En este protocolo, presentamos un diseño experimental utilizando un sistema de derribo condicional y un ensayo de formación de esferas adaptadas para estudiar el efecto de clusterin en el tallo de los GCSC derivados del paciente. El protocolo se puede adaptar fácilmente para estudiar la función in vitro e in vivo de genes asociados a la stemness en diferentes tipos de CSC.
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Artículo de método
Derribo condicional combinado y ensayo de formación de esferas adaptadas para estudiar un gen asociado a la stemness de células madre de cáncer gástrico derivadas del paciente
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
Las células madre cancerosas (CSC) están implicadas en la iniciación, el desarrollo y la recurrencia de tumores después del tratamiento, y se han convertido en el centro de atención de muchos estudios en las últimas décadas. Por lo tanto, es importante desarrollar métodos para investigar el papel de los genes clave involucrados en el tallo de las células cancerosas. El cáncer gástrico (GC) es uno de los tipos de cáncer más comunes y mortales. Se cree que las células madre del cáncer gástrico (GCSC) son la raíz de la recaída del cáncer gástrico, la metástasis y la resistencia a los medicamentos. Comprender la biología de los GCSC es necesario para avanzar en el desarrollo de terapias dirigidas y eventualmente para reducir la mortalidad entre los pacientes. En este protocolo, presentamos un diseño experimental utilizando un sistema de derribo condicional y un ensayo de formación de esferas adaptadas para estudiar el efecto de clusterin en el tallo de los GCSC derivados del paciente. El protocolo se puede adaptar fácilmente para estudiar la función in vitro e in vivo de genes asociados a la stemness en diferentes tipos de CSC.
Introducción
El cáncer gástrico (GC) es uno de los tipos de cáncer más comunes y mortales1. A pesar de los avances en la cirugía combinada, la quimioterapia y la radioterapia en la terapia de GC, el pronóstico sigue siendo pobre y la tasa de supervivencia de cinco años sigue siendo muy baja2. La recurrencia y la metástasis son las principales razones por las que las muertes después del tratamiento.
Las células madre cancerosas (CSC) son un subconjunto de células cancerosas que poseen la capacidad de autorre renovarse y generar los diferentes linajes celulares que reconstituyen el tumor3.<....
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Protocolo
Toda experimentación utilizando células madre de cáncer gástrico derivadas del paciente descritas en este documento fue aprobada por el comité ético local7.
1. Cultivo de células madre de cáncer gástrico
- Preparación de los GCSC medio de cultivo completo
- Preparar el medio de cultivo completo de los GCSC añadiendo un medio fresco DME/F12 con los siguientes ingredientes esenciales: 20 ng/mL EGF, 10 ng/mL bFGF, 1% Insulina/Transferrina/Selenita de sodio, 0,2% de glucosa, 0,5% B27, 1% Glutamax, 1% de aminoácidos no esenciales, 10 m 2-mercaptoetanol, 0,75 mg/ml NaHCO3, 10 m de tioglucerol, 100 ....
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Resultados
Las células madre del cáncer gástrico del adenocarcinoma gástrico humano primario se cultivaron en un medio de cultivo libre de suero. Después de 6 días, las células se expandieron desde el fenotipo similar a una célula única (Figura 1A) para formar esferas grandes (Figura 1B).
Para evaluar la función de clusterin en GCSC, las secuencia.......
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Discusión
GC es la tercera causa de muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo. Los GCSC son críticos en la recaída del cáncer gástrico, la metástasis y la resistencia a los medicamentos. El uso de GCSC de pacientes con cáncer gástrico nos permitirá explorar su punto débil y desarrollar los medicamentos de orientación para el tratamiento de pacientes con GC.
El ensayo de formación de la esfera es un método útil para examinar el potencial de auto-renovación de células madre cancerosas in vitro. Lo.......
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Divulgaciones
No se declaran conflictos de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Ciencias de la Naturaleza de la Provincia de Guangdong (2018A030310586, 2020A1515010989), la Fundación de Investigación Científica Médica de la provincia de Guangdong (A2019405), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81772957), la Science y Programa de Tecnología de la Provincia de Guangdong en China (2017B030301016), y la Fundación de Industria y Tecnología de la Información de Shenzhen (20180309100135860).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,22 y mu; m filter | Millipore | SLGP033RB | |
| 1-Tioglicerol | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 2068586 | |
| Libre de Animales Recombinante Humano EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B-27 Suplemento (50X), sin suero | Gibco | 17504044 | |
| Corning Costar Placa de pocillos múltiples de fijación ultrabaja | Sigma-Aldrich | CLS3474 | |
| Countess Cámara de recuento de células | portaobjetos Invitrogen | C10228 | |
| Countess II Contador de células automatizado | Invitrogen AMQAX1000 | ||
| D-(+)-Glucosa | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 11330032 | |
| DMEM, Alta glucosa, GlutaMAX, Piruvato | Gibco | ||
| Hiclato de doxiciclina | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| DPBS, sin calcio, sin magnesio | Gibco | 14190250 | |
| Suero fetal bovino, calificado, Australia | Gibco | 10099141 | |
| GlutaMAX Suplemento | Gibco | 35050061 | |
| Insulina, Transferrina, Solución de Selenio (ITS -G), 100X | Gibco | ||
| vector lentiviral | GeneChem | GV307 | |
| Lenti-X Concentrador Takara | 631232 | ||
| Lipofectamina 3000 Reactivo de transfección | Invitrogen | L3000015 | |
| MEM Solución de aminoácidos no esenciales, 100X | Gibco | 11140050 | |
| Millex-HV Unidad de filtro de jeringa, 0.45 y micro; m, PVDF, 33 mm, esterilizado con rayos gamma | Millipore | SLHV033RB | |
| Nalgene General Almacenamiento a largo plazo Tubos criogénicos | Thermo Scientific | 5000-1020 | |
| Nunc Placas de Petri/Cultivo | Celular Thermo Scientific | 171099 | |
| Opti-MEM I Medio de suero reducido | Gibco | 31985070 | |
| Penicilina-Estreptomicina, | Gibco | 15140122 | |
| pHelper 1.0 (componente gag/pol) | GeneChem | pHelper 1.0 | |
| pHelper 2.0 (componente VSVG) | GeneChem | pHelper 2.0 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| FGF humano recombinante-básico | Peprotech | 100-18B | |
| Bicarbonato de sodio | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| STEM-CELLBANKER Medio de criopreservación | ZENOAQ | 11890 | |
| StemPro Accutase Solución de disociación celular | Gibco | A1110501 | |
| UltraPure 1 m Tampón Tris-HCI, pH 7,5 | Invitrogen | 15567027 | |
| Microscopio invertido ZEISS ZEISS | Axio | Vert.A1 |
Referencias
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
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Reimpresiones y permisos
