempo de preparación a 10 min.
6. Para hacer 220 mL de FUnGI, mezcle 110 mL de glicerol con 20 ml de dH₂O, 2,2 mL de tampón Tris (1 M, pH 8,0) y 440 l de EDTA (0,5 M). Añadir 50 g de fructosa y mezclar a temperatura ambiente (RT) en la oscuridad hasta que se disuelva. Cuando esté despejado, agregue 49 g de fructosa y mezcle hasta que se disuelva. A continuación, añadir 33,1 g de urea y mezclar hasta que se disuelva (almacenar a 4 oC en la oscuridad).
   NOTA: No caliente a medida que la fructosa se carameliza a temperaturas más altas. FUnGI consta de 50% (v/v) glicerol, 9,4% (v/v) dH2O, 10,6 mM de base tris, 1,1 mM EDTA, 2,5 M de fructosa y 2,5 M de urea. Tiempo de preparación 1 día.
7. Para preparar PBS-BSA (1% p/v), disolver 1 g de BSA en 100 ml de PBS (almacenar a 4 oC hasta 2 semanas).
   NOTA: Tiempo de preparación a 10 min.

2. Recuperación de organoides

NOTA: Los siguientes pasos se aplican a los organoides cultivados en extracto de membrana de sótano (BME) que se cultivaron en una placa de 24 pozos con un tamaño de 100 x 500 m.

1. Aspirar el medio de cultivo y lavar 1x con PBS helado. Evite interrumpir la matriz 3D.
2. Ponga la placa sobre hielo y agregue 1 ml de solución de recuperación de células heladas (Tabla de materiales)a cada pozo. Incubar 30-60 min a 4oC en una coctelera horizontal (40 rpm).
   NOTA: Las gotas de matriz 3D deben disolverse por completo.
3. Recubrir una punta de pipeta de 1 ml con BSA sumergiendo en 1% PBS-BSA y pipeteando arriba y abajo 2x. Este recubrimiento evitará que los organoides se peguen a la punta. Para recubrir el lado interior de un tubo cónico de 15 ml, llene con 5 ml de 1% de PBS-BSA, invierta 2x3x y deseche el PBS-BSA.
   NOTA: Este recubrimiento es necesario para todos los consumibles de plástico hasta la fijación (paso 3.3).
4. Usando una punta recubierta, resuspender suavemente el contenido del pozo 5x10x y transferir los organoides a tubos recubiertos de 15 ml. Los organoides de diferentes pozos con la misma identidad se pueden agrupar en el mismo tubo.
5. Añadir 1 ml de pb-BSA frío enfriado al 1% de PBS-BSA a cada pozo de cultivo para enjuagar y recoger todos los organoides.
6. Añadir PBS frío a 10 mL y girar hacia abajo durante 3 min a 70 x g y 4 oC para obtener un pellet apretado sin una capa visible de matriz 3D. Retire con cuidado el sobrenadante.

3. Fijación y bloqueo

1. Resuspender cuidadosamente los organoides en 1 ml de PFA helado usando una punta recubierta de 1 ml.
2. Se ha corregido a 4oC durante 45 min. Resuspender suavemente los organoides a la mitad del tiempo de fijación utilizando una punta recubierta de 1 ml para asegurar una fijación uniforme entre todos los organoides.
3. Añadir 10 ml de PBT helado al tubo, mezclar suavemente invirtiendo el tubo, incubar durante 10 minutos y girar hacia abajo a 70 x g,ambos a 4 oC.
   NOTA: A partir de este paso, el recubrimiento de las puntas generalmente no es necesario, ya que la mayoría de los tipos de organoides no se adhieren a la punta después de la fijación. Sin embargo, algunos organoides pueden requerir plásticos recubiertos incluso después de la fijación.
4. Bloquear los organoides resuspender el pellet en OWB helado (al menos 200 ml de OWB por pozo) y transferir los organoides a una placa de suspensión de 24 pozos.
   NOTA: Los organoides de un pellet grande se pueden dividir en varios pozos para realizar diferentes tinciones.
5. Incubar a 4oC durante al menos 15 min.

