Creación de sistemas de dimerización de proteínas altamente específicos inducidos químicamente por la selección de fagos escalonados de una biblioteca combinatoria de anticuerpos de un solo dominio

Luis Gomez-Castillo; Kurumi Watanabe; Huayi Jiang; Shoukai Kang; Liangcai Gu

doi:10.3791/60738

Method Article

Creación de sistemas de dimerización de proteínas altamente específicos inducidos químicamente por la selección de fagos escalonados de una biblioteca combinatoria de anticuerpos de un solo dominio

DOI:

10.3791/60738

⸱

January 14th, 2020

Luis Gomez-Castillo*¹ , Kurumi Watanabe*¹ , Huayi Jiang*¹ , Shoukai Kang¹ , Liangcai Gu¹

¹Department of Biochemistry and Institute for Protein Design, University of Washington

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La creación de sistemas de dimerización de proteínas inducidos químicamente con la afinidad y especificidad deseadas para cualquier ligando de moléculas pequeñas dado tendría muchas aplicaciones de detección y accionamiento biológico. Aquí, describimos un método eficiente y generalizable para la ingeniería de novo de sistemas de dimerización inducidos químicamente a través de la selección escalonada de una biblioteca combinatoria de anticuerpos de un solo dominio visualizada por fago.

Abstract

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Los eventos de dimerización de proteínas que se producen sólo en presencia de un ligando de moléculas pequeñas permiten el desarrollo de biosensores de moléculas pequeñas para la disección y manipulación de vías biológicas. Actualmente, sólo existe un número limitado de sistemas de dimerización inducida químicamente (CID) y la ingeniería de otros nuevos con sensibilidad y selectividad deseadas para ligandos específicos de moléculas pequeñas sigue siendo un desafío en el campo de la ingeniería de proteínas. Aquí describimos un método de cribado de alto rendimiento, combin binders-enabled selección de CID (COMBINES-CID), para la ingeniería de novo de sistemas CID aplicables a una gran variedad de ligandos. Este método utiliza la selección en dos pasos de una biblioteca combinatoria nanobody mostrada por fago para obtener 1) "aglutinantes de anclaje" que primero se unen a un ligando de interés y luego 2) "aglutinantes de dimerización" que solo se unen a los complejos de anglutinante-ligando. Para seleccionar aglutinantes de anclaje, una biblioteca combinatoria de más de 10⁹ nanocuerpos aleatorizados de región determinante de complementariedad (CDR) se examinan con un ligando biotinilado y los hits se validan con el ligando sin etiquetar mediante interferometría de capa biológica (BLI). Para obtener aglutinantes de dimerización, la biblioteca de nanobody se analiza con complejos de anclarios de anclaje como objetivos para el cribado positivo y los aglutinantes de anclaje no enlazados para el cribado negativo. COMBINES-CID es ampliamente aplicable a aglutinantes de CID seleccionados con otras inmunoglobulinas, no inmunoglobulina o andamios diseñados computacionalmente para crear biosensores para la detección in vitro e in vivo de fármacos, metabolitos, moléculas de señalización, etc.

Introduction

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Los sistemas CID, en los que dos proteínas dimerize sólo en presencia de un ligando de moléculas pequeñas(Figura 1),ofrecen herramientas versátiles para disecar y manipular vías metabólicas, de señalización y otras vías biológicas¹. Han demostrado el potencial en el accionamiento biológico, como la activación de células T controlada por fármacos² y la apoptosis^3,^4,para mejorar la seguridad y eficacia de la terapia adoptiva de células T. Además, proporcionan una nueva metodología para la detección in vivo o in vitro de objetivos de mo....

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Protocol

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1. Construcción de bibliotecas

Utilice una biblioteca de anticuerpos combinatoria sintética de un solo dominio con una diversidad de 1,23 a 7,14 x 10⁹, como se ha descrito anteriormente¹⁹. Aunque este protocolo no incluye la construcción de bibliotecas, se puede aplicar a otras bibliotecas de carpetas combinatorias.

2. Biotinylación de ligando objetivo o ligando

Biotinylate el ligando seleccionado, por ejemplo, CBD y tetrahidrocannabinol (THC)¹⁹, a través de diversas estrategias de síntesis química, dependiendo de los sitios de biotinylación adecuados de un....

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Results

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Describimos la selección in vitro en dos pasos y la validación de aglutinantes de anclaje y dimerización mediante la selección de la biblioteca combinatorial nanobody con una diversidad superior a 10⁹ utilizando CBD como objetivo. Evaluar el enriquecimiento de la biopanning del fago durante las sucesivas rondas de selección para aglutinantes de anclaje y de dimerización es importante. Los resultados de enriquecimiento típicos después de 4-6 rondas de selección como se muestra en la Figura .......

