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Localización y cuantificación de begomovirus en tejidos de mosca blanca por inmunofluorescencia y PCR cuantitativa

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DOI:

10.3791/60731

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8 de febrero de 2020

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1Ministry of Agriculture Key Laboratory of Molecular Biology of Crop Pathogen and Insects, Institute of Insect Sciences, Zhejiang University

En este artículo

Resumen

Describimos un método de inmunofluorescencia y PCR cuantitativo para la localización y cuantificación de begomovirus en tejidos de insectos. El protocolo de inmunofluorescencia se puede utilizar para colocalizar proteínas virales y vectoriales. El protocolo cuantitativo de PCR puede ampliarse para cuantificar los virus en cuerpos enteros de moscas blancas y plantas infectadas por virus.

Resumen

Los begomovirus (género Begomovirus,familia Geminiviridae)son transmitidos por las moscas blancas del complejo Bemisia tabaci de una manera persistente y circulativa. Teniendo en cuenta los extensos daños causados por los begomovirus a la producción de cultivos en todo el mundo, es imperativo entender la interacción entre los begomovirus y su vector de mosca blanca. Para ello, la localización y cuantificación del virus en los tejidos vectoriales es crucial. Aquí, utilizando el virus del rizo de hoja amarilla de tomate (TYLCV) como ejemplo, describimos un protocolo detallado para localizar begomovirus en las moscas blancas, glándulas salivales primarias y ovarios por inmunofluorescencia. El método se basa en el uso de anticuerpos específicos contra una proteína de capa de virus, anticuerpos secundarios etiquetados con tinte y un microscopio confocal. El protocolo también se puede utilizar para colocalizar proteínas begomovirales y de mosca blanca. Además, describimos un protocolo para la cuantificación de TYLCV en las moscas blancas, las glándulas salivales primarias, la hemolinfa y los ovarios por PCR cuantitativo (qPCR). Utilizando imprimaciones diseñadas específicamente para TYLCV, los protocolos para la cuantificación permiten la comparación de la cantidad de TYLCV en diferentes tejidos de la mosca blanca. El protocolo descrito es potencialmente útil para la cuantificación de begomovirus en el cuerpo de una mosca blanca y una planta infectada por el virus. Estos protocolos se pueden utilizar para analizar la vía de circulación de begomovirus en la mosca blanca o como complemento a otros métodos para estudiar las interacciones entre mosca blanca y begomovirus.

Introducción

En las últimas décadas, los begomovirus (género Begomovirus,familia Geminiviridae)han causado graves daños a la producción de muchos cultivos vegetales, de fibra y ornamentales en todo el mundo1. Los begomovirus son transmitidos de manera persistente por la mosca blanca Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae), que es una especie compleja que contiene más de 35 especies crípticas2,3. Los begomovirus pueden afectar directa o indirectamente a la fisiología y el comportamiento de las moscas blancas, como la fecundidad4,la longevidad4y la preferencia del huésped5,6. Además, la eficiencia de transmisión de una especie/cepa de begomovirus determinada varía para diferentes especies crípticas de mosca blanca incluso en las mismas condiciones experimentales7,8,9,10, lo que indica que hay una interacción compleja entre begomovirus y moscas blancas. Para comprender mejor los mecanismos subyacentes a las interacciones entre mosca blanca y begomovirus, la localización y cuantificación del virus en los tejidos de mosca blanca son esenciales.

El virus del rizo de hoja amarilla de tomate (TYLCV) es un begomovirus que se notificó por primera vez en Israel pero que hoy en día causa graves daños a la producción de tomate en todo el mundo11,12. Debido a su importancia económica, es uno de los begomovirus13mejor estudiados. Al igual que otros begomovirus monopartitos, TYLCV es un virus de ADN circular de una sola cadena con un tamaño de genoma de aproximadamente 2.800 nucleótidos14. Mientras todavía está en debate, varias líneas de evidencia apoyan la replicación de TYLCV en las moscas blancas15,16,17. Además, se ha notificado la interacción de partículas TYLCV y proteínas de mosca blanca6,18,19,20. Para la transmisión del virus, las moscas blancas adquieren TYLCV alimentándose de plantas infectadas por virus, los viriones pasan a lo largo del canal de alimentos para llegar al esófago, penetran en la pared del intestino medio para llegar a la hemolinfa y luego se translocan en las glándulas salivales primarias (PSG). Finalmente, los viriones se egasíd con saliva a lo largo del conducto salival en el phloem vegetal21. Además, varios estudios muestran que TYLCV es capaz de ser transmitido transovarialmente de las moscas blancas hembras a su descendencia22,23. En otras palabras, para lograr una transmisión productiva, el virus tiene que superar las barreras celulares dentro de la mosca blanca para transubicarse de un tejido a otro. Durante el cruce de estas barreras, es probable que se produzcan interacciones entre las moscas blancas y las proteínas del virus, probablemente determinando la eficiencia con la que se transmiten los virus.