4. Inmunoetiquetado

1. Pipeta de 200 l de OWB en un pozo vacío para servir como pozo de referencia.
   NOTA: El inmunoetiquetado también se puede realizar en placas de 48 o 96 pozos para reducir el uso de anticuerpos. Sin embargo, el usuario debe ser consciente de que tanto el rendimiento de tinción como el de lavado podría reducirse debido al volumen más pequeño.
2. Permita que los organoides se asienten en la parte inferior de la placa.
   NOTA: Esto se puede comprobar con un estereomicroscopio y se hace más fácil mediante el uso de un fondo oscuro.
3. Incline la placa 45o y retire el OWB dejando los organoides en 200 s de OWB (utilice el pozo de referencia para estimar 200 l).
4. Añadir 200 l de OWB con anticuerpos primarios 2x concentrados (p. ej., E-cadherina [1:400] y Ki67 [1:200] para obtener resultados en la Figura 1; queratina 5 [1:500], queratina 8/18 [1:200], MRP2 [1:50] y Ki67 [1:200] para obtener resultados en la Figura 2) e incubar durante la noche a 4 oC mientras se balancea/sacude ligeramente (40 rpm en la coctelera horizontal).
5. Al día siguiente, agregue 1 mL de OWB.
6. Deje que los organoides se asienten en la parte inferior de la placa durante 3 min. Retire el OWB dejando 200 l en la placa. Añadir 1 ml de OWB y lavar 2 h con balanceo/temblor suave.
7. Repita el paso 4.6 dos veces más.
8. Deje que los organoides se asienten en la parte inferior de la placa durante 3 min. Retire el OWB dejando 200 l en el pozo.
9. Añadir 200 l de OWB con anticuerpos secundarios, anticuerpos conjugados y tintes 2x concentrados (p. ej., DAPI [1:1000], rat-AF488 [1:500], ratón-AF555 [1:500], phalloidin-AF647 [1:100] para los resultados 1; DAPI [1:1000], rat-AF488 [1:500], rabbit-AF555 [1:500], mouse-AF555 [1:500], phalloidin-AF647 [1:100] para los resultados en la Figura 2; DAPI [1:1000], phalloidin-AF647 [1:100] para los resultados en la Figura 3) e incubar durante la noche a 4oC mientras se balancea/sacude ligeramente.
10. Al día siguiente, repita los pasos 4.5 a 4.7.
11. Transfiera los organoides a un tubo de 1,5 ml y gire hacia abajo a 70 x g durante 3 min.

5. Limpieza óptica de organoides

1. Retire tanto como sea posible el OWB pipeteando sin interrumpir los organoides.
2. Añadir FUnGI (al menos 50 l, RT) utilizando una punta de 200 l con el extremo cortado y resuspend suavemente para evitar la formación de burbujas. Incubar en RT durante 20 min.
   NOTA: La limpieza óptica por FUnGI puede causar una contracción menor del tejido. Esto no afectará a la morfología general de organoides monocapados y multicapa; sin embargo, los organoides monocapa de forma esférica con grandes lúmenes pueden colapsar. El protocolo se puede pausar aquí y las muestras se pueden almacenar a 4 oC (durante al menos 1 semana) o a -20 oC (durante al menos 6 meses).

6. Preparación de diapositivas para imágenes confocales

1. Preparar una jeringa de 10 ml con un sellador de silicona(Tabla de materiales). Fije una punta de 200 l y corte el extremo para permitir un flujo suave de la silicona viscosa después de presionar la jeringa. Utilice la jeringa para dibujar un rectángulo de 1 cm x 2 cm en el centro de un portaobjetos.
2. Corte el extremo de una punta de 200 l y transfiera los organoides de FUnGI al centro del rectángulo.
3. Coloque un cubreobjetos en la parte superior. Para minimizar las burbujas de aire atrapadas, coloque primero el lado izquierdo del cubreobjetos, luego baje lentamente el cubreobjetos de izquierda a derecha hasta que no haya aire atrapado y luego suelte el cubreobjetos.
   NOTA: Los espaciadores de tamaño sisililar para los organoides se pueden utilizar para evitar que se dañen.
4. Aplique suavemente presión sobre todos los bordes del cubreobjetos para fijarlo firmemente al sellador de silicona. La diapositiva ya está lista para la toma de imágenes.
   NOTA: El protocolo se puede pausar aquí y la muestra se puede almacenar a 4 oC (durante al menos 1 semana) o a -20 oC (durante al menos 6 meses).

