Caracterización de cambios de conformación de una sola molécula bajo flujo de cizallamiento con microscopía de fluorescencia

Summary

Presentamos un protocolo para inmovilizar macromoléculas individuales en dispositivos microfluídicos y cuantificar los cambios en sus conformaciones bajo el flujo de cizallamiento. Este protocolo es útil para caracterizar las propiedades biomecánicas y funcionales de biomoléculas como proteínas y ADN en un entorno de flujo.

Abstract

El comportamiento de una sola molécula bajo perturbación mecánica se ha caracterizado ampliamente para entender muchos procesos biológicos. Sin embargo, métodos como la microscopía de fuerza atómica tienen una resolución temporal limitada, mientras que la transferencia de energía por resonancia de ferster (FRET) solo permite deducir las conformaciones. La microscopía de fluorescencia, por otro lado, permite la visualización in situ en tiempo real de moléculas individuales en diversas condiciones de flujo. Nuestro protocolo describe los pasos para capturar los cambios de conformación de biomoléculas individuales en diferentes entornos de flujo de cizallamiento mediante microscopía de fluorescencia. El flujo de cizallamiento se crea dentro de canales microfluídicos y se controla mediante una bomba de jeringa. Como demostraciones del método, el factor von Willebrand (VWF) y el ADN lambda están etiquetados con biotina y fluoróforo y luego se inmovilizan en la superficie del canal. Sus conformaciones se monitorean continuamente bajo flujo de cizallamiento variable utilizando la reflexión interna total (TIRF) y la microscopía de fluorescencia confocal. La dinámica reversible de desenmaraña de VWF es útil para entender cómo su función está regulada en la sangre humana, mientras que la conformación del ADN lambda ofrece información sobre la biofísica de las macromoléculas. El protocolo también se puede aplicar ampliamente para estudiar el comportamiento de los polímeros, especialmente los biopolímeros, en diferentes condiciones de flujo e investigar la reología de fluidos complejos.

Introduction

Se han estudiado ampliamente los mecanismos de cómo las biomoléculas responden a los estímulos ambientales. En un entorno de flujo en particular, las fuerzas de cizallamiento y elongacional regulan los cambios de conformación y potencialmente la función de las biomoléculas. Ejemplos típicos incluyen el desenmarañamiento inducido por cizallamiento del ADN lambda y el factor von Willebrand (VWF). Lambda DNA se ha utilizado como herramienta para comprender la dinámica conformacional de las cadenas de polímeros individuales y flexibles y la reología de las soluciones poliméricas^1,2,3,4. El VWF es un sensor de flujo natural que agrega plaquetas en los sitios de las heridas de los vasos sanguíneos con tasas de cizallamiento y patrones de flujo anormales. El desenmarañamiento de VWF es esencial para activar la unión de plaquetas al dominio A1 y la unión de colágeno al dominio A3. Además, el desdoblamiento del dominio A2 inducido por alto cizallamiento permite el escisión del VWF, que regula su distribución del peso molecular en la circulación^5,6. Por lo tanto, la visualización directa de cómo estas moléculas se comportan bajo el flujo puede mejorar en gran medida nuestra comprensión fundamental de su biomecánica y función, lo que a su vez puede permitir nuevas aplicaciones diagnósticas y terapéuticas.

Las metodologías típicas para caracterizar las conformaciones de una sola molécula incluyen pinzas ópticas/magnéticas, microscopía de fuerza atómica (AFM) y transferencia de energía de resonancia de una sola molécula (FRET)⁷. La espectroscopia de fuerza de una sola molécula es una poderosa herramienta para investigar la fuerza y el movimiento asociados con los cambios de conformación de las biomoléculas. Sin embargo, carece de la capacidad de mapear las conformaciones moleculares generales⁸. AFM es capaz de crear imágenes con alta resolución espacial, pero está limitada en resolución temporal^9,10. Además, el contacto entre la punta y la muestra puede confundir la respuesta inducida por el flujo. Otros métodos como el FRET y el análisis de nanoporos determinan los estados de plegado y despliegue de proteínas de una sola molécula en función de la detección de la distancia intramolecular y los volúmenes excluidos. Sin embargo, estos métodos todavía están en su infancia y limitados en su observación directa de las conformaciones de una sola molécula^11,12,13,14.

