Identificación de alto rendimiento de la resistencia a Pseudomonas syringae pv. Tomate en tomate usando el ensayo de inundación de plántulas

Pseudomonas syringae es una bacteria patógena Gram-negativa que infecta una amplia gama de huéspedes de plantas. Las bacterias entran en la planta huésped a través de los estomas o heridas físicas y proliferan en el apoplast¹. Las plantas han desarrollado una respuesta inmune de dos niveles para proteger contra la infección por patógenos bacterianos. El primer nivel se produce en la superficie de la célula vegetal, donde los receptores de reconocimiento de patrones en la membrana celular de la planta perciben patrones moleculares asociados a patógenos altamente conservados (PamP) en un proceso llamado inmunidad desencadenada por PAMP (PTI)². Durante este proceso, la planta anfitriona regula las vías de respuesta de defensa, incluyendo la deposición de calisa a la pared celular, el cierre de estomas, la producción de especies reactivas de oxígeno e la inducción de genes relacionados con la patogénesis.

Las bacterias pueden superar la PTI mediante la utilización de un sistema de secreción de tipo III para suministrar proteínas, llamadas efectores, directamente en la célula de la planta^3. Las proteínas efectoras comúnmente se dirigen a los componentes de la PTI y promueven la virulencia de patógenos⁴. El segundo nivel de inmunidad de la planta se produce dentro de la célula vegetal tras el reconocimiento de las proteínas efectoras. Este reconocimiento depende de los genes de resistencia, que codifican la repetición rica en leucina (NRM) del sitio de unión a nucleótidos. Las NLE son capaces de reconocer a los efectores directamente o reconocer su actividad en un objetivo de virulencia o señuelo^5. A continuación, desencadenan una respuesta inmune secundaria en un proceso llamado inmunidad desencadenada por el efector (ETI), que a menudo se asocia con una respuesta hipersensible (HR), una forma de muerte celular localizada en el sitio de la infección^6. A diferencia de la resistencia gen-por-genes asociada con la ETI, las plantas pueden exhibir resistencia parcial cuantitativa, que depende de la contribución de múltiples genes⁷.

P. syringae pv. el tomate (Pst) es el agente causal de la mota bacteriana en el tomate y es un problema agrícola persistente. Las cepas predominantes en el campo han sido típicamente Pst raza 0 cepas que expresan uno o ambos de los efectores tipo III AvrPto y AvrPtoB. DC3000 (PstDC3000) es una cepa representativa de raza 0 y un patógeno modelo que puede causar mota bacteriana en el tomate. Para combatir la enfermedad bacteriana de la mota, los criadores introgresieron el grupo de genes Pto [P. syringae pv. tomate]/Prf [Resistencia al pto y sensibilidad al fentionamiento] de las especies de tomates silvestres Solanum pimpinellifolium en cultivares modernos^8,9. El gen Pto codifica una proteína quinasa de serina-talonina que, junto con el Prf NLR, confiere resistencia a PstDC3000 mediante el reconocimiento de los efectores AvrPto y AvrPtoB^{10,11,12,13,14}. Sin embargo, esta resistencia es ineficaz contra las cepas emergentes de la raza 1, permitiendo su rápida y agresiva propagación en los últimos años^15,16. Las cepas de la raza 1 evaden el reconocimiento por parte del clúster Pto/Prf, ya que AvrPto se pierde o muta en estas cepas, y AvrPtoB parece acumularse mínimamente^15,17,18.

Las poblaciones de tomate silvestre son importantes reservorios de variación natural para la resistencia Pst y se han utilizado previamente para identificar la resistencia potencial loci^19,20,21. Sin embargo, las pantallas actuales para la resistencia a patógenos utilizan plantas adultas de 4 a 5 semanas de edad^20,21. Por lo tanto, están limitados por el tiempo de crecimiento, el espacio de la cámara de crecimiento y los tamaños de muestra relativamente pequeños. Para hacer frente a las limitaciones de los enfoques convencionales, desarrollamos un ensayo de resistencia a las siringas de tomate de alto rendimiento utilizando plántulas de tomate de 10 días de edad^22. Este enfoque ofrece varias ventajas sobre el uso de plantas adultas: a saber, un menor tiempo de crecimiento, menores requisitos de espacio y un mayor rendimiento. Además, hemos demostrado que este enfoque recapitula fielmente los fenotipos de resistencia a la enfermedad observados en plantas adultas^22.