La inmunofluorescencia es una técnica comúnmente utilizada para el análisis de distribución de proteínas. La especificidad de los anticuerpos que se unen a su antígeno forman la base de la inmunofluorescencia. Debido a la importancia económica de TYLCV, se han desarrollado anticuerpos monoclonales contra la proteína de recubrimiento TYLCV, ofreciendo una forma altamente sensible de localizar el virus24. El PCR cuantitativo (qPCR) permite la cuantificación sensible y específica de los ácidos nucleicos. Esta técnica se basa con mayor frecuencia en el uso de sonda de hidrólisis (por ejemplo, TaqMan) o detección de tinte fluorescente (por ejemplo, SYBR Green). Para el qPCR basado en sondas de hidrólisis, se necesitan sondas específicas, lo que en consecuencia aumenta el costo. El qPCR basado en tintes fluorescentes es más simple y rentable, ya que las sondas de hibridación específicas del amplificador etiquetadas no son necesarias25. Hasta ahora, varios estudios han utilizado inmunofluorescencia y qPCR junto con otros métodos para investigar las complejas interacciones begomovirus-mosca blanca. Por ejemplo, Pan et al. realizaron un análisis qPCR e inmunofluorescencia del virus en tejidos de mosca blanca y encontraron que la diferencia en la capacidad de transmitir el virus del brote rizado de tabaco (TbCSV) entre las especies de moscas blancas AsiaII 1 y Asia Medio Menor 1 (MEAM1) se debía a que el virus era capaz de cruzar eficientemente la pared intermedia de AsiaII1 pero no MEAM18. Del mismo modo, mientras que las moscas blancas mediterráneas (MED) pueden transmitir fácilmente TYLCV, no transmiten el virus de China curva de hoja amarilla de tomate (TYLCCNV). La transmisión selectiva se investigó utilizando la detección de inmunofluorescencia de virus en los PSG, lo que demostró que TYLCCNV no cruza fácilmente los PSG de las moscas blancas MED26. La colocalización de inmunofluorescencia de TYLCV CP y la proteína marcadora de autofagia ATG8-II en las moscas blancas muestran que la autofagia desempeña un papel crítico en la represión de la infección de TYLCV en la mosca blanca27.

Aquí, utilizando TYLCV como ejemplo, describimos un protocolo para la localización de begomovirus en las moscas blancas, PSG y ovarios mediante una técnica de inmunofluorescencia. La técnica incluye disección, fijación e incubación con anticuerpos secundarios primarios y etiquetados con tinte. Las señales de fluorescencia que muestran la ubicación de las proteínas virales en los tejidos de las moscas blancas se pueden detectar bajo un microscopio confocal. Más importante aún, este protocolo se puede utilizar para colocalizar proteínas begomovirales y de mosca blanca. Además, describimos un protocolo para la cuantificación de TYLCV utilizando qPCR basado en SYBR Green en los intestinos medios de mosca blanca, PSG, hemolinfa y ovarios, que se puede utilizar para comparar la cantidad de virus en diferentes muestras de tejido de mosca blanca.

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Protocolo

1. Whitefly, Virus, Plantas y Adquisición del Virus

  1. Las moscas blancas traseras (MEAM1) sobre el algodón (Gossypium hirsutum cv. Zhemian 1793) en jaulas a prueba de insectos en un invernadero a 26 oC con una luz de 14:10: ciclo oscuro y 60 a 10% de humedad relativa.
  2. Realizar PCR convencional basado en el gen de citocromo oxidasa I mitocondrial de mosca blanca para determinar la pureza de la población de mosca blanca.
    1. Recoger 20 moscas blancas adultas y transferirlas individualmente a un tubo de PCR que contenga 30 l de tampón de lisis (10 mM Tris, pH a 8,4, 50 mM KCl, 0,45% [wt/vol] Tween-20, 0,2% [wt/vol] gelatina, 0,45% [vol/vol] Nonidet P 40, 60 g/mL Proteina K).
    2. Añadir de 5 a 7 perlas de cerámica (2 mm de diámetro) en cada tubo pcR y moler las muestras para realizar la lisis tisular.
    3. Incubar todas las muestras a 65 oC durante 1 h seguida sin 10 min a 100 oC, y luego centrifugar brevemente. Utilice este sobrenadante como plantilla para la amplificación de PCR.
      NOTA: El tiempo de incubación a 65 oC se puede aumentar si es necesario.
    4. Preparar la reacción de PCR de la siguiente manera: 1 U de polimerasa de ADN Taq, 2 l de tampón de 10x (con Mg2+),1,6 ml de mezcla dNTP (2,5 mM), 0,5 ml de cada imprimación (10 m cada una), 2 ml de sobrenadante de tejido de mosca blanca y agua destilada doble a un volumen total de 20 ol por reacción. La secuencia de imprimación directa es 5'-TTGATTTTTTGGCCCCAGAAGT-3' y la secuencia de imprimación inversa es 5'-TAATATAGCAGATTAGTGCATTGGA-3'.
      NOTA: Se debe incluir un control negativo en el que el ADN se sustituya por agua libre de nucleasas y un control positivo con ADN de mosca blanca MEAM1 previamente verificado.
    5. Realizar la PCR utilizando los siguientes parámetros de ciclo: desnaturalización inicial a 95 oC durante 3 min, seguido de 35 ciclos de desnaturalización a 95 oC durante 30 s, recocido a 50-55 oC durante 30 s, y extensión a 72 oC durante 1 min, seguido de 72 oC durante 10 min.
    6. Digerir el producto amplificado con la enzima de restricción Taq I. Para ello, prepare la mezcla de digestión con 0,1 l (1 U) de enzima, 1 l de tamp I taq I de 10 x, 1 l de BSA, 5 ml de producto amplificado y agua destilada doble a un volumen total de 10 ml. Incubar a 65oC durante 1 h en un termociclador.
    7. Realice la electroforesis de gel de agarosa de las muestras cargando 5-7 l de cada producto digerido y una escalera de ADN (100-2.000 bp) en los pocillos de un gel de agarosa del 1%. A continuación, observe los tamaños de las bandas de ADN mediante la tinción de color rojo en gel en una máquina de documentación de gel utilizando luz UV. Compare los tamaños de banda de los productos digeridos con el control positivo para determinar la pureza de la población de moscablanca.
  3. Agro-inocular el clon infeccioso de TYLCV (número de adhesión de GenBank AM282874.1) (pBINPLUS-SH2-1.4A) en 3-4 plantas de tomate en etapa de hoja verdadera(Solanum lycopersicum L. cv. Hezuo 903).
    1. Inocular 10 ml de medio Luria-Bertani (LB) que contiene kanamicina (50 g/ml) y rifampicina (50 g/ml) con una sola colonia. Incubar a 28oC con agitación a 200 rpm hasta que el OD600 alcance los 1,5.
    2. Cosecha agrobacterias por centrifugación a 4.000 x g durante 10 min. Deseche el sobrenadante.
    3. Resuspenda los gránulos en 10 ml de tampón de infiltración, que consista en acetosyringona de 200 m, 10 mM 2(N-morpholino) ácido sulfónico de etano (MES) y 10 mM de MgCl2. Incubar a temperatura ambiente (RT) durante 1–2 h.
    4. Infiltre 2–3 hojas de plantas utilizando la mezcla del paso 1.3.3 con una jeringa sin aguja de 1 ml. Mantener las plantas en un invernadero a 26oC.
  4. Aproximadamente 1 mes más tarde, realizar una inspección visual y elegir plantas que muestran la hoja de rizo amarillo y síntomas de acrobacia.
  5. Transfiera a los adultos de mosca blanca no viruliferous a las plantas de tomate infectadas por TYLCV durante 48 horas para la adquisición de virus.

2. Disección y recolección de midguts, glándulas salivales primarias (PSG), ovarios y hemolinfa de moscas blancas femeninas

  1. Recoger moscas blancas usando la aspiración, y luego colocarlos en el hielo para ponerlos en coma. Agregue 1 búfer PBS (solución salina con búfer de fosfato) en una diapositiva del microscopio y, a continuación, coloque las moscas blancas en el búfer 1x PBS para la disección bajo un microscopio estéreo.
    1. Para la disección del intestino medio, rompa el abdomen de la mosca blanca y extraiga el intestino medio con una aguja de acupuntura fina (0,25 mm de diámetro). Transfiera el midgut a pbS limpio 1x.
    2. Para la disección de PSG, rompa el cuerpo de la mosca blanca en el tórax cerca de la cabeza desde el lado dorsal. A continuación, inserte una aguja en el tórax para fijar la mosca blanca, y use otra aguja para agitar la mosca blanca hasta que las dos glándulas salivales estén separadas del cuerpo. Entonces, transfiera los PSG a limpios, 1x PBS.
    3. Para la disección del ovario, rompa completamente el abdomen de la mosca blanca y use una aguja para separar los ovarios de otros tejidos. Luego, retire el exceso de tejidos pipeteando.
    4. Para la colección de hemolinfas, agregue 10 ml de tampón de PBS 1x en una diapositiva del microscopio y, a continuación, coloque una mosca blanca en el tampón. Para obtener la hemolinfa, rasgue suavemente un agujero en el abdomen usando una aguja de acupuntura fina, y presione ligeramente el abdomen para liberar la hemolinfa hacia fuera en el tampón. Recoger 8 l del líquido como muestra de hemolinfa.

3. Localización de TYLCV en Whitefly Midgut, Primary Salivary Glands, and Ovaries by Immunofluorescence

NOTA: El procedimiento para la localización de TYLCV en los midguts se presenta como un ejemplo. El método se puede utilizar para PSG y ovarios.

  1. Disseccioner los intestinos medios en tampón TBS (10 mM Tris-HCl, 150 mM de cloruro de sodio, pH a 7,5) como se describe en el paso 2.2.1. Recoger de 15 a 20 puntos medios de mosca blanca, transferirlos en una placa de vidrio Petri (3,5 cm de diámetro), y luego eliminar el exceso de tampón TBS.
  2. Añadir 1 ml de 4% de paraformaldehído para fijar los midguts durante 2 horas a temperatura ambiente, y luego quitar la solución fijativa. Pipetear lentamente para lavar los midguts 3 veces en TBS durante 2 min cada uno.
  3. Incubar los midguts en 1 mL de 0,5% de Tritón X-100 durante 30 min para permeabilizar. A continuación, retire la solución de permeabilización y lave los intestinos medios 3 veces con TBST (1 tbS con 0,05% de tween 20) como se describe en el paso 3.2.
  4. Añadir 1 mL de 1% de BSA (albúmina sérica bovina preparada en TBST) para bloquear los intestinos medios. Realice el paso de bloqueo en RT durante 2 h y, a continuación, retire la solución de bloqueo y lave los midguts 3 veces en TBST.
  5. Diluir los anticuerpos primarios (MAb 1C4 contra la proteína de recubrimiento TYLCV) a 1:400 con TBST24 y añadir la solución en la placa Petri para sumergir los intestinos medios. Incubar a 4oC durante la noche en la oscuridad. Deseche la solución primaria de anticuerpos y lave 3 veces en TBST.
  6. Diluir los anticuerpos secundarios (antiratón) a la 1:400 con TBST y añadir la solución en la placa Petri para sumergir los intestinos medios. Incubar el plato durante 2 h a RT en la oscuridad. Deseche la solución secundaria de anticuerpos y lave los midguts 3 veces en TBST.
  7. Transfiera los midguts a una diapositiva clara del microscopio. Aspirar tanto TBST fuera de la diapositiva como sea posible. Añadir 1 gota de DAPI (4', 6-diamidino-2-fenilindole, dihidrocloruro) para manchar el núcleo, y luego colocar la cubierta y sellar con esmalte de uñas. Examine bajo un microscopio confocal.

