LarvaSPA, un método para montar larvas de Drosophila para imágenes de lapso de tiempo a largo plazo

Summary

Este protocolo describe un método para el montaje de larvas de Drosophila para lograr más de 10 h de imágenes de lapso de tiempo ininterrumpidas en animales vivos intactos. Este método se puede utilizar para tomar imágenes de muchos procesos biológicos cerca de la pared del cuerpo larvario.

Abstract

Las imágenes en vivo son un enfoque valioso para investigar las preguntas sobre biología celular. La larva de Drosophila es particularmente adecuada para la toma de imágenes en vivo in vivo porque la pared del cuerpo larvario y la mayoría de los órganos internos son transparentes. Sin embargo, la imagen viva continua de larvas de Drosophila intactas durante más de 30 minutos ha sido un reto porque es difícil inmovilizar las larvas durante mucho tiempo. Aquí presentamos un método de montaje larvario llamado LarvaSPA que permite la toma de imágenes continuas de larvas droofílicas vivas con alta resolución temporal y espacial durante más de 10 horas. Este método consiste en unir parcialmente las larvas al cubreobjetos utilizando un pegamento reactivo uv-uv y, además, restringir el movimiento larvariado utilizando un bloque de polidimetilsiloxano (PDMS). Este método es compatible con larvas en etapas de desarrollo desde la segunda instar hasta la tercera estrella errante. Demostramos aplicaciones de este método en el estudio de procesos dinámicos de las neuronas Drosophila somatosensorial, incluyendo el crecimiento de dendrita y la degeneración inducida por lesiones. Este método también se puede aplicar para estudiar muchos otros procesos celulares que ocurren cerca de la pared del cuerpo larvario.

Introduction

Las imágenes en vivo de lapso de tiempo son un método potente para estudiar los procesos celulares dinámicos. La información espacial y temporal proporcionada por las películas de lapso de tiempo puede revelar detalles importantes para responder preguntas de biología celular. La larva Drosophila ha sido un modelo popular in vivo para las investigaciones utilizando imágenes en vivo porque su pared corporal transparente permite imágenes no invasivas de estructuras internas^1,2. Además, numerosas herramientas genéticas están disponibles en Drosophila para etiquetar fluorescentemente estructuras a....

Protocol

1. Hacer que la cámara de imágenes

1. El marco de metal se puede construir a partir de un bloque de aluminio en un taller de máquinas típico. Las especificaciones de la trama se ilustran en la Figura 1A.
2. Para construir la cámara de imágenes, selle la parte inferior del marco metálico con un cubreobjetos largos (22 mm x 50 mm) y pegamento UV(Figura 1A). Curar el pegamento UV con una lámpara UV de mano.

2. Fabricación de cuboides PDMS

1. Prepare el molde para cuboides PDMS.
   1. Fije las capas de cinta de embalaje a l....

Results

La cámara de imágenes de larvas se construye pegando un marco de metal hecho a medida y dos tapas juntas. El diseño del marco metálico se especifica en la Figura 1A. Las larvas de Drosophila dentro de la cámara se adhieren a la cubierta superior con la ayuda de pegamento UV y cuboides PDMS. La ranura en el cuboide PDMS y la cinta de doble cara que el cuboide se une para crear el espacio para sostener las larvas(Figura 1B,C). El PDMS también apli.......

Discussion

Aquí describimos LarvaSPA, un método versátil de montaje de larvas Drosophila vivas para imágenes de lapso de tiempo a largo plazo. Este método no requiere recuperar o volver a montar larvas, lo que permite imágenes ininterrumpidas. Por lo tanto, es ideal para el seguimiento de procesos biológicos que tardan horas en completarse, como la degeneración y regeneración de dendrita. Este método también se puede utilizar para la creación de imágenes de la dinámica de calcio intracelular y eventos subcelulares como el .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
6061 Barras	de aluminio McMaster-Carr	9246K421
3M cinta adhesiva de doble cara	Ted Pella, Inc.	16093
3M Scotch Cinta de embalaje	3M 1.88		" de ancho x 22.2 yardas
Pinzas DUMONT #3	Fisher Scientific	50-241-34
Cubreobjetos de vidrio	Azer Scientific	1152250
Isoflurano	Midwest Veterinary Supply	193.33161.3
Microscopio confocal Leica		Leica SP8 equipado con un
Papel para lentes	Berkshire	LN90.0406.24
Placas de Petri (medianas)	VWR	25373-085
Placas de Petri (pequeñas)	VWR	10799-192
Cuchilla de afeitar	Ted Pella, Inc.	121-20
Placa de Petri rectangular	VWR	25384-322
SYLGARD 184 kit (kit PBMS)	Ciencias de la Microscopía Electrónica	24236-10
Pipeta de transferencia	Thermo Fisher Scientific	1371126
Pegamento UV	Norland	#6106, NOA 61	Índice de refracción 1,56
Lámpara UV (Workstar 2003)	Maxxeon
Desecador al vacío	Electron Microscopy Sciences	71232
Toallitas	Kimberly-Clark	Kimwipes