Establecimos una forma eficaz de agotar las bacterias intestinales en tres días y, posteriormente, trasplantar la microbiota fecal mediante sonda nasogástrica de líquido fecal preparado a partir de contenido intestinal fresco o congelado en ratones. También presentamos un método optimizado para detectar la frecuencia de bacterias recubiertas de IgA en el intestino.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Trasplante de microbiota fecal y detección de la prevalencia de bacterias recubiertas de IgA en el intestino
En este artículo
Resumen
Resumen
La microbiota intestinal desempeña un papel pleiotrópico en la salud y la enfermedad humanas. El trasplante de microbiota fecal (TMF) es un método eficaz para investigar la función biológica de las bacterias intestinales en su conjunto o a nivel de especie. Se han publicado varios métodos diferentes de TMF. En este artículo, presentamos un protocolo de TMF que agota con éxito la microbiota intestinal en cuestión de días, seguido del trasplante de microbiota fecal a partir de contenido intestinal fresco o congelado de donantes a ratones convencionales. Se aplica PCR en tiempo real para probar la eficacia del agotamiento bacteriano. A continuación, se aplica la secuenciación del ARN ribosómico 16S (ARNr) para comprobar la abundancia relativa y la identidad de la microbiota intestinal en ratones receptores. También presentamos un método de detección basado en citometría de flujo de bacterias recubiertas de inmunoglobulina A (IgA) en el intestino.
Introducción
Una microbiota intestinal diversa desempeña un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis del huésped. Este microbioma ayuda en varios procesos fisiológicos que van desde la digestión y absorción de nutrientes de los alimentos, la defensa contra la infección de patógenos, la regulación del desarrollo del sistema inmunológicoy la homeostasis inmune. La alteración de la composición microbiana intestinal se ha relacionado con muchas enfermedades, como el cáncer2, las enfermedades autoinmunes3, la enfermedad inflamatoria intestinal4....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las regulaciones éticas vigentes para el cuidado y uso de animales en China.
NOTA: Los animales se alojaron en un ambiente controlado libre de patógenos específicos (SPF) bajo ciclos de luz y oscuridad de 12 horas a 25 °C. La comida fue irradiada antes de ser alimentada a los ratones. El agua potable y las jaulas se esterilizaron en autoclave antes de su uso. En el estudio se utilizaron ratones machos C57BL/6J de ocho semanas de edad después de 1 semana de aclimatación. Se dividieron en varios grupos en función del diseño del experimento. Cada....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
El horario del TMF utilizado en este estudio se describe en la Figura 1. Tras el tratamiento con el cóctel de antibióticos, se analizó la eficacia de la depleción de la microbiota intestinal mediante la secuenciación de la región del ARNr 16S. Detectamos 196 especies en el íleon de ratones naïve, mientras que el tratamiento con antibióticos de 3 días redujo rápidamente las especies bacterianas a 35 (Figura 2A). Se detectaron ocho especies únicamente en ratones q.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Los antibióticos utilizados en el procedimiento de depleción tienen diferentes propiedades antibacterianas. La vancomicina es específica para bacterias grampositivas30. La doxiciclina oral puede inducir cambios significativos en la composición de la microbiota intestinal en ratones hembra C57BL/6NCrl31. La neomicina es un antibiótico de amplio espectro que se dirige a la mayoría de las bacterias residentes en el intestino3.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo se llevó a cabo bajo el patrocinio del Proyecto interdisciplinario Sobresaliente del Hospital de China Occidental, la Universidad de Sichuan (Subvención Nr: ZYJC18024) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvención: 81770101 y 81973540).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| aguja de jeringa de 5 mL | Sheng guang biotech | 5mL | |
| 70 y micro; Filtro de células M | BD Biosciences | 352350 | |
| Ampicilina sódica sal | AMERESCO | 0339 | |
| APC Estreptavidina | BD biosciences | 554067 | |
| Biotina anticuerpo IgA anti-ratón | Biolegend | 407003 | |
| Albiumina sérica bovina (BSA) | Sigma | B2064-50G | |
| Ratones C57BL/6J | Chengdu Dashuo | ||
| CO2 | Xiyuan biotech | ||
| E.Coil genoma ADN | TsingKe | ||
| Eppendorf tubos | Axygen | MCT150-C | |
| Taburete rápido de ADN mini Manual | QIAGEN | 51604 | |
| Metronidazol | Shyuanye | S17079-5g | |
| Sulfato de neomicina | SIGMA | N-1876 | |
| Aguja de sonda nasogástrica oral | Yuke biotech | 10# | |
| pClone007 Kit de vectores TA simple y versátil | TsingKe | 007VS | |
| Tampón de fosfato salino (PBS) | Hyclone | SH30256 | |
| Precellys kit de lisado Precellys | KT03961-1-001.2 | ||
| RT PCR SYBR MIX | Vazyme | Q411-01 | |
| SYTO BC verde Tinción fluorescente de ácido nucleico | Thermo fisher scientific | S34855 | |
| V338 F imprimación | TsingKe | ACTCCTACGGGAGGCAGCAGCAG | |
| V806 R imprimación | TsingKe | GGACTACHVGGGTWTCTAAT | |
| Clorhidrato de vancomicina | Sigma | V2002 | |
| Equipments | |||
| BD FACSCalibur flow citómetro | BD biosciences | ||
| bolas vortx | Scilogex | ||
| BIORAD CFX Connect | BIORAD | ||
| Máquina centrífuga | Eppendorf | ||
| Illumina MiSeq | Illumina | ||
| Nanodrop máquina de medición de ácidos nucleicos | Thermo fisher scientific | ||
| Instrumental quirúrgico | Yuke biotech | ||
| Software | |||
| Adobe Illustrator CC 2015 | Versión 2015 | ||
| BIORAD CFX qPCR SOFTWARE | |||
| FlowJo software | |||
| Graphpad prisma 7 | |||
| Database | |||
| strongSilva (SSU132) |
Referencias
- Honda, K., Littman, D. R. The microbiota in adaptive immune homeostasis and disease. Nature. 535 (7610), 75-84 (2016).
- Weng, M. T., et al. Microbiota and gastrointestinal cancer. Journal of the Formosan Medical Association. 118 (1), 32-41 (2019).
- Le....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