Por otro lado, observar directamente macromoléculas con alta resolución temporal y espacial bajo microscopía de fluorescencia ha mejorado nuestra comprensión de la dinámica de una sola molécula en muchos procesos biológicos^15,16. Por ejemplo, Fu y otros lograron recientemente la visualización simultánea del alargamiento VWF y la unión del receptor de plaquetas por primera vez. En su trabajo, las moléculas de VWF fueron inmovilizadas en la superficie de un canal microfluídico a través de interacciones biotina-estreptavidina e imágenes bajo microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) en diferentes ambientes de flujo de cizallamiento¹⁷. Aplicando un método similar al de Fu, aquí demostramos que las conformaciones de VWF y ADN lambda se pueden observar directamente bajo TIRF y microscopía de fluorescencia confocal. Como se muestra en la Figura 1,los dispositivos microfluídicos se utilizan para crear y controlar el flujo de cizallamiento, y las biomoléculas se inmovilizan en la superficie del canal. Tras la aplicación de diferentes tasas de cizallamiento, se registran conformaciones de la misma molécula para medir la longitud de la extensión, también se muestra en la Figura 1. El método podría aplicarse ampliamente para explorar otros comportamientos de polímeros en entornos de flujo complejos para estudios reológicos y biológicos.

Protocol

1. Preparación de La VWF

1. Reconstituir el VWF de plasma humano para prepararlo para las reacciones de etiquetado. Añadir 100 l de agua desionizada (DI) a 100 g de FVW liofilizado para crear una solución de stock de VWF de 1 mg/ml.
2. Solución de stock dialíze VWF para eliminar el exceso de glicina, aumentando así la eficiencia de etiquetado de biotina y fluoróforo.
   1. Transfiera 50 ml de solución de material DeVWF a una unidad de diálisis de 0,1 ml con un corte de peso molecular de 10.000 y cierre con una tapa. Almacene la solución de stock restante a -20 oC. Las existencias de VWF serán estables hasta 1 año a -20 oC.
   2. Ejecute la diálisis en 500 ml de 1 solución salina estéril con fosfato (PBS) (0,01 M fosfato disódico, 0,0018 fosfato monopotásico, cloruro de potasio de 0,0027 M, cloruro sódico de 0,137 M, pH 7,4 a 25 oC) durante 1 h a 4 oC con agitación lenta. Repita la diálisis durante una hora adicional con 500 ml de PBS fresco.
3. Comience la reacción de etiquetado de la biotina. Preparar una solución de 2 mM de NHS-PEG₄-biotina disolviendo el sólido en agua DI inmediatamente antes de la reacción. Permitir que la biotina NHS-PEG₄permanezca en agua durante un tiempo prolongado hará que el grupo NHS-éster se hidrólilos, disminuyendo así la eficiencia de etiquetado.
   1. Añadir 2,5 ml de 2 mM de NHS-PEG₄-biotina a la unidad de diálisis que contiene la solución de material DeVWF. Esto resultará en un exceso molar de biotina de 20 veces en comparación con los monómeros DeVF. Las aminas primarias de VWF reaccionarán con los grupos del NHS-éster, por lo que la unión covalente a los grupos de PEG₄-biotina a través de enlaces de amida.
   2. Coloque la unidad de diálisis dentro de un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Selle la unidad de diálisis con su tapa correspondiente. Asegure el conjunto de diálisis de tubo con Parafilm. Manténgase erguido y deje a temperatura ambiente durante 40 min.
4. Inicie la reacción de etiquetado del fluoróforo. Preparar una solución de 2,8 mM de Alexa 488 tetrafluorofenil-éster (TFP-éster) colorante fluorescente (excitación_máx. 498 nm,_{emisión máxima} a 519 nm) mediante la disolución del sólido fluoróforo en agua DI. Haga esto inmediatamente antes de la reacción para evitar que el grupo de éster de PTF se hidrólilos.
   1. Añadir 2,9 l del fluoróforo de 2,8 mM 488 a la unidad de diálisis. Esto resultará en un exceso molar de 34 veces de fluoróforo en comparación con los monómeros VWF. Las aminas primarias restantes de VWF reaccionarán con los grupos de éster de PTF, por lo que la unión covalente a los fluoróforos a través de enlaces de amida.
   2. Añadir 2,0 l de bicarbonato sódico de 1 M (disuelto en agua DI) a la unidad de diálisis. Esto ajusta el pH de la reacción más cerca de 8.0, lo que aumenta la eficiencia del éster de PTF y la reacción primaria de amina.
   3. Asegure la unidad de diálisis en un tubo de microcentrífuga tal como se encuentra en el paso 1.3.2. Conservar en la oscuridad para evitar fotoblanqueos y dejar a temperatura ambiente durante 1 h y 30 min.
5. Coloque la unidad de diálisis en 900 ml de 1 PBS estéril y dializar durante la noche a 4 oC. Esto producirá aproximadamente 70 ml de FVW etiquetado a una concentración de 0,71 mg/ml o 2,84 oM (concentración de monómeros).
6. Transfiera el VWF etiquetado a un tubo de microcentrífuga. Cubra el tubo con papel de aluminio y proteja de la luz. Conservar a 4oC. Para el almacenamiento a largo plazo, agregue azida sódica de agente antimicrobiano a una concentración final de 0,02% (p/v).
   NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.