7. Adquisición y procesamiento de imágenes

1. Usando un microscopio de escaneo láser confocal (Tabla de Materiales), imagine la diapositiva con un objetivo de inmersión múltiple 25x o de inmersión en aceite 40x para imágenes confocales.
   1. Utilice los siguientes ajustes de adquisición para el objetivo de 25x: marco de modo de escaneo, tamaño de fotograma 1024 x 1024, tamaño de vóxel 332 nm x 332 nm x 1,2 m, tiempo de permanencia de píxeles <2 s, escaneo bidireccional, número de promedio 1, profundidad de bits 8. Para reducir el fotoblanquido, utilice baja potencia láser (<5% en general, <10% para la tinción débil).
   2. Utilice el modo Z-stack para definir los límites inferior y superior y establecer el tamaño del paso Z en óptimo. Cuando se toma imágenes de estructuras organoides grandes o múltiples organoides juntos, utilice el modo de mosaico con una superposición del 10% e indique el área de interés.
      NOTA: Con estos ajustes, el tamaño de los datos de un organoide típico con un diámetro de <300 m es <1 GB.
2. Para conjuntos de datos de escaneo de teselas, cose los archivos de imágenes en el software acompañados del microscopio (Tabla de materiales). En la sección de procesamiento, seleccione Puntada como método, elija Nueva salida en parámetros y seleccione el archivo que desea coser. Pulse Aplicar para iniciar la costura.
3. Obtenga una representación renderizada en 3D de las imágenes en la pestaña Vista 3D del software de imágenes(Tabla de materiales)y, posteriormente, optimice las propiedades de brillo, contraste y representación 3D. Exporte instantáneas RGB de los resultados como archivos TIFF.

Los organoides de imagen en 3D permiten la visualización de la arquitectura, la composición celular, así como los procesos intracelulares con gran detalle. La técnica presentada no es exigente y presumiblemente puede aplicarse a una amplia gama de sistemas organoides que se derivan de diversos órganos o especies anfitrionas.

La fuerza de las imágenes 3D en comparación con las imágenes 2D se ilustra con imágenes de organoides de la glándula mamaria de ratón que se generaron utilizando los métodos14publicados recientemente. La capa central de estos organoides consiste en células luminales K8/K18 positivas en forma de columnar y la capa externa contiene células basales alargadas K5 postive(Figura 2A),que recapitula la morfología de la glándula mamaria in vivo. Esta organización polarizada es difícil de apreciar desde una sección óptica 2D de ese mismo organoide(Figura 2B,panel medio). Otro ejemplo de una estructura compleja que es imposible de interpretar sin información 3D es la red de canalículos MRP2 positivos que facilitan la recolección del líquido biliar de los organoides hepáticos humanos11 (Figura 2B). Esto ejemplifica cómo nuestro método permite la visualización de las características estructurales esenciales de los organoides. Además, la calidad y resolución obtenidas permite la segmentación semiautomática y el análisis de imágenes. Por lo tanto, los números de células totales y la presencia de marcadores se pueden cuantificar en subtipos celulares específicos en organoides enteros. Ilustramos esto segmentando los núcleos de un organoide entero que contiene 140 células, de las cuales 3 células muestran alta positividad para el marcador del ciclo celular Ki67 (Figura 2C). El canal DAPI se selecciona como canal de origen y los segmentos se generan en función de un paso de umbral de intensidad y un diámetro de esfera de 10 m. Los objetos que se tocan se dividen por región que crecen a partir de puntos de semilla. Por último, se aplica un filtro de tamaño de 10 vóxeles para eliminar segmentos pequeños inducidos por ruido. Para cada segmento que representa un núcleo, la intensidad media del canal Ki67 se exporta para el trazado.

Recientemente desarrollamos el agente de compensación óptica FUnGI35,que ahora integramos en este protocolo para refinar la transparencia de los organoides. FUnGI es fácil de usar, ya que la limpieza se logra fácilmente mediante un solo paso de incubación después de la tinción inmunofluorescente. Una ventaja adicional del agente es su viscosidad, que facilita el manejo de muestras durante el montaje de la diapositiva. Las muestras fluorescentes en FUnGI conservan su fluorescencia incluso cuando se almacenan durante varios meses a -20 oC. Demostramos que la FUnGI supera a los que no están claros y la fructosa-glicerol en la calidad de la señal fluorescente profunda en el organoide (Figura 3A, B), y que los organoides despejados por FunGI tienen una intensidad de fluorescencia mejorada en general en comparación con los organoides no aclarados(Figura 3C).

