Localización y cuantificación de begomovirus en tejidos de mosca blanca por inmunofluorescencia y PCR cuantitativa

Summary

Describimos un método de inmunofluorescencia y PCR cuantitativo para la localización y cuantificación de begomovirus en tejidos de insectos. El protocolo de inmunofluorescencia se puede utilizar para colocalizar proteínas virales y vectoriales. El protocolo cuantitativo de PCR puede ampliarse para cuantificar los virus en cuerpos enteros de moscas blancas y plantas infectadas por virus.

Abstract

Los begomovirus (género Begomovirus,familia Geminiviridae)son transmitidos por las moscas blancas del complejo Bemisia tabaci de una manera persistente y circulativa. Teniendo en cuenta los extensos daños causados por los begomovirus a la producción de cultivos en todo el mundo, es imperativo entender la interacción entre los begomovirus y su vector de mosca blanca. Para ello, la localización y cuantificación del virus en los tejidos vectoriales es crucial. Aquí, utilizando el virus del rizo de hoja amarilla de tomate (TYLCV) como ejemplo, describimos un protocolo detallado para localizar begomovirus en las moscas blancas, glándulas salivales primarias y ovarios por inmunofluorescencia. El método se basa en el uso de anticuerpos específicos contra una proteína de capa de virus, anticuerpos secundarios etiquetados con tinte y un microscopio confocal. El protocolo también se puede utilizar para colocalizar proteínas begomovirales y de mosca blanca. Además, describimos un protocolo para la cuantificación de TYLCV en las moscas blancas, las glándulas salivales primarias, la hemolinfa y los ovarios por PCR cuantitativo (qPCR). Utilizando imprimaciones diseñadas específicamente para TYLCV, los protocolos para la cuantificación permiten la comparación de la cantidad de TYLCV en diferentes tejidos de la mosca blanca. El protocolo descrito es potencialmente útil para la cuantificación de begomovirus en el cuerpo de una mosca blanca y una planta infectada por el virus. Estos protocolos se pueden utilizar para analizar la vía de circulación de begomovirus en la mosca blanca o como complemento a otros métodos para estudiar las interacciones entre mosca blanca y begomovirus.

Introduction

En las últimas décadas, los begomovirus (género Begomovirus,familia Geminiviridae)han causado graves daños a la producción de muchos cultivos vegetales, de fibra y ornamentales en todo el mundo¹. Los begomovirus son transmitidos de manera persistente por la mosca blanca Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae), que es una especie compleja que contiene más de 35 especies crípticas^2,3. Los begomovirus pueden afectar directa o indirectamente a la fisiología y el comportamiento de las moscas blancas, como la fecundidad^4,la longevidad

Protocol

1. Whitefly, Virus, Plantas y Adquisición del Virus

1. Las moscas blancas traseras (MEAM1) sobre el algodón (Gossypium hirsutum cv. Zhemian 1793) en jaulas a prueba de insectos en un invernadero a 26 oC con una luz de 14:10: ciclo oscuro y 60 a 10% de humedad relativa.
2. Realizar PCR convencional basado en el gen de citocromo oxidasa I mitocondrial de mosca blanca para determinar la pureza de la población de mosca blanca.
   1. Recoger 20 moscas blancas adultas y transferirlas individualmente a un tubo de PCR que contenga 30 l de tampón de lisis (10 mM Tris, pH a 8,4, 50 mM KCl, 0,45% [wt/vol] Tween-20, 0,2% [wt/vol] gelatina, 0,45% [vol/vol]....

Results

Las moscas blancas MEAM1 del complejo B. tabaci y TYLCV se utilizaron como ejemplo aquí para describir los procedimientos. La descripción general de los procedimientos de inmunofluorescencia y cuantificación viral descritos en este manuscrito se muestra en la Figura 1. La Figura 2 muestra resultados representativos de la detección de inmunofluorescencia de tinción TYLCV y DAPI en PSG, midguts y ovarios, lo que indica que TYLCV acumuló más en los PSG y m.......

Discussion

Aquí describimos un protocolo para la localización y cuantificación de un begomovirus en los tejidos de su vector de mosca blanca por inmunofluorescencia y qPCR. La disección representa el primer paso para localizar y cuantificar el virus en los tejidos de mosca blanca. El cuerpo de la mosca blanca es de aproximadamente 1 mm de longitud, lo que significa que los tejidos son extremadamente pequeños, y es difícil diseccionarlos. Además, hay fuertes conexiones entre los tejidos. Por ejemplo, los ovarios están estrechamente .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% Paraformaldehído	MultiSciences	F0001
4',6-diamidino-2-phé nylindole (DAPI)	Abcam	ab104139
Albúmina sérica bovina (BSA)	MultiSciences	A3828
CFX Connect Sistema de detección de PCR en tiempo real	Bio-RAD	185-5201
Microscopía confocal	Zeiss	LSM800
Dylight 549 anti-ratón de cabra	Earthox	E032310-02	Anticuerpo secundario
Monoclonal anticuerpo (MAb 1C4)			Anticuerpo primario
solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Sangon Biotech	B548119-0500
Microscopio estereoscópico	Zeiss	Stemi 2000-C
TB verde premix Ex Taq (Tli RNasa H Plus)	TaKaRa	RR820A	qPCR master mix
Termociclador	Thermofisher	A41182
Tissuelyzer	Shaghai jingxin	Tissuelyser-48
Triton-X-100	BBI ciencias de la vida	9002-93-1
Tween 20	BBI ciencias de la vida	9005-64-5