2. Preparación del ADN Lambda

1. Biotinylate linear lambda DNA rellenando sus sitios finales cohesivos (cos sitios) con nucleótidos biotina-14-dCTP según protocolos estándar, repetidos aquí en el paso 2.1¹⁸. Rellene el resto de los sitios de cos con nucleótidos dATP, dTTP y dGTP.
   1. Preparar soluciones de 1 mM de dATP, dTTP, dGTP y biotina-14-dCTP en un tampón de reacción 10x (500 mM de cloruro de sodio, 100 mM de clorhidrato Tris, cloruro de magnesio de 100 mM, dithiothreitol de 10 mM, pH 7,9 a 25 oC).
   2. Colocar 48 sl de ADN lambda de 500 ng/L en un tubo de PCR y calentar durante 5 min a 65 oC. Los sitios de ADN lambda circular se separarán bajo el calor, linealizando la molécula y haciendo que los voladizos de una sola cadena estén listos para la biotinylación. Inmediatamente después, colóquelo en hielo para evitar que los sitios de cos vuelvan a lado.
   3. Añadir 5 ml de 1 mM de dATP, dTTP y dGTP y 4 l de biotina de 1 mM-14-dCTP al ADN lambda. También añadir 2,5 l de 5 U / L fragmento de Klenow (3'5' exo-) para catalizar la síntesis de ADN.
   4. Incubar la mezcla de reacción durante 1 h a 37oC.
   5. Añadir 1,2 l de 0,5 M EDTA. A continuación, calentar la mezcla de reacción durante 5 min a 70 oC. Esto desactivará el fragmento de Klenow y la reacción de biotinylación.
2. Elimine el exceso de nucleótidos del ADN lambda utilizando una columna de espín que puede contener 10-70 l y tiene un corte de peso molecular de 6.000.
   1. Coloque la columna dentro de un tubo de microcentrífuga de 2 ml. Centrifugar la columna y el tubo a 1000 x g durante 2 min. Deseche el flujo que se acumula en el tubo.
   2. Reemplace el búfer de columna por una solución 1x del mismo búfer de reacción del paso 2.1.1. Para ello, agregue 500 sl de búfer 1x a la columna. Centrífuga durante 1 min a 1000 x g. Deseche el flujo. Repita estos 2 veces más para que se haya agregado un total de 1500 l a la columna.
   3. Coloque la columna en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Agregue cuidadosamente la solución del paso 2.1.5 a la capa superior de la columna. Centrífuga durante 4 min a 1000 x g.
   4. Recoger el flujo a través (40-70 l) del tubo de microcentrífuga y colocar en un tubo PCR. Contiene el ADN lambda purificado y biotinilado.
3. Etiquetar ADN lambda con tinte fluorescente YOYO-1 (excitación_máx. 490 nm,_{emisión máx.} 509 nm) de acuerdo con los protocolos estándar, repetido aquí en el paso 2.3.1²⁰.
   1. Preparar una solución de tinte YOYO-1 y ADN lambda con una relación molar de tinte a par base de 1:10. Supongamos que no se perdió ADN en el paso de purificación para calcular la concentración del par base de ADN lambda. El ADN lambda de longitud completa tiene 48.502 pares base.
      NOTA: Por ejemplo, si se recuperó 50 l de solución del paso 2.2.4, agregue 7,4 l de tinte YOYO-1 de 500 m.
   2. Calentar la solución durante 2 h a 50 oC en la oscuridad para completar la reacción.
   3. Cubra el tubo con papel de aluminio y proteja de la luz. Conservar a 4oC. La solución ya está lista para ser inyectada en dispositivos microfluídicos.
      NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.

3. Creación de moldes de canal microfluídico en obleas de silicio

1. Utilice la fotolitografía para crear canales microfluídicos con dimensiones adecuadas(Figura 2) en una oblea de silicio maestra de acuerdo con los protocolos estándar¹⁹.

4. Preparación del dispositivo microfluídico de polidimetilsiloxano (PDMS)

1. Agregue 5 piezas de base de elastómero de silicona a 1 parte de agente de curado (por masa) en un bote de pesaje. Revuelva el contenido a fondo durante 1 min para crear una solución PDMS precurada.
2. Coloque la oblea de silicio maestra en un plato de plástico de Petri. Vierta la solución PDMS sobre la oblea para crear una capa de 5 mm. Cubra el plato y déjelo en un desecador al vacío durante 1 h para eliminar las burbujas de aire.
3. Incubar la placa de Petri cubierta a 60 oC durante la noche para curar PDMS en un sólido flexible. El curado dará como resultado canales microfluídicos moldeados en PDMS en la interfaz PDMS-wafer.
4. Corta rectángulos de 20 x 10 mm en el PDMS, alrededor de cada canal microfluídico, usando una maquinilla de afeitar. Retire los bloques rectangulares PDMS con pinzas.
5. Utilice una aguja de extremo romo de 25 G con bordes afilados para perforar un agujero de 0,5 mm de diámetro en un extremo del canal, asegurándose de que el agujero pase completamente a través del bloque PDMS(Figura 2). Utilice una aguja delgada para perforar PDMS desde el agujero. Repita esto en el otro extremo del canal. Esto creará una entrada y una salida para el flujo a través del canal.
6. Limpie la superficie del bloque PDMS con cinta de vinilo para salas limpias. Sople gas nitrógeno comprimido sobre un cubreobjetos No. 1 1/2, 22 x 50 mm para eliminar los residuos.
7. Coloque el bloque PDMS con el lado del canal hacia arriba y el cubreobjetos en la cámara de una máquina de unión de plasma. Comience el tratamiento.
8. Cuando finalice el tratamiento, coloque rápidamente el bloque PDMS en un cubreobjetos para que el canal esté en contacto con el resbalón. Aplique presión a lo largo de los bordes del bloque. Coloque el conjunto coverslip-PDMS en una placa caliente a 115 oC durante 15 minutos para reforzar la unión permanente.
9. Inserte tubos de 10 cm de largo y 0,25 mm de diámetro interior en el orificio de salida en la parte superior del bloque PDMS. Esto permite que el fluido fluya fácilmente fuera del canal. El dispositivo ya está completo.

5. Tratamiento de la superficie del dispositivo microfluídico

1. Inyectar <10 l de albúmina sérica bovina biotinilada de 10 g/ml (BSA-biotina) disuelta en 1x PBS estéril en la entrada del dispositivo microfluídico para experimentos de VWF. Inyectar <10 l de 1 mg/ml de biotina BSA para experimentos de ADN lambda. Sostenga unos pocos microlitros de bSA biotina en la punta de la pipeta después de la inyección y permita que la punta permanezca incrustada en la entrada.
   1. Mantenga siempre una gota de agua DI alrededor de la punta. Esto evitará que las burbujas de aire entren en el canal. Aplique esta técnica cada vez que se inyecte una nueva solución en el canal.
   2. Deje que la biotina BSA incubar en el dispositivo durante 2 h. La BSA se unirá no específicamente a la superficie de encubrimiento(Figura 3A).
2. Retire la punta de la pipeta. Inyectar <10 l de solución de bloqueo de caseína en el canal y permitir que se incuba durante 30 minutos. La caseína bloqueará cualquier sitio libre, reduciendo la unión inespecífica de biomoléculas a la superficie(Figura 3B).
3. Retire la punta e inyecte <10 l de estreptavidina de 10 g/ml disuelta en PBS estéril 1x en el canal para experimentos de VWF. Utilice estreptavidina de 100 g/ml para experimentos de ADN lambda. Incubar durante 10 min. La estreptavidina se unirá a los grupos de biotina de la BSA-biotina(Figura 3C).
4. Retire la punta e inyecte <10 ml de 1 x solución detergente (0,05% Tween 20 en PBS) en el canal para lavar el exceso de estreptavidina.
5. Retire la punta e inyecte <10 l de 28,4 nM VWF diluido en solución de caseína o ADN lambda del paso 2.3.3. Incubar VWF durante 3 min. Incubar ADN lambda durante 45 min(Figura 3D).
6. Retire la punta e inyecte <10 l de biotina libre de 5 mM diluida en solución de caseína. La biotina libre bloqueará el exceso de sitios de unión de estreptavidina en la superficie del canal(Figura 3E).

6. Visualización del VWF y el ADN lambda bajo microscopía de fluorescencia

1. Preparar 1 ml de solución de bloqueo de caseína con ácido protocatecúico de 2,2 mM y protocatechuato de 37 nM-3,4-dioxigenasa (para minimizar el fotoblanqueo). Cargue en una jeringa y fíjela en una bomba de jeringa. Tome tubos de 30 cm de largo y 0,25 mm de diámetro interior y conecte un extremo a la aguja de la jeringa. Flujo en la solución para eliminar las burbujas de aire. Fije el otro extremo del tubo a la entrada del dispositivo microfluídico. Se recomienda hacer esto 3 minutos después del paso 5.6.
2. Seleccione el objetivo de aumento más alto (es decir, 60-100X) de un microscopio de reflexión interna total (TIRF) o de fluorescencia confocal. Añada una gota de aceite de inmersión a su objetivo si es necesario. Coloque el dispositivo microfluídico en la etapa del microscopio para que el cubreobjetos esté al ras con el objetivo.
3. Empiece la microscopía de campo brillante. Ajuste el enfoque para que las entidades, como los residuos y las burbujas, sean visibles. A continuación, ajuste la etapa en la dirección X e Y hasta que el borde del canal microfluídico sea visible y biseque el marco.
4. Cambie al canal 488 (FITC). Ajuste el nivel Z y el ángulo TIRF según sea necesario hasta que se puedan distinguir las moléculas globulares verdes individuales. Estas son moléculas de ADN VWF o lambda.
5. Ajuste el tiempo de exposición y la intensidad del láser para visualizar las moléculas fluorescentes sin fotoblanquearlas demasiado rápido. Ajuste el contraste para visualizar también las moléculas con mayor claridad.
6. Arranque el flujo de la bomba de la jeringa para que la solución de bloqueo de caseína fluya hacia el canal y fuera de la salida. Haga esto exactamente 5 minutos después del paso 5.6. Detener y comenzar el flujo para observar los cambios en la conformación de moléculas. Al aplicar el flujo, utilice velocidades entre 5.000 y 30.000 l/h. Repita esto en varias áreas del dispositivo microfluídico. Continúe este proceso para localizar moléculas que pueden extenderse y relajarse en múltiples ciclos de detener e iniciar el flujo.
7. Observe cuánto tiempo tardan las moléculas en alcanzar la máxima extensión y relájese completamente en los globos. Graba vídeos del comportamiento continuo de las moléculas bajo flujo de cizallamiento, seleccionando el mejor tiempo de exposición, frecuencia de exposición y duración del vídeo que capturará toda la gama de comportamientos de extensión y minimizará el fotoblanqueo.
8. Guarde los vídeos como . AVI con una barra de escala.
   NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.

7. Análisis de imagen de los cambios de conformación

1. Calcular la velocidad decizallamiento de pared ( ) aplicada a las macromoléculas utilizando el caudal (Q) y la altura (h) y la anchura (w) del canal microfluídico rectangular. Utilice la siguiente ecuación para hacerlo:
   
2. Determine la longitud de cualquier biomolécula bajo varias velocidades de cizallamiento utilizando un código MATLAB personalizado (consulte Archivos complementarios). Cree una carpeta titulada análisis de vídeos que incluya los siguientes códigos MATLAB: main.m, save_each_frame.m, get_length.m y get_length.fig. Crea una subcarpeta dentro del análisis de vídeos titulada videos y añade . AVI para ser analizado en él.
3. Abra main.m con MATLAB 2019a y ejecute el código. Escriba el nombre del archivo de vídeo que se analizará en la ventana de comandos en Por favor, introduzca el archivode datos para analizar: .
4. En la interfaz gráfica de usuario (GUI) abierta, establezca el umbral (texto en el cuadro en la parte superior derecha de la ventana) en 20 y haga clic en el botón Establecer umbral para confirmar.
5. Utilice el cursor de datos en la barra de herramientas superior de la ventana para elegir un píxel en cualquier lugar de la barra de escala. Haga clic en Punto de inicio en la sección Barra de escala a la derecha de la ventana. La posición (x,y) del píxel elegido aparecerá a la derecha del botón. Haga clic en el botón Tamaño de píxel ( m). El tamaño de píxel debe medirse solo una vez en cada vídeo.
6. Elija cualquier píxel en la molécula de interés. Haga clic en Punto de inicio en la sección VWF. Después de que la posición del píxel elegido aparezca en el cuadro de texto de la derecha, haga clic en Extremo izquierdo, Extremo derecho y Longitud de cadena para obtener la longitud molecular en la imagen.
   NOTA: Este paso se puede utilizar para analizar los cambios de conformación de cualquier biomolécula, a pesar de que el código tiene una sección específica denominada VWF.
7. Compruebe dos veces el extremo izquierdo y derecho de la molécula. Amplíe y utilice el cursor de datos para comprobar la posición del píxel de interés. Elija manualmente el píxel como fin y vuelva a calcular la longitud (en píxeles) cuando sea necesario.
8. Registre el tamaño de píxel en el número de píxel y la longitud de la cadena en una hoja de Excel y calcule la longitud de la cadena en el número de píxeles.
9. Repita los pasos anteriores para cada imagen. Utilice el botón Last, Next en la esquina inferior derecha de la GUI para cambiar entre imágenes en el mismo archivo de vídeo. Haga clic en Cerrar para cerrar la ventana GUI.

Results

Observar el comportamiento dinámico de biomoléculas como El VWF y el ADN lambda depende en gran medida de optimizar su unión a la superficie del dispositivo. Incubar tratamientos superficiales para los tiempos recomendados en el dispositivo microfluídico es crucial para obtener la unión con algunos puntos de anclaje, de modo que las moléculas puedan extenderse libremente y relajarse al cambiar de flujo. Si las proteínas o el ADN están unidos demasiado fuertemente con múltiples enlaces, se extenderán a longitudes limitada...

Discussion

Para obtener datos de alta calidad de cambios de conformación de una sola molécula utilizando la microscopía de fluorescencia como se describe en este método, es fundamental incubar la molécula durante el tiempo adecuado, minimizar sus interacciones inespecíficas con la superficie y establecer ajustes de microscopio que reduzcan el fotoblanqueo. La capacidad de la molécula para cambiar libremente la conformación está relacionada con el número de interacciones biotina-estreptavidina formadas entre la molécula y la superfi...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 Kit de etiquetado	Invitrogen	A30006
Bio-Spin P-6 Columnas de gel	Bio-Rad	7326221
Biotin	Sigma-Aldrich	B4501	Usar como biotina libre en el paso 5.6
Biotina-14-dCTP	AAT Bioquest	17019
BSA-Biotin	Sigma-Aldrich	A8549
Cubreobjetos	VWR	48393-195	Nº 1 ½, 22 x 50 mm
dNTP Set	Invitrogen	10297018
Boyas de flotador para mini dispositivo de diálisis	Thermo Scientific	69588
Klenow Fragment (3'→ 5' exo-)	New England BioLabs	M0212S	Uso para tampón de reacción 10X en el paso 2.1.1 y tampón de reacción 1X en el paso 2.2.2
Lambda DNA	New England BioLabs	N3011S
Mini dispositivo de diálisis	Thermo Scientific	69570	10K MWCO, volumen de 0,1 mL
NEBuffer 4	New England BioLabs	B7004S
NHS-PEG4-Biotin	Thermo Scientific	21330
Protocatecuato 3,4-dioxigenasa	Sigma-Aldrich	P8279
Ácido protocatecuico	Santa Cruz Biotechnology	sc-205818
Kit de elastómero de silicona para la fabricación de PDMS	The Dow Chemical Company	4019862
Estreptavidina	Sigma-Aldrich	85878
La solución de bloqueo	CANDOR Bioscience	110 050	Uso como solución bloqueadora de caseína en todo el protocolo
Cinta de vinilo para salas limpias	Fisher Scientific	19-120-3217
von Willebrand Factor, Plasma Humano	Millipore Sigma	681300
YOYO-1 Dye	AAT Bioquest	17580
Tubo de 0,25 mm de diámetro interior	Cole-Parmer	EW-06419-00
Aguja de calibre 25	Thomas Scientific JG2505X