Caracterización de cambios de conformación de una sola molécula bajo flujo de cizallamiento con microscopía de fluorescencia

Summary

Presentamos un protocolo para inmovilizar macromoléculas individuales en dispositivos microfluídicos y cuantificar los cambios en sus conformaciones bajo el flujo de cizallamiento. Este protocolo es útil para caracterizar las propiedades biomecánicas y funcionales de biomoléculas como proteínas y ADN en un entorno de flujo.

Abstract

El comportamiento de una sola molécula bajo perturbación mecánica se ha caracterizado ampliamente para entender muchos procesos biológicos. Sin embargo, métodos como la microscopía de fuerza atómica tienen una resolución temporal limitada, mientras que la transferencia de energía por resonancia de ferster (FRET) solo permite deducir las conformaciones. La microscopía de fluorescencia, por otro lado, permite la visualización in situ en tiempo real de moléculas individuales en diversas condiciones de flujo. Nuestro protocolo describe los pasos para capturar los cambios de conformación de biomoléculas individuales en diferentes entornos de flujo de cizallamiento mediante microscopía de fluorescencia. El flujo de cizallamiento se crea dentro de canales microfluídicos y se controla mediante una bomba de jeringa. Como demostraciones del método, el factor von Willebrand (VWF) y el ADN lambda están etiquetados con biotina y fluoróforo y luego se inmovilizan en la superficie del canal. Sus conformaciones se monitorean continuamente bajo flujo de cizallamiento variable utilizando la reflexión interna total (TIRF) y la microscopía de fluorescencia confocal. La dinámica reversible de desenmaraña de VWF es útil para entender cómo su función está regulada en la sangre humana, mientras que la conformación del ADN lambda ofrece información sobre la biofísica de las macromoléculas. El protocolo también se puede aplicar ampliamente para estudiar el comportamiento de los polímeros, especialmente los biopolímeros, en diferentes condiciones de flujo e investigar la reología de fluidos complejos.

Introduction

Se han estudiado ampliamente los mecanismos de cómo las biomoléculas responden a los estímulos ambientales. En un entorno de flujo en particular, las fuerzas de cizallamiento y elongacional regulan los cambios de conformación y potencialmente la función de las biomoléculas. Ejemplos típicos incluyen el desenmarañamiento inducido por cizallamiento del ADN lambda y el factor von Willebrand (VWF). Lambda DNA se ha utilizado como herramienta para comprender la dinámica conformacional de las cadenas de polímeros individuales y flexibles y la reología de las soluciones poliméricas^1,2,3

Protocol

1. Preparación de La VWF

1. Reconstituir el VWF de plasma humano para prepararlo para las reacciones de etiquetado. Añadir 100 l de agua desionizada (DI) a 100 g de FVW liofilizado para crear una solución de stock de VWF de 1 mg/ml.
2. Solución de stock dialíze VWF para eliminar el exceso de glicina, aumentando así la eficiencia de etiquetado de biotina y fluoróforo.
   1. Transfiera 50 ml de solución de material DeVWF a una unidad de diálisis de 0,1 ml con un corte de peso molecular de 10.000 y cierre con una tapa. Almacene la solución de stock restante a -20 oC. Las existencias de VWF serán estables hasta 1 año a -20 oC.
   2. Ejecute la diálisi....

Results

Observar el comportamiento dinámico de biomoléculas como El VWF y el ADN lambda depende en gran medida de optimizar su unión a la superficie del dispositivo. Incubar tratamientos superficiales para los tiempos recomendados en el dispositivo microfluídico es crucial para obtener la unión con algunos puntos de anclaje, de modo que las moléculas puedan extenderse libremente y relajarse al cambiar de flujo. Si las proteínas o el ADN están unidos demasiado fuertemente con múltiples enlaces, se extenderán a longitudes limitada.......

Discussion

Para obtener datos de alta calidad de cambios de conformación de una sola molécula utilizando la microscopía de fluorescencia como se describe en este método, es fundamental incubar la molécula durante el tiempo adecuado, minimizar sus interacciones inespecíficas con la superficie y establecer ajustes de microscopio que reduzcan el fotoblanqueo. La capacidad de la molécula para cambiar libremente la conformación está relacionada con el número de interacciones biotina-estreptavidina formadas entre la molécula y la superfi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 Kit de etiquetado	Invitrogen	A30006
Bio-Spin P-6 Columnas de gel	Bio-Rad	7326221
Biotin	Sigma-Aldrich	B4501	Usar como biotina libre en el paso 5.6
Biotina-14-dCTP	AAT Bioquest	17019
BSA-Biotin	Sigma-Aldrich	A8549
Cubreobjetos	VWR	48393-195	Nº 1 ½, 22 x 50 mm
dNTP Set	Invitrogen	10297018
Boyas de flotador para mini dispositivo de diálisis	Thermo Scientific	69588
Klenow Fragment (3'→ 5' exo-)	New England BioLabs	M0212S	Uso para tampón de reacción 10X en el paso 2.1.1 y tampón de reacción 1X en el paso 2.2.2
Lambda DNA	New England BioLabs	N3011S
Mini dispositivo de diálisis	Thermo Scientific	69570	10K MWCO, volumen de 0,1 mL
NEBuffer 4	New England BioLabs	B7004S
NHS-PEG4-Biotin	Thermo Scientific	21330
Protocatecuato 3,4-dioxigenasa	Sigma-Aldrich	P8279
Ácido protocatecuico	Santa Cruz Biotechnology	sc-205818
Kit de elastómero de silicona para la fabricación de PDMS	The Dow Chemical Company	4019862
Estreptavidina	Sigma-Aldrich	85878
La solución de bloqueo	CANDOR Bioscience	110 050	Uso como solución bloqueadora de caseína en todo el protocolo
Cinta de vinilo para salas limpias	Fisher Scientific	19-120-3217
von Willebrand Factor, Plasma Humano	Millipore Sigma	681300
YOYO-1 Dye	AAT Bioquest	17580
Tubo de 0,25 mm de diámetro interior	Cole-Parmer	EW-06419-00
Aguja de calibre 25	Thomas Scientific JG2505X