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Discussion

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Es fundamental elegir las concentraciones correctas de las bibliotecas de fagos de entrada para diferentes rondas de bioparnning. Por lo general, comenzamos a partir de una biblioteca de entrada de 10^{a 12}^{–10 13} partículas de fago con una diversidad >10^9,lo que permite que se presenten en el ensayo desplegable las copias de cada clon de fago. Si la concentración de fago en un ensayo de unión es demasiado alta o baja, la probabilidad de unión inespecífica o pérdida de clones positivos aumen.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La Universidad de Washington ha presentado una patente provisional relacionada con esta obra.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por el Premio a la Innovación de la Universidad de Washington (a L.G.), una subvención de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos (1R35GM128918 a L.G.), y un fondo de inicio de la Universidad de Washington (a L.G.). H.J. fue apoyado por una beca de pregrado de la Washington Research Foundation. K.W. fue apoyado por una beca de pregrado del Instituto de Diseño de Proteínas de la Universidad de Washington.

....

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Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number
Solución de sustrato ELISA Ultra TMB de 1 paso	Agar Thermo Fisher Scientific	34029
	Thermo Fisher Scientific	BP1423-2
Amicon Ultra-15 (corte de 3 kDa)	Millipore	UFC900324
ampicilina	Thermo Fisher Scientific	BP1760-25
Bio-Rad Kit de ensayo de proteínas II	Bio-Rad
Kit de reacción estándar de biotina-proteína ligasa BirA	Avidity	BirA500
Albúmina sérica bovina (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153-50G
Caseína	Sigma-Aldrich	C7078-1KG
CM13 Fago auxiliar	Laboratorios de diseño de anticuerpos	PH020L
D-(+)-Glucosa monohidrato	Alfa Aesar	A11090
Dynabeads M-280 Estreptavidina	Thermo Fisher Scientific	11205D
DynaMag-2 Imán	Thermo Fisher Scientific	12321D
EDTA	Thermo Fisher Scientific	BP120-1
Escalera de ADN rápida	Nueva Inglaterra Biolabs	N3238S
FastDigest BglI	Thermo Fisher Scientific	FD0074
Glicerol	Thermo Fisher Scientific	BP229-1
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg	GE Healthcare	28989335
HiPrep 26/10 Columna de Desalinización GE	Healthcare	17508701
HisTrap-FF-1ml	GE Healthcare	11000458
Imidazol	Alfa Aesar	161-0718
IPTG	Thermo Fisher Scientific	34060
Kanamicina	Thermo Fisher Scientific	BP906-5
M13 Cubierta Principal Anticuerpo Proteico Santa	Cruz Biotechnology	SC-53004
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014-500G
NanoDrop 2000/2000C Espectrofotómetros	Thermo Fisher Scientific	ND-2000
Nunc 96-Pocillos Polipropileno DeepWell Placas de almacenamiento	Thermo Fisher Scientific	260251
Nunc MaxiSorp	Thermo Fisher Scientific	44-2404-21
Octet RED96	ForteBio	N/A
pADL-23c Phagemid Vector Antibody Design	Labs	PD0111
PEG-6000	Sigma-Aldrich	81260-1KG
Platino SuperFi ADN Polimerasa	Invitrogen	12351010
PureLink Kit de purificación de PCR	Thermo Fisher Scientific	K310001
QIAprep Spin M13 Kit	Qiagen	27704
Medio de recuperación	Lucigen	80026-1
SpectraMax Plus 384	Molecular Devices	N/A
Sacarosa	Sigma-Aldrich	S0389-1KG
Super estreptavidina (SSA) Biosensores	ForteBio	18-5057
Superdex 75 aumento 10/300 GL Columna	GE Healthcare	28-9909-44
T4 ADN Ligasa	Thermo Fisher Scientific	15224-025
TG1 Células Electrocompetentes	Lucigen	60502-1
Trietilamina	Sigma-Aldrich	471283-100mL
Trizma Base	Sigma-Aldrich	T1503
Triptona	Thermo Fisher Scientific	BP9726-5
Tween 20	Thermo Fisher Scientific	BP337-500
Extracto de levadura	Thermo Fisher Scientific	BP1422-2
Zeba Spin Columna de desalinización	Thermo Fisher Scientific	89882

Unidad de filtro centrífugo 5000002

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stanton, B. Z., Chory, E. J., Crabtree, G. R. Chemically induced proximity in biology and medicine. Science. 359 (6380), (2018).
Wu, C. Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor.

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