En el ensayo de inundación de plántulas descrito en este protocolo, las plántulas de tomate se cultivan en platos Petri de medios estériles de Murashige y Skoog (MS) durante 10 días y luego se inundan con un inóculo que contiene las bacterias de interés y un tensioactivo. Después de las inundaciones, las plántulas pueden ser evaluadas cuantitativamente para la resistencia a la enfermedad a través de ensayos de crecimiento bacteriano. Además, la supervivencia de la plántula o la muerte pueden actuar como una resistencia discreta o fenotipo de enfermedad 7-14 días después de la inundación. Este enfoque ofrece una alternativa de alto rendimiento para el cribado de un gran número de adhesiones de tomate silvestre para la resistencia a las cepas de la raza Pst 1, como la cepa Pst T1 (PstT1), y se puede adaptar fácilmente a otras cepas bacterianas de interés.

1. Preparación y uso del gabinete de bioseguridad

1. Limpie el gabinete de bioseguridad con un 70% de etanol.
2. Cierre la faja y encienda la luz ultravioleta en el gabinete de bioseguridad durante 15 minutos.
3. Después de 15 minutos, apague la luz ultravioleta en el gabinete de bioseguridad. Levante la faja y encienda el soplador durante 15 minutos.
4. Limpie todos los artículos que se utilizarán en el gabinete de bioseguridad con un 70% de etanol antes de colocar los artículos en el armario esterilizado.
5. Limpie los guantes o las manos desnudas con 70% de etanol antes de trabajar en el gabinete de bioseguridad.
6. Trabajar en el centro del gabinete de bioseguridad, lejos del soplador.
7. Utilice botellas sin abrir de autoclave estéril 10 mM MgCl₂ y ultrapura H₂O para experimentos. Ponga las botellas en el gabinete de bioseguridad y sólo ábralas en el gabinete de bioseguridad esterilizado, no en la mesa de trabajo.
8. Utilice pipetas de vidrio y puntas de pipeta dedicadas para trabajar en el gabinete de bioseguridad esterilizado. Asegúrese de que solo se abren en el armario de bioseguridad, nunca en la mesa de trabajo.
9. Después del uso del gabinete de bioseguridad, autoclave todos los residuos (excepto los residuos de lejía) y limpiar la superficie con 70% de etanol.

2. Preparación de medios vegetales

1. Pesar y disolver 0,5x Sales basales MS en ultrapuro H₂O. Pesar 0.8% bacto agar y luego añadir a disuelto 0.5x Em.
2. Autoclave y dejar que los medios se enfríen en un baño de agua de 50oC durante 1 h antes de verter o entubar.
3. Para asegurarse de que las placas no estén sobrecargadas, marque las placas estériles desechables de poliestireno de 100 x 25 mm a un nivel de llenado de 40 ml. Vierta los medios en placas estériles de 100 x 25 mm en un gabinete de bioseguridad esterilizado.

3. Preparación de materiales vegetales y condiciones de crecimiento

1. Coloque las semillas de tomate en un tubo de microcentrífuga de 2,2 ml y agregue 2,0 ml de solución de lejía al 50%.
2. Mece el tubo en un balancín durante 25 minutos.
3. Después de 25 minutos, retire las semillas del balancín y retire la solución de lejía con una pipeta en el gabinete de bioseguridad estéril. Asegúrese de que se retira toda la lejía.
4. Añadir 2 ml de Ultrapure H₂O estéril para lavar las semillas. Invertir el tubo 5x.
5. Retire el líquido del tubo con una pipeta.
6. Repita los pasos 3.3–3.5 para lavar las semillas 4 veces más.
7. Añadir 2 ml de ultrapuro estéril H₂O y verter las semillas en un plato estéril vacío de Petri.
8. La llama fórceps en etanol y permite enfriar antes de transferir y espaciar uniformemente las semillas en placas de 100 x 25 mm que contienen 0,5x MS + 0,8% de medios de agar.
9. Transfiera de 5 a 7 semillas en una línea a través de la mitad de una placa y selle los bordes de las placas con cinta quirúrgica (1,25 cm x 9,1 m).
10. Estratificar las semillas esterilizadas a 4oC en la oscuridad durante al menos 3 días para sincronizar la germinación. Asegúrese de que las placas estén apiladas planas y boca arriba, para que las semillas no se desplacen en la placa.
11. Orientar verticalmente las placas para que las raíces crezcan a lo largo de la superficie de la placa, con la línea de semillas orientada horizontalmente, al transferira a la cámara de crecimiento.
    NOTA: Ajuste la cámara de crecimiento a 22 oC y proporcione 16 h de luz a una intensidad de luz de 200–220 oE de metro^-2 s^-1 y 8 h de oscuridad.
12. Antes de las inundaciones, las plántulas crecen durante 10 días en la cámara de crecimiento, momento en el que las plántulas suelen mostrar sedes completamente emergidas y ampliadas cotiledonas y las primeras hojas verdaderas emergentes(Figura 1).

Figura 1: Etapa de desarrollo de las plántulas de tomate típicas de 10 días de edad. Las semillas de tomate Rio Grande-PtoR fueron esterilizadas, chapadas y estratificadas durante al menos 3 días en la oscuridad a 4oC. Las plántulas fueron cultivadas en placas 0.5x MS durante 10 días a 22 oC antes de ser inundadas. Típicamente, a los 10 días los cotiledones están completamente expandidos, y las primeras hojas verdaderas están empezando a emerger. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Preparación de los medios del Rey B²³ (KB)

1. Llene el vaso de precipitados con 500 ml de Ultrapure H₂O y revuelva en una placa de agitación.
2. Disolver completamente 20 g de peptona, 1,5 g de Anhidro K₂HPO₄y 12,5 ml de glicerol en un vaso de precipitados con Ultrapure H₂O.
3. Vierta la mezcla disuelta en un cilindro graduado de 1 L y lleve hasta un volumen final de 1 L con Ultrapure H₂O.
4. Vierta el caldo de nuevo en el vaso de precipitados y revuelva hasta que se mezcle.
5. Pesar 7,5 g de agar bacto en dos botellas de vidrio de 500 ml y añadir 500 ml de caldo KB del paso 4.4 en cada botella. Autoclave durante 20 min.
6. Retire las botellas del autoclave y gire suavemente para distribuir el agar.
7. Transfiera las botellas a un baño de agua de 50oC durante 1 h.
8. Después de 1 h, transfiera el frasco al gabinete de bioseguridad y en condiciones asépticas, agregue 1.600 ml de 1 M MgSO₄estéril y los antibióticos adecuados a los medios.
   NOTA: Para cepas resistentes a rifampicina PstDC3000 y PstT1, utilice rifampicina disuelta en dimetilformamida a una concentración final de 50 g/ml. Utilice cicloheximida disuelta en etanol a una concentración final de 50 g/ml para evitar el crecimiento de hongos en las placas.
9. Gire el soporte suavemente para mezclar y luego vierta para cubrir la parte inferior de las placas.
10. Dejar al menos 1 h para que las placas se solidifiquen antes de almacenarlas boca abajo a 4 oC.

5. Mantenimiento de cepas bacterianas y condiciones de cultivo

1. Mantener una población de glicerol de una sola colonia de bacterias como 1 ml de cultivo bacteriano saturado y 333 ml de glicerol estéril al 80% de glicerol a -80 oC.
2. Parchear las bacterias (es decir, PstT1) de una acción de glicerol en el agar KB con antibióticos apropiados (sección 4).
3. Permita que las bacterias se recuperen durante 2 días a 28 oC antes de rayar bacterias frescas en el agar KB selectivo usando un palillo plano y estéril.
4. Rasga las bacterias frescas de la culata de glicerol en un agar KB selectivo apropiado usando un palillo de dientes plano y estéril.
   NOTA: Asegúrese de que el stock de glicerol parcheado no tenga más de 2 semanas.
5. Para PstDC3000, incubar la placa KB a 28 oC durante 24 horas antes de usar bacterias en el experimento de inundación.
6. Para PstT1, incubar la placa KB a 28 oC durante 48 horas antes de usar bacterias en el experimento de inundación.

6. Preparación del inóculo PstT1

1. Resuspenda asépticamente la bacteria en mgCl₂ estéril de 10 mM a una densidad óptica a 600 nm (OD₆₀₀) de 0,1, o aproximadamente 5 x 10⁷ unidades formadoras de colonias (CFU)/ml).
2. Realice diluciones en serie utilizando una solución estéril de 10 mM MgCl₂ en el gabinete de bioseguridad. Para PstT1, utilice un espectrofotómetro para hacer inóculo con una concentración inicial de OD₆₀₀ a 0,1.
3. Para PstT1, haga una dilución de 1/10 a partir de la resuspensión inicial en OD₆₀₀ a 0,1 para obtener una dilución en serie a una concentración de₆₀₀ o00 a 0,01.
4. Usando la dilución en serie a OD₆₀₀ a 0,01 del paso 6.3, realice una dilución de 3/4 para obtener una DA OD final_{de 600} a 0,0075.
5. Hacer una dilución 1/10 de copolímero tensioactivo organosioactivo no iónico C₁₃H₃₄O₄Si₃ (es decir, surfactante) en 10 mM MgCl₂ y vórtice para 15 s. Añadir el stock 1/10 de surfactante a la última dilución en serie (OD₆₀₀ a 0,0075) a una concentración final de 0,015% y agitar bien.

7. Preparación del inóculo PstDC3000

1. Resuspenda asépticamente las bacterias en mgCl₂ estériles de 10 mM a una densidad óptica a 600 nm₍₆₀₀OD) de 0,1 (aproximadamente 5 x 10⁷ CFU/ml).
2. Realice diluciones en serie utilizando una solución estéril de 10 mM MgCl₂ en el gabinete de bioseguridad. Para PstDC3000, utilice un espectrofotómetro para hacer inóculo con una concentración inicial de OD₆₀₀ a 0,1.
3. Para PstDC3000, realice una dilución de 1/10 a partir de la resuspensión inicial en OD₆₀₀ a 0,1 para obtener una dilución en serie a una concentración de₆₀₀ o00 a 0,01.
4. Usando la dilución en serie a OD₆₀₀ a 0,01 del paso 3, realice una dilución de 1/2 para obtener una OD final_{de 600} a 0,005.
5. Hacer una dilución de 1/10 de surfactante en 10 mM MgCl₂ y vórtice durante 15 s. Añadir el stock 1/10 de surfactante a la última dilución en serie (OD₆₀₀ a 0,005) a una concentración final de 0,015% y girar bien para mezclar.

8. Método de inundación de plántulas de tomate

1. Saque las placas con las plántulas de 10 días de la cámara de crecimiento y colóquelas en el armario de bioseguridad para preparar las placas para la inundación.
2. Retire la cinta quirúrgica de dos placas.
3. Ajuste un temporizador para 3 min. Medir 6 ml de inóculo final (PstT1 OD₆₀₀ a 0.0075 [sección 6] o PstDC3000 OD₆₀₀ a 0.005 [sección 7]) y transferir 6 ml de inóculo a cada placa con las plántulas de 10 días de edad.
4. Empuje suavemente las plántulas hacia abajo en el inóculo con una punta de pipeta estéril. Encienda el temporizador.
5. Sostenga un plato en cada mano. Incline la parte delantera de la placa hacia abajo para acumular inóculo y sumergir principalmente los cotiledons y hojas de las plántulas.
6. Swish de lado a lado 5-7x y luego inclinar las placas hacia atrás para cubrir las raíces y toda la placa.
7. Incline las placas hacia abajo de nuevo para sumergir los cotiledons y hojas, y repita durante un total de 3 minutos.
8. Vierta el inóculo de las placas, ponga las placas sobre una superficie plana y luego vierta cualquier inóculo residual una segunda vez.
9. Vuelva a envolver las placas con cinta quirúrgica y repita los pasos 8.2–8.8 para las placas restantes.
10. Vuelva a incubar las placas en la cámara de crecimiento (ver paso 3.11 NOTA) después de que todas las placas se hayan inundado.
11. Fenotipo después de 7-10 días para PstDC3000 o 10–14 días para PstT1 (sección 11). Si lleva a cabo ensayos de crecimiento bacteriano, recoja el tejido de la hoja después de 4 días (secciones 9 y 10) y luego el fenotipo (sección 11). Alternativamente, realizar análisis fenotípicos y ensayos de crecimiento bacteriano en conjuntos separados de plantas.

9. Esterilización superficial de cotiledones para el ensayo de crecimiento bacteriano

1. Cuatro días después de inundar y volver a incubar las plántulas en la cámara de crecimiento (sección 8), retire las placas con las plántulas de tomate de la cámara de crecimiento.
2. Numerar las plántulas individuales en el exterior inferior de la placa donde la plántula se une a la placa para cada genotipo.
3. Etiquete tubos de microcentrífuga estériles de 1,5 ml con los números de plántulas individuales y utilice fórceps limpios para soltar un cordón de borosilicato estéril de 3 mm en cada tubo para su uso con un batidor de perlas. (Véase NOTA en el paso 10.1.)
4. Pipetear 200 ml de 10 mM MgCl₂ en cada tubo y tubos de cierre.
5. Preparar 70% de etanol y verter 100 ml en un vaso de precipitados limpio. Vierta 100 ml de Ultrapure H₂O estéril en un vaso de precipitados separado y limpio.
6. Fórceps rectos de acero inoxidable con puntas serradas con etanol. Abra ligeramente la placa para permitir la extracción aséptica de un cotilería con los fórceps limpios.
7. Pellizcar el pecíolo en la base del cotiledón para eliminar una hoja y caer en el vaso de precipitados con 70% de etanol para esterilizar en superficie durante 10 s. Enjuagar el cotiledón en Ultrapure H₂O durante 10 s.
8. Coloque el cotilería sobre una toalla de papel y seque con delicadas toallitas científicas.
9. Pesar individualmente cada cotilete después de la esterilización y hincha de la superficie, y registrar el peso.
10. Coloque el cotilerín en un tubo de microcentrífuga previamente preparado de 1,5 ml (a partir de los pasos 9.3 y 9.4) etiquetado con el genotipo y el número individual correspondientes.
11. Vuelva a sellar las placas con cinta estéril y vuelva a incubar las plántulas en la cámara de crecimiento (ver paso 3.11 NOTA).

10. Ensayo de crecimiento bacteriano

1. Usando muestras del paso 9.10, homogeneizar el tejido usando el batidor de cuentas en 10 mM MgCl₂ durante 1-2 min. Si el tejido no está adecuadamente macerado, homogeneizar de nuevo.
   NOTA: Muchos fabricantes producen homogeneizadores de batidores de perlas. El número y tipo de perlas, así como el tiempo y la velocidad de homogeneización (si se programan) deben optimizarse para cada tipo de homogeneizador. Asegúrese de que las muestras no se sobrecalienten durante la homogeneización.
2. Añadir 800 ml de 10 mM MgCl₂ a cada tubo que contenga tejido macerado del paso 10.1 e invertir varias veces para mezclar.
3. Preparar diluciones en serie para cada muestra en 10 mM MgCl₂ en placa de pozo 96 (10⁰, 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4, 10^-5) utilizando una pipeta multicanal(Figura 2A).
4. Pipeta de 5 ml de cada serie de dilución utilizando una pipeta multicanal en una placa de agar KB (150 mm x 15 mm) con cicloheximida y selección adecuada para la cepa bacteriana de interés (ver paso 4.8 NOTA). Deje que las placas se sequen por completo.
5. Incubar la placa boca abajo a 28 oC durante 36 h, luego visualizar(Figura 2B) las colonias en las placas utilizando un microscopio de disección para determinar si las colonias son lo suficientemente grandes como para contar.
   NOTA: Si las colonias no son lo suficientemente grandes, vuelva a incubar las placas y vuelva a comprobar el tamaño de las colonias cada pocas horas. Típicamente, las colonias son contables de 36 a 48 h después de la incubación.

Figura 2: Diluciones en serie para ensayos de crecimiento bacteriano de plántulas. (A) El tejido de hojas maceradas de las plantas infectadas se diluye antes del recuento de colonias. Las diluciones se realizan en una placa de 96 pocillos (10⁰ no está diluido). Típicamente, las diluciones se hacen de 10^-1 a 10^-5. (B) Diluciones de chapado para recuentos de colonias bacterianas. Se chapa un total de 5 l de cada columna de la serie de dilución, desde la más diluja hasta la más concentrada. Después de que las colonias se hayan secado completamente, la placa se incuba a 28 oC durante 36-48 h. Las colonias se cuentan bajo un microscopio de disección de 10x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

6. Cuente las colonias bajo un microscopio de disección antes de fusionarse(Figura 2B). Cuente las colonias de las placas de la serie de dilución con menos de 100 colonias.
7. Después de obtener recuentos de colonias(Figura 2B),normalice los recuentos a 0,01 g de tejido para plántulas y conviértalo en crecimiento bacteriano log (Tabla 1).
   NOTA: La masa media de un cotiledón Moneymaker-PtoS es de 0,01 g y se determina empíricamente²².

Tabla 1: Cálculos de muestra para el ensayo de crecimiento bacteriano de plántulas. Los cálculos de muestras demuestran cómo normalizar los recuentos bacterianos y determinar el crecimiento bacteriano del tronco.

8. Para las adhesiones silvestres y otras líneas con orígenes genéticos complejos, correlacionar el nivel de crecimiento bacteriano en plántulas individuales con su fenotipo como se describe en la sección 11.

11. Fenotipado para resistencia

1. Retire las placas de la cámara de crecimiento y las plántulas individuales de fenotipo para la muerte (debido a la enfermedad) o la supervivencia (debido a la resistencia) después de 7-14 días.
2. Plantas de fenotipo infectadas con una cepa altamente virulenta como PstDC3000 antes, a los 7-10 días después de la inoculación de inundación.
3. Plantas de fenotipo infectadas con PstT1 a los 10-14 días después de la inoculación de inundación.
4. Determinar un sistema de puntuación basado en el rango de fenotipos de resistencia observado. Registrar fenotipos binarios para cultivares, líneas isogénicas y adhesiones silvestres con fenotipos consistentes, fuertes a de resistencia intermedia(Figura 4A, 4B).
5. Si la plántula muestra un nuevo crecimiento del meristem apical dentro del período de tiempo para el fenotipado, cuente como una supervivencia. Si la plántula tiene un meristem apical marrón y no muestra un nuevo crecimiento vegetativo verde, cuente como una muerte(Figura 3).

Figura 3: Representación esquemática de una plántula de tomate. Se representan diferentes partes de una plántula de tomate, incluyendo el hipocoal, cotiledons, epicotyl, meristem apical de brote, y hojas verdaderas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

6. Registrar fenotipos en un espectro de enfermedades para poblaciones, como las poblaciones de mapeo F2, con una amplia gama de fenotipos de resistencia(Figura 4C).
7. Supervise cuidadosamente las plántulas para la aparición de los síntomas de la enfermedad y la muerte para identificar la ventana apropiada para el fenotipado.

Figura 4: Representación esquemática de fenotipos esperados para la resistencia a la plántula y la muerte en diversos orígenes genéticos. (A) Las plántulas de Rio Grande-PtoR y el cultivar casi isogénico Rio Grande-PtoS se muestran 7 días después de la inundación con PstDC3000 (OD₆₀₀ a 0.005) + 0.015% tensioactivo. Rio Grande-PtoR muestra una resistencia constante, y Rio Grande-PtoS muestra la susceptibilidad constante a la infección con PstDC3000. Estas líneas dan lugar a fenotipos discretos y binarios. (B) Las plántulas de una adhesión silvestre, como Solanum neorickii LA1329, se muestran 10 días después de la inundación con PstT1 (OD₆₀₀ a 0,0075) + 0,015% tensioactivo. Las plántulas muestran variabilidad fenotípica, pero se registraron como fenotipos binarios. La cantidad de variabilidad fenotípica y el método de fenotipado (espectro de resistencia binaria o resistencia) dependerán de la adhesión concreta probada. (C) La cartografía de las poblaciones generadas por la salida a las adhesiones silvestres a cultivares susceptibles puede mostrar un espectro más amplio de fenotipos en las poblaciones segregadas de F2. En este caso, puede ser más apropiado registrar fenotipos de plántulas en un espectro. Las plántulas altamente susceptibles de una población cartografiante pueden ser fenotipo para la muerte tan pronto como el día 7 cuando se inundan con PstT1, y por lo general muestran un meristem apical marrón, no a muy poca extensión del epicotilo, y no hay un nuevo crecimiento vegetativo verde. El meristem apical de las plántulas susceptibles puede permanecer verde o marrón muy claro durante más tiempo, y puede haber alguna extensión del epicotilo y muy poco crecimiento vegetativo, que se vuelve marrón y detenciones para el día 10. Las plántulas individuales pueden ser fenototipadas para la resistencia basada en la cantidad de crecimiento vegetativo nuevo y continuo para el día 14. Las plántulas se pueden agrupar en función de los fenotipos descritos anteriormente en diferentes categorías de resistencia, como resistencia débil, media o fuerte. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Detección de inmunidad mediada por PtoRen cultivares y líneas isogénicas utilizando el ensayo de resistencia a la plántula
La Figura 5 muestra resultados representativos para los cultivares Moneymaker-PtoR y Moneymaker-PtoS 7-10 días después de la inundación con PstDC3000. Antes de la infección, las plántulas de 10 días de edad mostraron cedías completamente y ampliaron los cotiledón y las primeras hojas verdaderas emergentes. Las plántulas se inundaron con 10 mM MgCl2 + 0.015% tensioactivo como un control negativo (datos no mostrados) y PstDC3000 a una densidad óptica de 0.005 + 0.015% tensioactivo. Las plántulas fueron fenotografiadas 7-10 días después de la inundación(Figura 5). Las plántulas individuales de líneas genotípicamente homogéneas, como Moneymaker-PtoR y Moneymaker-PtoS dan fenotipos binarios y altamente consistentes en el ensayo de inundación de plántulas. Cuando Moneymaker-PtoR, que lleva el grupo de genes Pto/Prf (n 5), fue tratado con PstDC3000 a la concentración óptima de OD600 a 0,005, la resistencia debida a la inmunidad mediada por PtoRfue fuerte y fue tipificada por un nuevo crecimiento vegetativo verde en todos los individuos22. Las plántulas deDotos-PtoS (n.o 5), que no pueden reconocer a los efectores PstDC3000 AvrPto o AvrPtoB, murieron rápidamente dentro de los 7 días después de la inundación y característicamente tenían meristems apicales marrones, motas bacterianas, clorosis y sin signos de nuevo crecimiento vegetativo verde (Figura 5).

Figura 5: Caracterización fenotípica de la resistencia o síntomas de la enfermedad 7-10 días después de la infección en un cultivar. Las plántulas de tomatePtoS se cultivaron en placas de 0,5x MS durante 10 días antes de ser inundadas con P. syringae pv. Tomate DC3000 (OD600 a 0,005) + 0,015% tensioactivo. Las plántulas de losPtoR sobrevivieron (n.o 5) y las plántulas de LaPtoS (n.o 5) murieron. Se muestra el número de plántulas supervivientes para cada genotipo del número total analizado. Barra de escala de 1 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Examen fenotípico de adhesiones salvajes utilizando el ensayo de resistencia a las plántulas
La Figura 6 muestra resultados representativos para plántulas de adhesiones susceptibles y resistentes 10-14 días después de la inundación con PstT1. Las adhesiones susceptibles incluyen RG-PtoR, S. pimpinellifolium LA1375, y S. pimpinellifolium LA1606, y las adhesiones resistentes incluyen S. neorickii LA1329. Las plántulas de diez días de edad se inundaron con 10 mM MgCl2 + 0.015% surfactante como un control negativo, y PstT1 a una densidad óptica de 0.0075 + 0.015% surfactante. Las plántulas fueron fenotótipo al menos 10 días después de la inundación, como las plántulas infectadas por PstT1 murieron más lentamente que las plántulas infectadas por PstDC3000. Las plántulas inoculadas simuladas eran verdes, saludables y en crecimiento activo. Este control es importante para garantizar que las adhesiones no sean sensibles a la concentración de tensioactivos y para garantizar que no haya contaminación bacteriana. Las adhesiones susceptibles (Rio Grande-PtoR [n.o 7], S. pimpinellifolium LA1375 [n.o 7], y S. pimpinellifolium LA1606 [n 5]) estaban muertas, tenían meristems apicales marrones y carecían de un nuevo crecimiento de 10 a 14 días después de la inoculación con PstT1. Por el contrario, dos plántulas S. neorickii LA1329 (n.o 3) mostraron un alto nivel de crecimiento verde nuevo y sobrevivieron a la infección con PstT1(Figura 6). Tres plántulas LA1329 no germinaron. Típicamente, 5-7 individuos fueron examinados para cada adhesión en una pantalla primaria para determinar la prevalencia de resistencia en la población. Cuando una adhesión silvestre más compleja genéticamente, como LA1329, se inunda con PstT1, los fenotipos de resistencia muestran ligeramente más variabilidad entre las plántulas individuales, en comparación con Moneymaker-PtoR tratado con PstDC3000. Sin embargo, los fenotipos de resistencia eran generalmente menos variables que los observados en las poblaciones de mapeo F2. Por lo tanto, se utilizaron criterios de fenotipado binario para LA1329.

Figura 6: Caracterización fenotípica de los síntomas de la resistencia o de la enfermedad 10-14 días después de la infección en las adhesiones silvestres. Rio Grande-PtoR, S. pimpinellifolium LA1606, S. pimpinellifolium LA1375 y S. neorickii LA1329 plántulas de tomate fueron cultivadas en placas 0.5x MS durante 10 días, y luego inundadas con PstT1 (OD600 a 0.0075) + 0.015% tensioactivo. Se muestra el número de plántulas supervivientes para cada adhesión silvestre del número total de pruebas. Barra de escala de 1 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Evaluación cuantitativa del crecimiento bacteriano mediante el ensayo de inundación de plántulas
Para confirmar que la resistencia observada en LA1329 a PstT1 dio lugar a un menor crecimiento bacteriano, se llevaron a cabo ensayos de crecimiento bacteriano en plántulas de tomate. El nivel de crecimiento de PstT1 en Moneymaker-PtoS y S. neorickii LA1329 se determinó 4 días después de la infección. Moneymaker-PtoS es una línea casi isogénica con susceptibilidad constante entre las plántulas individuales. Las adhesiones salvajes como S. neorickii LA1329 son a menudo más complejas genéticamente. LA1329 muestra aproximadamente 60% de resistencia a PstT1 en toda la población22. Debido a que las plántulas pueden caer sus cotiledones después de la infección, se cultiva una plántula en cada plato para correlacionar el crecimiento bacteriano en el cotilerín cosechado con la supervivencia total de la plántula o la muerte como se determina fenotípicamente al menos 10 días después de la inundación. Los recuentos bacterianos del día 4 para cada plántula se normalizaron a 0,01 g de tejido y se convirtieron en crecimiento tronco (CFU/0.01 g(log10)). El crecimiento de troncos para plántulas LA1329 resistentes a fenotípicamente (LA1329RES)o plántulas fenotípicamente susceptibles (LA1329SUS)se agruparon por separado y se compararon entre sí y con el cultivar susceptible Moneymaker-PtoS. Por ejemplo, hubo una diferencia de 1,7 registros en el crecimiento bacteriano entre LA1329RES (log 6.3) y LA1329SUS (log 8.0), y una diferencia de registro de 1,6 entre LA1329RES (log 6.3) y Moneymaker-PtoS (log 7.9) (Figura 7). Por lo tanto, resistencia fenotípica correlacionada con la resistencia cuantitativa en los ensayos de plántulas.

Figura 7: Las plántulas resistentes Solanum neorickii LA1329 apoyan un crecimiento bacteriano más bajo que Moneymaker-PtoS o susceptible S. neorickii LA1329. Los recuentos bacterianos se determinaron 4 días después de la inoculación de S. neorickii LA1329 (n.o 14) y De moneymaker-PtoS (n a 10) plántulas infectadas con PstT1 y la normalización se realizó a 0,01 g de tejido. Para LA1329, los dos grupos fenotípicos, susceptibles (SUS) o resistentes (RES), se observaron y contaron por separado. Por encima de la barra * - diferencia estadísticamente significativa determinada por un análisis de un factor de varianza. Se utilizó un procedimiento de modelo lineal general (p < 0.001) seguido de una comparación múltiple de medios utilizando la prueba post hoc de Tukey. Barras de error: error estándar. La figura indica un experimento representativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar.