Análisis de la distribución de tumores y tejidos de anticuerpos terapéuticos específicos del antígeno objetivo

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para estudiar la localización in vivo de anticuerpos en modelos de xenoinjertos tumorales en ratones.

Resumen

Los anticuerpos monoclonales son fármacos multifuncionales de alta afinidad que funcionan mediante mecanismos independientes variables para eliminar las células cancerosas. En las últimas décadas, el campo de los conjugados de anticuerpos y fármacos, anticuerpos biespecíficos, receptores de antígenos quiméricos (CAR) e inmunoterapia contra el cáncer ha surgido como el área más prometedora de las investigaciones básicas y terapéuticas. Con numerosos ensayos en humanos exitosos dirigidos a receptores de punto de control inmune y células CAR-T en leucemia y melanoma a un ritmo revolucionario, es muy emocionante para las terapias oncológicas derivadas de variaciones de la ingeniería de anticuerpos. Lamentablemente, un número significativamente grande de anticuerpos y terapias basadas en CAR también han demostrado ser decepcionantes en los ensayos en humanos de cánceres sólidos debido a la limitada disponibilidad de células de efector inmune en el lecho tumoral. Es importante destacar que la distribución inespecífica de anticuerpos terapéuticos en tejidos distintos de los tumores también contribuye a la falta de eficacia clínica, toxicidad asociada e insuficiencia clínica. Como la traducción fiel de estudios preclínicos en senderos clínicos en humanos se basa en gran medida en los estudios de eficacia y seguridad del xenoinjerto tumoral de ratones, aquí destacamos un método para probar el tumor y la distribución general del tejido de los anticuerpos terapéuticos. Esto se logra mediante la etiqueta del anticuerpo purificado de proteína A con un tinte fluorescente infrarrojo cercano seguido de imágenes en vivo de ratones portadores de tumores.

Introducción

Fda aprobó el primer anticuerpo monoclonal dirigido a CD3 (OKT3, Muromonab) en 1986^1,2. Desde entonces durante los siguientes veinte años, ha habido una rápida explosión en el campo de la ingeniería de anticuerpos debido al éxito abrumador de los anticuerpos contra los inhibidores del punto de control inmune³. Además de la activación indirecta del sistema inmunitario, los anticuerpos están destinados a marcar directamente las células cancerosas para atacar con precisión las células del efector inmune, desencadenar la citotoxicidad a través del agonista del receptor de la muerte, bloquear la señalización de supervivencia de las células tumorales, obstruir la angiogénesis (crecimiento de los vasos sanguíneos), restringir los reguladores del punto de control inmune, entregar radioisótopos, medicamentos de quimioterapia y siRNA como agentes conjugados². Además, el estudio de los fragmentos variables de cadena única (scFv) de varios anticuerpos en la superficie de células T y células NK derivadas del paciente (CAR-T y CAR-NK) es un área de rápido crecimiento de las investigaciones clínicas para terapias basadas en células⁴.

La afinidad ultra alta de los fármacos basados en anticuerpos que proporciona selectividad a los antígenos que expresan las células tumorales lo convierten en un agente atractivo. Del mismo modo, la administración dirigida y la retención tumoral de un anticuerpo terapéutico (o un fármaco químico) es la clave para equilibrar la eficacia sobre la toxicidad. Por lo tanto, un gran número de estrategias basadas en la ingeniería de proteínas que incluyen pero no se limitan a biespecíficos⁵ y anticuerpos tri-específicos⁶ están siendo explotados para mejorar significativamente la avidez optimizada de la retención tumoral de la terapia inyectada por vía intravenosa (IV)^5,7. Aquí, describimos un método simple basado en la fluorescencia para abordar la distribución del tumor y el tejido de anticuerpos contra el cáncer potencialmente eficaces.

Debido a que los tejidos animales poseen autofluorescencia cuando se excitan en el espectro visible, los anticuerpos fueron inicialmente etiquetados con un tinte infrarrojo cercano (por ejemplo, IRDye 800CW). Para las pruebas de investigaciones conceptuales, hemos hecho uso del receptor de folato alfa-1 (FOLR1) dirigido a anticuerpos llamados farletuzumab y su derivado llamado activador de citotoxicidad de anclaje biespecí (BaCa)⁷ anticuerpo que se dirige a FOLR1 y receptor de muerte-5 (DR5)⁸ en un anticuerpo recombinante. FOLR1 es un receptor diana sobreexpresado bien definido en células cancerosas de ovario y TNBC, xenoinjertos tumorales y tumores de pacientes^9. En particular, existen múltiples esfuerzos para explotar clínicamente FOLR1 utilizando enfoques basados en anticuerpos para involucrar células efectos inmunes y conjugados de fármacos de anticuerpos (ADC) para cánceres de ovario y de mama^10,11.

En este documento de métodos, clonamos, expresamos y purificamos anti-FOLR1 clínicos (farletuzumab) junto con otros anticuerpos de control utilizando el sistema de expresión CHO. El isotipo IgG1 y un anticuerpo clínico anti-idiotipo mucina-16 llamado abagovomab¹² se utilizaron como controles negativos. Tras la purificación de proteínaS A, los anticuerpos indicados se etiquetaron con IRDye 800CW y se administraron en la vena de la cola de ratones desnudos que tenían xenoinjertos tumorales de ovario o se trans infectaron establemente FOLR1 humano que expresan xenoinjertos de cáncer de colon murino. La localización de anticuerpos fue rastreada por imágenes en vivo utilizando espectro de imágenes in vivo en múltiples puntos de tiempo diferentes^7. Este método no requiere ninguna modificación genética o inyección del sustrato para permitir la emisión de luz y es significativamente más rápido, rentable y eficiente. El protocolo general de clonación, expresión, purificación y etiquetado descrito a continuación se puede aplicar a cualquier anticuerpo clínico y no clínico si hay secuencias de cadena pesadas y ligeras disponibles.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con el manejo de animales y estudios de xenoinjertos tumorales fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) aquí en la Universidad de Virginia y se ajustan a las normas regulatorias pertinentes

1. Expresión y purificación de anticuerpos

1. Mantenimiento de células CHO
   1. Cultivar células CHO en FreeStyle CHO Media complementado con suplemento de glutamina 1x disponible comercialmente a 37 oC agitando a 130 rpm con 5% CO₂ usando matraz Delong Erlenmeyer ya sea de vidrio o desechable.
      NOTA: Se recomienda utilizar un matraz desconcertado con tapa ventilada para aumentar la agitación y mejorar la transferencia de gas durante la condición de agitación. Se ha obtenido un rendimiento de anticuerpos significativamente reducido con matraces regulares (no desconcertados) debido a la agitación limitada del cultivo de suspensión.
   2. Mantenga el número de celda entre 1-5 x 10⁶ células/ml con >95% de viabilidad celular. Si el número de celda aumenta más de 5 x 10⁶ celdas/ml, divida las celdas. Nunca permite que las células CHO alcancen por debajo de 0,2 x 10⁶ células/ml.
2. Transfección de células CHO
   1. Cultivar células CHO en 200 ml de medios (2 x 10⁶ células/ml) en matraces deslong Erlenmeyer desconcertados.
      NOTA: Los cultivos de suspensión cultivados en matraces desconcertados siempre han producido mayores rendimientos proteicos en comparación con cuando se cultivan en matraces no desconcertados.
   2. En un tubo de 15 ml, toma 5 ml de medios CHO FreeStyle y añade 50 g de ADN clon de VH y 75 g de ADN clon de VL. Vórtice para mezclar bien.
   3. Incubar la mezcla de ADN a temperatura ambiente durante 5 min.
      NOTA: Una incubación más larga reduce los rendimientos proteicos.
   4. Añadir 750 l de 1 mg/ml de material de polietilenimina (PEI) a la solución de ADN y vórtice agresivamente la mezcla durante 30 s. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min adicionales.
      NOTA: PEI debe hacerse fresco. El ciclo de deshielo de congelación múltiple de PEI reduce significativamente el rendimiento general.
   5. Añadir toda la mezcla de ADN y PEI en las células mientras agita manualmente el matraz. Incubar inmediatamente los matraces deslong Erlenmeyer desconcertados con células a 37oC agitando a 130 rpm.
3. Expresión
   NOTA: El anticuerpo tiene péptido de señal secretora diseñado para su extremo N-terminal, que ayuda a los anticuerpos a ser secretados en los medios.
   1. Cultivar las células trans infectadas a 37 oC, con temblores a 130 rpm en el día 1.
   2. En el Día 2, agregue 2 ml de 100x agente anti-clumping y 2 ml de solución antibacteriana anti-micótica 100x. Cambie el matraz a una temperatura más baja (32-34 oC), con agitación a 130 rpm.
   3. En cada quinto día, añadir 10 mL de pienso de triptona N1, y 2 ml de suplemento de glutamina 100x.
   4. Siga contando las células cada tercer día usando hemocitociómetro después de manchar una alícuota de células con mancha azul tripano. Asegúrese de que la viabilidad celular permanezca por encima del 80%.
   5. En el Día 10 u 11, cosecha el medio para la purificación de anticuerpos. Gire el cultivo a 3000 x g,4 oC durante 40-60 min y luego filtre los medios transparentes utilizando filtros de botella de 0,22 oM.
4. Purificación
   NOTA: La purificación de anticuerpos se realiza utilizando una columna Protein-A disponible comercialmente (ver Tabla de Materiales),utilizando una bomba peristáltica.
   1. Equilibrar la columna con un volumen de dos columnas de tampón de unión (fosfato sódico de 20 mM a pH 7,4).
   2. Pasar el medio filtrado que contiene anticuerpos (obtenidos en el paso 1.3.5) a través de la columna a un caudal de 1 ml/min.
   3. Lave la columna con un volumen de dos columnas del búfer de enlace.
   4. Eluir el anticuerpo en fracciones de 500 ml utilizando un tampón de elución de 5 ml (30 mM de acetato de sodio a pH 3,4).
   5. Neutralizar el pH del anticuerpo eluido añadiendo 10 ml de tampón de neutralización (3 M de acetato de sodio a pH 9) por fracción.
      NOTA: La fracción número 3-6 contiene la mayor parte del anticuerpo. Es aconsejable mantener todas las fracciones en caso de que el anticuerpo se eluda en una fracción posterior de lo esperado.
   6. Mida la concentración de anticuerpos purificados utilizando un espectrofotómetro seleccionando el protocolo predeterminado para IgG. La concentración final del anticuerpo se obtiene en mg/ml teniendo en cuenta el peso molecular y el coeficiente de absorción.

2. Etiquetado fluorescente

NOTA: Los anticuerpos se etiquetan con el tinte infrarrojo que contiene un grupo reactivo de éster DEL NHS, que se acopla a las proteínas y forman un conjugado estable. Esta reacción es sensible al pH y funciona mejor a pH 8,5. Los conjugados fluorescentes etiquetados con el tinte muestran un máximo de absorción de 774 nm, y un máximo de emisión de 789 nm. pH 8.5 es clave para una conjugación efectiva.

1. Dialyze 0,5 ml del anticuerpo utilizando un casete de diálisis (0,1-0,5 ml) en 1 L de tampón de conjugación (tampón de fosfato de 50 mM a pH 8,5). Después de 4 horas, transfiera el cassette de diálisis a un tampón fresco y dialyze durante la noche.
2. Configure una reacción de conjugación añadiendo 0,03 mg de IRDye 800CW por 1 mg de anticuerpo en un volumen de reacción de 500 l.
   NOTA: IRDye 800CW se disuelve en DMSO a una concentración de 10 mg/ml.
3. Llevar a cabo reacciones de etiquetado durante 2 h a 20oC.
   NOTA: Aumentar el tiempo más allá de 2 h no mejora el etiquetado.
4. Purificar conjugados etiquetados por diálisis extensa contra 1x PBS.
5. Estimar el grado de etiquetado midiendo la absorbancia del tinte a 780 nm y absorbancia de la proteína a 280 nm. La contribución del tinte a la señal de 280 nm es del 3%.
6. Calcule la relación colorante/proteína utilizando esta fórmula:
   
   donde 0,03 es un factor de corrección para la absorbancia del tinte utilizado a 280 nm (igual al 3,0 % de su absorbancia a 780 nm), ε_Dye y ε_Protein son coeficientes de extinción molar para el tinte y la proteína (anticuerpo) respectivamente.
   NOTA: ε_Dye es 270,000 M^-1 cm^-1 y ε_Protein es 203,000 M^-1 cm^-1 (para un IgG típico) en 1:1 mezcla de PBS: metanol. Las proteínas distintas de IgG pueden tener coeficientes de extinción molar muy diferentes. El uso del coeficiente de extinción correcto para la proteína de interés es esencial para la determinación precisa de la relación D/P.
7. Calcule la concentración final de proteína utilizando esta fórmula:
   
   NOTA: Confirme siempre la eficacia de unión a antígenos de anticuerpos etiquetados y no etiquetados utilizando ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas) o citometría de flujo antes de proceder a estudios in vivo.

3. Estudios de xenoinjertos de ratón

1. Preparación de células tumorales inyectables
   1. Cultivar células OVCAR-3 en RPMI-1640 Medio, complementado con 10% de FBS y 1x penicilina-estreptomicina.
   2. El día antes de la inyección, las células de la subcultura se convierten en nuevos platos de cultivo de 100 mm con 10 ml de medio/plato completo. Utilice el número de celda de 0.5-1 x 10⁶ células/plato.
   3. Incubar cultivos a 37oC de temperatura, 95% de humedad y 5% de_CO2 durante 20-24 h.
   4. El día de la inyección, retire el medio de crecimiento de los platos de cultivo. Enjuague bien la capa celular con Ca²⁺/Mg²⁺ la solución salina libre de Dulbecco (DPBS) para eliminar las células muertas, los desechos celulares y todos los rastros de suero, que pueden interferir en la acción de la tripsina.
   5. Pruebe las células añadiendo 1,0-1,5 ml de solución de Trypsin-EDTA a cada plato y trate de extender la solución inclinando el plato por todas partes seguido de incubación a 37 oC durante 5-10 min.
      NOTA: Observe las células bajo un microscopio invertido para comprobar el estado real de la tripsinación. Bajo la tripsinación resulta en un menor número de desprendimiento celular de la superficie de la placa de cultivo, sobre la tripinanización induce estrés celular. Por lo tanto, la tripsinación adecuada es importante.
   6. Añadir 1.0-1.5 mL de medio de crecimiento completo a cada plato para detener la acción de la trippsina, después de que re-suspenda las células por pipeteo suavemente.
      NOTA: El pipeteo suave es importante para mantener la salud celular.
   7. Recoger la suspensión celular en un tubo cónico de 15 ml y girar a 250 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
   8. Recoger el pellet celular después de quitar el sobrenadante y lavar las células mediante la re-suspensión del pellet en 1x DPBS.
   9. Gire la suspensión celular a baja velocidad 250 x g durante 5 min.
   10. Agregue 500 l de DPBS y vuelva a suspender las células mediante pipeteo suave para obtener una sola celda de suspensión.
   11. Recuento de células mediante hemocitociómetro o contador automático de células.
       NOTA: Para una mejor precisión, repita el conteo tres veces y tome un promedio.
   12. Ajuste el volumen de tal manera que la densidad final de la celda sea de 1 x 10⁸ celdas/ml.
2. Inyección subcutánea de células para desarrollar xenoinjertos de ratón
   NOTA: Todos los procedimientos deben realizarse en un gabinete de seguridad BSL2. Athymic Nude Foxn1^nu/Foxn1⁺ ratones se han utilizado en el estudio actual.
   1. Tome 50 l de la suspensión celular en un tubo de 1,5 ml y mezcle con 50 ml de medio de matriz de membrana del sótano.
      NOTA: El medio de matriz de membrana sótano tiende a formar un gel como estado a temperatura ambiente, así que mantenga cuidadosamente las células y la mezcla media de matriz en hielo. Es aconsejable mantener tubos, puntas y jeringas en la nevera y luego transferirlos en hielo antes de la inyección animal.
   2. Agitar la mezcla para evitar cualquier aglutinamiento celular. A continuación, tome este 100 l de la mezcla media de matriz de suspensión celular que contiene 5 x 10⁶ células, en una jeringa de 1 cc.
   3. Levante suavemente la piel del animal para separar la piel de la capa muscular subyacente e inyecte lentamente la suspensión celular (100 l) debajo de la piel (5 x 10⁶ células), con una aguja de 26 G. Espere unos segundos antes de sacar la aguja, para que el medio de matriz del sótano pueda formar el gel semisólido como estructura junto con las células debajo de la piel, evitando que la mezcla salga del lugar de la inyección.
      NOTA: Las células deben ser probadas antes de la inyección para detectar cualquier contaminación que pueda dañar a ratones inmunodeficientes. Durante la inyección no coloque la aguja demasiado profunda en la piel, ya que esto puede formar el tumor más profundo de lo esperado.
   4. Mantener al animal en una jaula estéril y observar durante unos 20 minutos.
   5. Observe a los ratones durante 2-3 semanas y permita que el tumor crezca hasta 500 mm³ de tamaño.

4. Localización de anticuerpos mediante un sistema de imágenes in vivo

NOTA: El equipo de imágenes in vivo (ver Tabla de Materiales)utilizado en este experimento utiliza un conjunto de filtros de alta eficiencia y algoritmos espectrales de desmezcla para la visualización no invasiva y el seguimiento de la actividad celular y genética dentro de un organismo vivo en tiempo real. El sistema proporciona capacidad de monitoreo de fluorescencia y bioluminiscencia.

1. Inyectar 25 g de anticuerpos etiquetados con tinte a través de la vena de la cola.
   1. Anestesia a los ratones con tumor usando 2% de isoflurano. Compruebe la falta de respuesta a los reflejos del pedal.
   2. Una vez que los ratones dejen de moverse, dilate la vena lateral de la cola aplicando agua de gusano.
   3. Inyectar 25 g (en 100 oL) de anticuerpo etiquetado utilizando jeringa de insulina de 1 cc con una aguja de 26 G.
   4. Del mismo modo, como control negativo, etiquete e inyecte el anticuerpo isotipo IgG1 no específico que no se dirige a las células cancerosas.
2. Realizar imágenes en vivo in vivo después de 8, 24, 48 h, etc. de inyecciones de anticuerpos.
   1. En el software asociado, haga clic en Inicializar ubicado en el panel de control y confirme que la temperatura de la etapa es de 37 oC.
   2. Encienda el suministro de oxígeno, todas las bombas en el sistema de anestesia, el suministro de gas isoflurano a la cámara anestésica y ajuste la válvula vaporizadora de isoflurano al 2%.
   3. Transfiera los ratones a la cámara anestésica y espere a que los ratones estén completamente anestesiados. Aplique la pomada lubricante para los ojos para evitar el secado de sus ojos.
   4. Vaya al panel de control,configure la imagen de fluorescencia a través de la opción Asistente de imágenes y seleccione la excitación a 773 nm y la emisión a 792 nm.
      NOTA: Los ajustes de exposición automática predeterminados proporcionan una buena imagen fluorescente. Sin embargo, las preferencias de exposición automática se pueden modificar según las necesidades.
   5. Transfiera los ratones anestesiados a la cámara de imágenes y enséñelos en el campo de la imagen usando cono nasal. La etapa de diagnóstico por imágenes ofrece la opción de acomodar 5 ratones a la vez.
      NOTA: Haga que los ratones de control sean imageados junto con los ratones de prueba para tener una cantidad similar de exposición y otros ajustes durante el análisis.
   6. Una vez que todo esté listo, seleccione la opción Adquirir en el panel de control para la adquisición de la imagen.
   7. Con la configuración de Autoexposición, el sistema genera la imagen en un minuto. La imagen generada es la superposición de fluorescencia en la imagen fotográfica con intensidad de fluorescencia óptica mostrada en unidades de recuentos o fotones, o en términos de eficiencia.
   8. Después de adquirir la imagen, transfiera los ratones de la cámara de imágenes de vuelta a su jaula y observe su recuperación durante 1 a 2 minutos.
3. Ajuste la imagen aún más con las herramientas y funciones proporcionadas dentro del software para el análisis de imágenes. Las herramientas de análisis de imágenes se encuentran en la barra de menús y la paleta de herramientas.
   1. En Ajuste de imagen, ajuste el brillo, el contraste u opacidad y seleccione la escala de color.
   2. Utilice las Herramientas de ROI para especificar una región de interés (ROI) en una imagen óptica y medir la intensidad de la señal dentro del ROI. Si es necesario, exporte los datos de señal cuantificados a un software de hoja de cálculo y trace los datos.
   3. Para estudios de seguimiento, analice las necropsias en ratones de diversos tejidos (por ejemplo, hígado, pulmón, corazón, riñón, bazo, cerebro, etc.) lado a lado para una distribución detallada no específica de anticuerpos con etiqueta fluorescente.
      NOTA: Los datos se pueden seguir apoyando con elISA específico del tejido haciendo uso del antígeno (FOLR1 en este caso) en 96 ensayos de pozos.

Resultados

En la metodología descrita, primero clonamos anticuerpos dirigidos al receptor de folato alfa-1 (FOLR1) llamado farletuzumab, y un anticuerpo biespecífico llamado BaCa que consiste en farletuzumab y lexatumumab junto con anticuerpos de control como abagovomab (secuencias proporcionadas en el Archivo Suplementario 1). Los detalles de los dominios representativos de la variable pesada (VH) y de la luz variable (VL) en los clones de ADN (pVH, pVL) se muestran en la Figura 1A. P...

Discusión

La administración selectiva y específica del tejido tumoral del agente terapéutico contra el cáncer es la clave para medir la eficacia y la seguridad de una terapia dirigida determinada¹³. Aquí hemos descrito un enfoque rápido y eficiente para investigar la distribución detallada del tejido y tumoral de la clínica, farletuzumab y un anticuerpo BaCa no clínico. El enfoque descrito es aplicable a cualquier anticuerpo recién generado y se puede utilizar junto con un anticuerpo clínicamente eficaz (co...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Medios FreeStyle CHO	Gibco Life Technologies	Cat # 12651-014
Anti-Anti (100X)	Gibco Life Technologies	Cat # 15240-062
Agente antiaglomerante	Gibco Life Technologies	Cat # 01-0057DG
BD Jeringa de insulina	BD BioSciences	Cat #329420
Pinza IVIS Spectrum	PerkinElmer	Cat #124262
CHO CD EfficientFeed B	Gibco Life Technologies	Cat #A10240-01
Corning 500 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)	Corning	Cat # 10-13-CV
Corning 500 mL RPMI 1640	Corning	Cat # 10-040-CV
Cy5 conjugado Anti-Human IgG (H + L)	Jackson ImmunoResearch	Cat # 709-175-149
GlutaMax-I (100X)	Gibco Life Technologies	Cat # 35050-061
Kit de Maxiprep de plásmido HiPure	Invitrogen	Cat # K21007
HiTrap MabSelect SuRe Columna	GE Healthcare	Cat # 11-0034-93
Infusión	Takara BioScience	STO344
IRDye 800CW NHS Ester	LI-COR	Cat # 929-70020
Isoflurano, USP	Covetrus	Cat # 11695-6777-2
Ungüento lubricante para los ojos	Refresh Lacri-Lube	Cat #4089
Matrigel	Corning	Cat # 354234
reactivo de transfección PEI	Thermo Fisher	Cat # BMS1003A
Slide-A-Lyzer Casetes de diálisis	Thermo Scientific	Cat # 66333
Steritop Vacuum Filtros	Millipore Express	Cat #S2GPT02RE
Trypsin-EDTA	Gibco Life Technologies	Cat # 15400-054
Experimental Models: Líneas celulares
Human: OVCAR-3	American Type Culture Collection	ATCC HTB-161
Humano: Células CHO-K	Estables transformado en nuestro laboratorio	ATCC CCL-61
Ratón: 4T1	Amable regalo del Dr. Chip Landen, UVA
Ratón: MC38	Amable regalo de la Dra. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC	Autenticado por STR
Ratón: MC38 hFOLR1	Generado en nuestro laboratorio (Este artículo)
Modelos experimentales: Animales
Ratones: Desnudo atímico Foxn1nu/Foxn1+	Envigo	Órdenes Múltiples Ratones
: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ	Laboratorio Jackson	Órdenes Múltiples