4. Cuantificación de TYLCV en Whitefly Midgut, Glándulas salivales primarias, Hemolinfa y Ovarios con qPCR

  1. Diseccionar los intestinos medios de las moscas blancas, PSG, hemolinfa y ovarios en 1x PBS como se describió anteriormente.
  2. Extraiga el ADN de los intestinos medios, PSG, hemolinfa y ovarios.
    1. Después de la disección, lave los intestinos medios, los PSG y los ovarios en un tampón limpio de 1x PBS de 2 a 3 veces.
    2. Recoger 20 midguts o 20 PSG en 5 s de 1x PBS y transferirlos a una solución de lisis de 25 l. Transfiera cada ovario en 5 s de PBS de 1x y luego transfiera a una solución de lisis de 25 s individualmente.
    3. Moler las muestras de midguts, PSG y ovarios como se describe en el paso 1.2.2.
    4. Recoger 8 l de hemolinfa con 1x PBS en un tubo de PCR, y luego añadir 10 l de solución de lisis. Homogeneizar.
  3. Extraiga ADN de todas las muestras como se describe en 1.2.3.
  4. Prepare dos mezclas maestras qPCR separadas (18 l cada una) para TYLCV y el control interno (gende la actina) de la siguiente manera: 10 ml de mezcla verde SYBR, 0,8 l de cada imprimación (10 oM cada una) y 6,4 ml de agua destilada doble por reacción. Para TYLCV, la secuencia de imprimación directa es 5o-GAAGCCAGCAGGCGATATAA-3o y la secuencia de imprimación inversa es 5o-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3o. Para la acción, la secuencia de imprimación directa es 5o-TCTTCCAGCCATCCTTCTTG-3o y la secuencia de imprimación inversa es 5o-CGGTGATTTCCTTCTGCATT-3o.
  5. Dispensar 18 l de la mezcla maestra en viales de tubos de tira qPCR o una placa de 96 pocillos. A continuación, añada 2 s de las muestras de ADN en cada vial. Realice todas las reacciones con al menos tres réplicas técnicas y tres réplicas biológicas.
    NOTA: El paso 4.5 debe realizarse sobre hielo.
  6. Cierre los tubos qPCR o cierre las 96 placas de pozo con sello de placa adhesiva.
  7. Centrífuga para recoger el líquido en la parte inferior de los tubos qPCR o 96 placas de pozo.
  8. Coloque los tubos o la placa en el ciclor térmico en tiempo real y realice qPCR.
    1. Realizar el qPCR utilizando los siguientes parámetros de ciclo: 95 oC para 30 s, seguido de 40 ciclos de 95 oC para 5 s y 60 oC para 34 s para recocido de imprimación y elongación, 1 ciclo a 95 oC para 15 s, terminando con un paso de curva de fusión de 60 oC a 95 oC con un incremento de 0,5 oC por 15 s.
    2. Elija SYBR como el tinte de fluoróforo y desconocido como tipo de muestra.
  9. Exporte los datos cuantitativos a un formato de hoja de cálculo y analice la cantidad relativa de ADN viral por el método2.

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Resultados

Las moscas blancas MEAM1 del complejo B. tabaci y TYLCV se utilizaron como ejemplo aquí para describir los procedimientos. La descripción general de los procedimientos de inmunofluorescencia y cuantificación viral descritos en este manuscrito se muestra en la Figura 1. La Figura 2 muestra resultados representativos de la detección de inmunofluorescencia de tinción TYLCV y DAPI en PSG, midguts y ovarios, lo que indica que TYLCV acumuló más en los PSG y m...

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Discusión

Aquí describimos un protocolo para la localización y cuantificación de un begomovirus en los tejidos de su vector de mosca blanca por inmunofluorescencia y qPCR. La disección representa el primer paso para localizar y cuantificar el virus en los tejidos de mosca blanca. El cuerpo de la mosca blanca es de aproximadamente 1 mm de longitud, lo que significa que los tejidos son extremadamente pequeños, y es difícil diseccionarlos. Además, hay fuertes conexiones entre los tejidos. Por ejemplo, los ovarios están estrechamente ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional De Investigación y Desarrollo Clave (Número de subvención: 2017YFD0200600), el fondo destinado al Sistema de Investigación Agrícola de China (número de subvención: CARS-23-D07) y la Fundación Bill & Melinda Gates (Investment ID OPP11497777 ). Agradecemos al Profesor Jian-Xiang Wu por proporcionar anticuerpos TYLCV CP.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
4% ParaformaldehídoMultiSciencesF0001
4',6-diamidino-2-phé nylindole (DAPI)Abcamab104139
Albúmina sérica bovina (BSA)MultiSciencesA3828
CFX Connect Sistema de detección de PCR en tiempo realBio-RAD185-5201
Microscopía confocalZeissLSM800
Dylight 549 anti-ratón de cabraEarthoxE032310-02Anticuerpo secundario
Monoclonal anticuerpo (MAb 1C4)Anticuerpo primario
solución salina tamponada con fosfato (PBS)Sangon BiotechB548119-0500
Microscopio estereoscópicoZeissStemi 2000-C
TB verde premix Ex Taq (Tli RNasa H Plus)TaKaRaRR820AqPCR master mix
TermocicladorThermofisherA41182
TissuelyzerShaghai jingxinTissuelyser-48
Triton-X-100BBI ciencias de la vida9002-93-1
Tween 20BBI ciencias de la vida9005-64-5

Referencias

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