En resumen, describimos una técnica de imagen 3D no exigente y reproducible para adquirir datos volumétricos de organoides inmunoetiquetados. Este protocolo se puede utilizar fácilmente para la imagen de una variedad de organoides, incluyendo los de origen humano y de ratón, de modelos sanos y de enfermedades. La preparación sencilla de la muestra se puede adaptar para facilitar microscopios fluorescentes confocales, multifotón y láminas de luz para obtener una resolución celular a subcelular de organoides enteros.

Figura 1: Descripción esquemática del protocolo de imágenes 3D de alta resolución. Los organoides se recuperan de su matriz 3D. La fijación y el bloqueo se realizan antes del inmunoetiquetado con anticuerpos y tintes. La compensación óptica se logra en un solo paso utilizando el agente de compensación FUnGI. La representación 3D de imágenes se puede realizar mediante el uso de software de imágenes. (A) Resumen esquemático del procedimiento. (B) Imagen confocal 3D de montaje integral de un organoide colonico humano inmunoetiquetado para F-actina y E-cadherina (E-cad) (objetivo de aceite 25x). Barra de escala a 40 m. (C) Imagen confocal 3D despejada. Barra de escala a 20 m. (D) Sección óptica agrandada de un organoide colonico humano inmunomarcado para F-actina, E-cadherina (E-cad) y Ki67 (objetivo de aceite 25x). Barra de escala a 5 m. Esta cifra ha sido modificada de Dekkers et al.26. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Las imágenes volumétricas visualizan la arquitectura 3D compleja. Imágenes confocales que representan datasets 3D de montaje integral (panel izquierdo), secciones ópticas 2D (panel central) y áreas 3D de una región ampliada (panel derecho). (A) Un organoide derivado de una sola célula basal de la glándula mamaria del ratón que ilustra la organización 3D de células basales mamarias alargadas que rodean las células luminales o etiquetadas para K8/18, K5 y F-actin (limpieza de fructosa-glicerol; objetivo de aceite 25x). Las barras de escala representan 55 m (panel izquierdo) y 40 m (paneles medios y derecho). (B) Un organoide hepático fetal humano con una compleja red 3D de canalículos MRP2 positivos, etiquetado para DAPI, MRP2 y F-actina (limpieza de fructosa-glicerol; objetivo de aceite 40x). Las barras de escala representan 25 m (panel izquierdo) y 8 m (paneles medio y derecho). (C) Imagen de montaje completo 3D confocal de un organoide hepático fetal humano etiquetado con DAPI y Ki67 (panel izquierdo) y una imagen segmentada en el canal DAPI utilizando software de imágenes (panel central). Barra de escala a 15 m. Gráfico trazado que representa la intensidad media de Ki67 en todas las células (segmentadas por DAPI) de todo el organoide (140 células) (panel derecho). Esta cifra ha sido modificada de Dekkers et al.26. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Limpieza óptica de organoides con FUnGI. (A) Imágenes representativas de organoides colónicos humanos etiquetados con F-actina (verde) y DAPI (gris) e imageados sin despeje, despejados con fructosa-glicerol o despejados con FUnGI (objetivo de aceite de 25x). Panel izquierdo: renderizado 3D del organoide. Panel derecho: sección óptica del organoide a 150 m de profundidad. Para la condición de "sin compensación" el brillo de la imagen tuvo que aumentarse en comparación con las condiciones de "fructosa-glicerol" y "FUnGI" para visualizar el organoide. Barra de escala a 50 m. (B) Ajuste de regresión no lineal que muestra la disminución de la intensidad DAPI con el aumento de la profundidad Z para diferentes métodos de compensación óptica. Los valores representan intensidades de células individuales detectadas por la segmentación DAPI y se normalizan a la intensidad DAPI media de los primeros 50 m del organoide. Para evitar la subestimación de la atenuación causada por células más brillantes en los bordes más profundos y estructuras en ciernes, sólo se analizaron las regiones centrales de los organoides. (C) Se crearon tres organoides por condición de tamaño y profundidad similares hacia el cubreobjetos utilizando ajustes idénticos del microscopio. Los datasets 3D completos se segmentaron en la señal DAPI para su comparación. Gráfico de barras que muestra la intensidad media de DAPI con diferentes métodos de compensación en conjuntos de datos segmentados completos. Los datos se representan como la media ± SD. Los valores son intensidades de >3800 celdas individuales detectadas por segmentación DAPI. • p < 0.0001, prueba Kruskal-Wallis con pruebas post-hoc de comparación múltiple de Dunn de dos caras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar.