Artículo de método

Identificación de alto rendimiento de la resistencia a Pseudomonas syringae pv. Tomate en tomate usando el ensayo de inundación de plántulas

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DOI:

10.3791/60805

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10 de marzo de 2020

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1Department of Plant and Microbial Biology, University of California, Berkeley, 2Plant Gene Expression Center, United States Department of Agriculture

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Resumen

El ensayo de inundación de plántulas facilita el cribado rápido de las adhesiones de tomate silvestre para la resistencia a la bacteria pseudomonas de las siestas. Este ensayo, utilizado junto con el ensayo de crecimiento bacteriano de plántulas, puede ayudar a caracterizar aún más la resistencia subyacente a la bacteria, y se puede utilizar para examinar las poblaciones de mapeo para determinar la base genética de la resistencia.

Resumen

El tomate es un cultivo de importancia agronómica que puede ser infectado por Pseudomonas syringae,una bacteria Gram-negativa, lo que resulta en la enfermedad bacteriana de la mota. El tomateP. syringae pv. el pathosistema de tomate se utiliza ampliamente para diseccionar la base genética de las respuestas innatas de las plantas y la resistencia a las enfermedades. Mientras que la enfermedad se manejó con éxito durante muchas décadas a través de la introducción del grupo de genes Pto/Prf de Solanum pimpinellifolium en tomate cultivado, las cepas de la raza 1 de P. syringae han evolucionado para superar la resistencia conferida por el grupo de genes Pto/Prf y se producen en todo el mundo.

Las especies de tomate sin efecto son importantes reservorios de diversidad natural en el reconocimiento de patógenos, ya que evolucionaron en diversos ambientes con diferentes presiones de patógenos. En las pantallas típicas para la resistencia a las enfermedades en el tomate silvestre, se utilizan plantas adultas, que pueden limitar el número de plantas que se pueden examinar debido a su mayor tiempo de crecimiento y mayores requisitos de espacio de crecimiento. Desarrollamos un método para detectar resistencia a las plántulas de tomate de 10 días de edad, lo que minimiza el tiempo de crecimiento de las plantas y el espacio de la cámara de crecimiento, permite una rápida rotación de plantas y permite probar grandes tamaños de muestra. Los resultados de supervivencia o muerte pueden tratarse como fenotipos discretos o en una escala de resistencia definida por la cantidad de nuevo crecimiento en las plántulas supervivientes después de las inundaciones. Este método se ha optimizado para examinar las plántulas de tomate de 10 días de edad para la resistencia a dos cepas de P. syringae y se puede adaptar fácilmente a otras cepas de P. syringae.

Introducción

Pseudomonas syringae es una bacteria patógena Gram-negativa que infecta una amplia gama de huéspedes de plantas. Las bacterias entran en la planta huésped a través de los estomas o heridas físicas y proliferan en el apoplast1. Las plantas han desarrollado una respuesta inmune de dos niveles para proteger contra la infección por patógenos bacterianos. El primer nivel se produce en la superficie de la célula vegetal, donde los receptores de reconocimiento de patrones en la membrana celular de la planta perciben patrones moleculares asociados a patógenos altamente conservados (PamP) en un proceso llamado inmunidad desencadenada por PAMP (PTI)2. Durante este proceso, la planta anfitriona regula las vías de respuesta de defensa, incluyendo la deposición de calisa a la pared celular, el cierre de estomas, la producción de especies reactivas de oxígeno e la inducción de genes relacionados con la patogénesis.

Las bacterias pueden superar la PTI mediante la utilización de un sistema de secreción de tipo III para suministrar proteínas, llamadas efectores, directamente en la célula de la planta3. Las proteínas efectoras comúnmente se dirigen a los componentes de la PTI y promueven la virulencia de patógenos4. El segundo nivel de inmunidad de la planta se produce dentro de la célula vegetal tras el reconocimiento de las proteínas efectoras. Este reconocimiento depende de los genes de resistencia, que codifican la repetición rica en leucina (NRM) del sitio de unión a nucleótidos. Las NLE son capaces de reconocer a los efectores directamente o reconocer su actividad en un objetivo de virulencia o señuelo5. A continuación, desencadenan una respuesta inmune secundaria en un proceso llamado inmunidad desencadenada por el efector (ETI), que a menudo se asocia con una respuesta hipersensible (HR), una forma de muerte celular localizada en el sitio de la infección6. A diferencia de la resistencia gen-por-genes asociada con la ETI, las plantas pueden exhibir resistencia parcial cuantitativa, que depende de la contribución de múltiples genes7.

P. syringae pv. el tomate (Pst) es el agente causal de la mota bacteriana en el tomate y es un problema agrícola persistente. Las cepas predominantes en el campo han sido típicamente Pst raza 0 cepas que expresan uno o ambos de los efectores tipo III AvrPto y AvrPtoB. DC3000 (PstDC3000) es una cepa representativa de raza 0 y un patógeno modelo que puede causar mota bacteriana en el tomate. Para combatir la enfermedad bacteriana de la mota, los criadores introgresieron el grupo de genes Pto [P. syringae pv. tomate]/Prf [Resistencia al pto y sensibilidad al fentionamiento] de las especies de tomates silvestres Solanum pimpinellifolium en cultivares modernos8,9. El gen Pto codifica una proteína quinasa de serina-talonina que, junto con el Prf NLR, confiere resistencia a PstDC3000 mediante el reconocimiento de los efectores AvrPto y AvrPtoB10,11,12,13,14. Sin embargo, esta resistencia es ineficaz contra las cepas emergentes de la raza 1, permitiendo su rápida y agresiva propagación en los últimos años15,16. Las cepas de la raza 1 evaden el reconocimiento por parte del clúster Pto/Prf, ya que AvrPto se pierde o muta en estas cepas, y AvrPtoB parece acumularse mínimamente15,17,18.

Las poblaciones de tomate silvestre son importantes reservorios de variación natural para la resistencia Pst y se han utilizado previamente para identificar la resistencia potencial loci19,20,21. Sin embargo, las pantallas actuales para la resistencia a patógenos utilizan plantas adultas de 4 a 5 semanas de edad20,21. Por lo tanto, están limitados por el tiempo de crecimiento, el espacio de la cámara de crecimiento y los tamaños de muestra relativamente pequeños. Para hacer frente a las limitaciones de los enfoques convencionales, desarrollamos un ensayo de resistencia a las siringas de tomate de alto rendimiento utilizando plántulas de tomate de 10 días de edad22. Este enfoque ofrece varias ventajas sobre el uso de plantas adultas: a saber, un menor tiempo de crecimiento, menores requisitos de espacio y un mayor rendimiento. Además, hemos demostrado que este enfoque recapitula fielmente los fenotipos de resistencia a la enfermedad observados en plantas adultas22.

En el ensayo de inundación de plántulas descrito en este protocolo, las plántulas de tomate se cultivan en platos Petri de medios estériles de Murashige y Skoog (MS) durante 10 días y luego se inundan con un inóculo que contiene las bacterias de interés y un tensioactivo. Después de las inundaciones, las plántulas pueden ser evaluadas cuantitativamente para la resistencia a la enfermedad a través de ensayos de crecimiento bacteriano. Además, la supervivencia de la plántula o la muerte pueden actuar como una resistencia discreta o fenotipo de enfermedad 7-14 días después de la inundación. Este enfoque ofrece una alternativa de alto rendimiento para el cribado de un gran número de adhesiones de tomate silvestre para la resistencia a las cepas de la raza Pst 1, como la cepa Pst T1 (PstT1), y se puede adaptar fácilmente a otras cepas bacterianas de interés.

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Protocolo

1. Preparación y uso del gabinete de bioseguridad

  1. Limpie el gabinete de bioseguridad con un 70% de etanol.
  2. Cierre la faja y encienda la luz ultravioleta en el gabinete de bioseguridad durante 15 minutos.
  3. Después de 15 minutos, apague la luz ultravioleta en el gabinete de bioseguridad. Levante la faja y encienda el soplador durante 15 minutos.
  4. Limpie todos los artículos que se utilizarán en el gabinete de bioseguridad con un 70% de etanol antes de colocar los artículos en el armario esterilizado.
  5. Limpie los guantes o las manos desnudas con 70% de etanol antes de trabajar en el gabinete de bioseguridad.
  6. Trabajar en el centro del gabinete de bioseguridad, lejos del soplador.
  7. Utilice botellas sin abrir de autoclave estéril 10 mM MgCl2 y ultrapura H2O para experimentos. Ponga las botellas en el gabinete de bioseguridad y sólo ábralas en el gabinete de bioseguridad esterilizado, no en la mesa de trabajo.
  8. Utilice pipetas de vidrio y puntas de pipeta dedicadas para trabajar en el gabinete de bioseguridad esterilizado. Asegúrese de que solo se abren en el armario de bioseguridad, nunca en la mesa de trabajo.
  9. Después del uso del gabinete de bioseguridad, autoclave todos los residuos (excepto los residuos de lejía) y limpiar la superficie con 70% de etanol.

2. Preparación de medios vegetales

  1. Pesar y disolver 0,5x Sales basales MS en ultrapuro H2O. Pesar 0.8% bacto agar y luego añadir a disuelto 0.5x Em.
  2. Autoclave y dejar que los medios se enfríen en un baño de agua de 50oC durante 1 h antes de verter o entubar.
  3. Para asegurarse de que las placas no estén sobrecargadas, marque las placas estériles desechables de poliestireno de 100 x 25 mm a un nivel de llenado de 40 ml. Vierta los medios en placas estériles de 100 x 25 mm en un gabinete de bioseguridad esterilizado.

3. Preparación de materiales vegetales y condiciones de crecimiento

  1. Coloque las semillas de tomate en un tubo de microcentrífuga de 2,2 ml y agregue 2,0 ml de solución de lejía al 50%.
  2. Mece el tubo en un balancín durante 25 minutos.
  3. Después de 25 minutos, retire las semillas del balancín y retire la solución de lejía con una pipeta en el gabinete de bioseguridad estéril. Asegúrese de que se retira toda la lejía.
  4. Añadir 2 ml de Ultrapure H2O estéril para lavar las semillas. Invertir el tubo 5x.
  5. Retire el líquido del tubo con una pipeta.
  6. Repita los pasos 3.3–3.5 para lavar las semillas 4 veces más.
  7. Añadir 2 ml de ultrapuro estéril H2O y verter las semillas en un plato estéril vacío de Petri.
  8. La llama fórceps en etanol y permite enfriar antes de transferir y espaciar uniformemente las semillas en placas de 100 x 25 mm que contienen 0,5x MS + 0,8% de medios de agar.
  9. Transfiera de 5 a 7 semillas en una línea a través de la mitad de una placa y selle los bordes de las placas con cinta quirúrgica (1,25 cm x 9,1 m).
  10. Estratificar las semillas esterilizadas a 4oC en la oscuridad durante al menos 3 días para sincronizar la germinación. Asegúrese de que las placas estén apiladas planas y boca arriba, para que las semillas no se desplacen en la placa.
  11. Orientar verticalmente las placas para que las raíces crezcan a lo largo de la superficie de la placa, con la línea de semillas orientada horizontalmente, al transferira a la cámara de crecimiento.
    NOTA: Ajuste la cámara de crecimiento a 22 oC y proporcione 16 h de luz a una intensidad de luz de 200–220 oE de metro-2 s-1 y 8 h de oscuridad.
  12. Antes de las inundaciones, las plántulas crecen durante 10 días en la cámara de crecimiento, momento en el que las plántulas suelen mostrar sedes completamente emergidas y ampliadas cotiledonas y las primeras hojas verdaderas emergentes(Figura 1).

figure-protocol-1
Figura 1: Etapa de desarrollo de las plántulas de tomate típicas de 10 días de edad. Las semillas de tomate Rio Grande-PtoR fueron esterilizadas, chapadas y estratificadas durante al menos 3 días en la oscuridad a 4oC. Las plántulas fueron cultivadas en placas 0.5x MS durante 10 días a 22 oC antes de ser inundadas. Típicamente, a los 10 días los cotiledones están completamente expandidos, y las primeras hojas verdaderas están empezando a emerger. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Preparación de los medios del Rey B23 (KB)

  1. Llene el vaso de precipitados con 500 ml de Ultrapure H2O y revuelva en una placa de agitación.
  2. Disolver completamente 20 g de peptona, 1,5 g de Anhidro K2HPO4y 12,5 ml de glicerol en un vaso de precipitados con Ultrapure H2O.
  3. Vierta la mezcla disuelta en un cilindro graduado de 1 L y lleve hasta un volumen final de 1 L con Ultrapure H2O.
  4. Vierta el caldo de nuevo en el vaso de precipitados y revuelva hasta que se mezcle.
  5. Pesar 7,5 g de agar bacto en dos botellas de vidrio de 500 ml y añadir 500 ml de caldo KB del paso 4.4 en cada botella. Autoclave durante 20 min.
  6. Retire las botellas del autoclave y gire suavemente para distribuir el agar.
  7. Transfiera las botellas a un baño de agua de 50oC durante 1 h.
  8. Después de 1 h, transfiera el frasco al gabinete de bioseguridad y en condiciones asépticas, agregue 1.600 ml de 1 M MgSO4estéril y los antibióticos adecuados a los medios.
    NOTA: Para cepas resistentes a rifampicina PstDC3000 y PstT1, utilice rifampicina disuelta en dimetilformamida a una concentración final de 50 g/ml. Utilice cicloheximida disuelta en etanol a una concentración final de 50 g/ml para evitar el crecimiento de hongos en las placas.
  9. Gire el soporte suavemente para mezclar y luego vierta para cubrir la parte inferior de las placas.
  10. Dejar al menos 1 h para que las placas se solidifiquen antes de almacenarlas boca abajo a 4 oC.

5. Mantenimiento de cepas bacterianas y condiciones de cultivo

  1. Mantener una población de glicerol de una sola colonia de bacterias como 1 ml de cultivo bacteriano saturado y 333 ml de glicerol estéril al 80% de glicerol a -80 oC.
  2. Parchear las bacterias (es decir, PstT1) de una acción de glicerol en el agar KB con antibióticos apropiados (sección 4).
  3. Permita que las bacterias se recuperen durante 2 días a 28 oC antes de rayar bacterias frescas en el agar KB selectivo usando un palillo plano y estéril.
  4. Rasga las bacterias frescas de la culata de glicerol en un agar KB selectivo apropiado usando un palillo de dientes plano y estéril.
    NOTA: Asegúrese de que el stock de glicerol parcheado no tenga más de 2 semanas.
  5. Para PstDC3000, incubar la placa KB a 28 oC durante 24 horas antes de usar bacterias en el experimento de inundación.
  6. Para PstT1, incubar la placa KB a 28 oC durante 48 horas antes de usar bacterias en el experimento de inundación.

6. Preparación del inóculo PstT1

  1. Resuspenda asépticamente la bacteria en mgCl2 estéril de 10 mM a una densidad óptica a 600 nm (OD600) de 0,1, o aproximadamente 5 x 107 unidades formadoras de colonias (CFU)/ml).
  2. Realice diluciones en serie utilizando una solución estéril de 10 mM MgCl2 en el gabinete de bioseguridad. Para PstT1, utilice un espectrofotómetro para hacer inóculo con una concentración inicial de OD600 a 0,1.
  3. Para PstT1, haga una dilución de 1/10 a partir de la resuspensión inicial en OD600 a 0,1 para obtener una dilución en serie a una concentración de600 o00 a 0,01.
  4. Usando la dilución en serie a OD600 a 0,01 del paso 6.3, realice una dilución de 3/4 para obtener una DA OD finalde 600 a 0,0075.
  5. Hacer una dilución 1/10 de copolímero tensioactivo organosioactivo no iónico C13H34O4Si3 (es decir, surfactante) en 10 mM MgCl2 y vórtice para 15 s. Añadir el stock 1/10 de surfactante a la última dilución en serie (OD600 a 0,0075) a una concentración final de 0,015% y agitar bien.

7. Preparación del inóculo PstDC3000

  1. Resuspenda asépticamente las bacterias en mgCl2 estériles de 10 mM a una densidad óptica a 600 nm(600OD) de 0,1 (aproximadamente 5 x 107 CFU/ml).
  2. Realice diluciones en serie utilizando una solución estéril de 10 mM MgCl2 en el gabinete de bioseguridad. Para PstDC3000, utilice un espectrofotómetro para hacer inóculo con una concentración inicial de OD600 a 0,1.
  3. Para PstDC3000, realice una dilución de 1/10 a partir de la resuspensión inicial en OD600 a 0,1 para obtener una dilución en serie a una concentración de600 o00 a 0,01.
  4. Usando la dilución en serie a OD600 a 0,01 del paso 3, realice una dilución de 1/2 para obtener una OD finalde 600 a 0,005.
  5. Hacer una dilución de 1/10 de surfactante en 10 mM MgCl2 y vórtice durante 15 s. Añadir el stock 1/10 de surfactante a la última dilución en serie (OD600 a 0,005) a una concentración final de 0,015% y girar bien para mezclar.

8. Método de inundación de plántulas de tomate

  1. Saque las placas con las plántulas de 10 días de la cámara de crecimiento y colóquelas en el armario de bioseguridad para preparar las placas para la inundación.
  2. Retire la cinta quirúrgica de dos placas.
  3. Ajuste un temporizador para 3 min. Medir 6 ml de inóculo final (PstT1 OD600 a 0.0075 [sección 6] o PstDC3000 OD600 a 0.005 [sección 7]) y transferir 6 ml de inóculo a cada placa con las plántulas de 10 días de edad.
  4. Empuje suavemente las plántulas hacia abajo en el inóculo con una punta de pipeta estéril. Encienda el temporizador.
  5. Sostenga un plato en cada mano. Incline la parte delantera de la placa hacia abajo para acumular inóculo y sumergir principalmente los cotiledons y hojas de las plántulas.
  6. Swish de lado a lado 5-7x y luego inclinar las placas hacia atrás para cubrir las raíces y toda la placa.
  7. Incline las placas hacia abajo de nuevo para sumergir los cotiledons y hojas, y repita durante un total de 3 minutos.
  8. Vierta el inóculo de las placas, ponga las placas sobre una superficie plana y luego vierta cualquier inóculo residual una segunda vez.
  9. Vuelva a envolver las placas con cinta quirúrgica y repita los pasos 8.2–8.8 para las placas restantes.
  10. Vuelva a incubar las placas en la cámara de crecimiento (ver paso 3.11 NOTA) después de que todas las placas se hayan inundado.
  11. Fenotipo después de 7-10 días para PstDC3000 o 10–14 días para PstT1 (sección 11). Si lleva a cabo ensayos de crecimiento bacteriano, recoja el tejido de la hoja después de 4 días (secciones 9 y 10) y luego el fenotipo (sección 11). Alternativamente, realizar análisis fenotípicos y ensayos de crecimiento bacteriano en conjuntos separados de plantas.

9. Esterilización superficial de cotiledones para el ensayo de crecimiento bacteriano

  1. Cuatro días después de inundar y volver a incubar las plántulas en la cámara de crecimiento (sección 8), retire las placas con las plántulas de tomate de la cámara de crecimiento.
  2. Numerar las plántulas individuales en el exterior inferior de la placa donde la plántula se une a la placa para cada genotipo.
  3. Etiquete tubos de microcentrífuga estériles de 1,5 ml con los números de plántulas individuales y utilice fórceps limpios para soltar un cordón de borosilicato estéril de 3 mm en cada tubo para su uso con un batidor de perlas. (Véase NOTA en el paso 10.1.)
  4. Pipetear 200 ml de 10 mM MgCl2 en cada tubo y tubos de cierre.
  5. Preparar 70% de etanol y verter 100 ml en un vaso de precipitados limpio. Vierta 100 ml de Ultrapure H2O estéril en un vaso de precipitados separado y limpio.
  6. Fórceps rectos de acero inoxidable con puntas serradas con etanol. Abra ligeramente la placa para permitir la extracción aséptica de un cotilería con los fórceps limpios.
  7. Pellizcar el pecíolo en la base del cotiledón para eliminar una hoja y caer en el vaso de precipitados con 70% de etanol para esterilizar en superficie durante 10 s. Enjuagar el cotiledón en Ultrapure H2O durante 10 s.
  8. Coloque el cotilería sobre una toalla de papel y seque con delicadas toallitas científicas.
  9. Pesar individualmente cada cotilete después de la esterilización y hincha de la superficie, y registrar el peso.
  10. Coloque el cotilerín en un tubo de microcentrífuga previamente preparado de 1,5 ml (a partir de los pasos 9.3 y 9.4) etiquetado con el genotipo y el número individual correspondientes.
  11. Vuelva a sellar las placas con cinta estéril y vuelva a incubar las plántulas en la cámara de crecimiento (ver paso 3.11 NOTA).

10. Ensayo de crecimiento bacteriano

  1. Usando muestras del paso 9.10, homogeneizar el tejido usando el batidor de cuentas en 10 mM MgCl2 durante 1-2 min. Si el tejido no está adecuadamente macerado, homogeneizar de nuevo.
    NOTA: Muchos fabricantes producen homogeneizadores de batidores de perlas. El número y tipo de perlas, así como el tiempo y la velocidad de homogeneización (si se programan) deben optimizarse para cada tipo de homogeneizador. Asegúrese de que las muestras no se sobrecalienten durante la homogeneización.
  2. Añadir 800 ml de 10 mM MgCl2 a cada tubo que contenga tejido macerado del paso 10.1 e invertir varias veces para mezclar.
  3. Preparar diluciones en serie para cada muestra en 10 mM MgCl2 en placa de pozo 96 (100, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5) utilizando una pipeta multicanal(Figura 2A).
  4. Pipeta de 5 ml de cada serie de dilución utilizando una pipeta multicanal en una placa de agar KB (150 mm x 15 mm) con cicloheximida y selección adecuada para la cepa bacteriana de interés (ver paso 4.8 NOTA). Deje que las placas se sequen por completo.
  5. Incubar la placa boca abajo a 28 oC durante 36 h, luego visualizar(Figura 2B) las colonias en las placas utilizando un microscopio de disección para determinar si las colonias son lo suficientemente grandes como para contar.
    NOTA: Si las colonias no son lo suficientemente grandes, vuelva a incubar las placas y vuelva a comprobar el tamaño de las colonias cada pocas horas. Típicamente, las colonias son contables de 36 a 48 h después de la incubación.

figure-protocol-2
Figura 2: Diluciones en serie para ensayos de crecimiento bacteriano de plántulas. (A) El tejido de hojas maceradas de las plantas infectadas se diluye antes del recuento de colonias. Las diluciones se realizan en una placa de 96 pocillos (100 no está diluido). Típicamente, las diluciones se hacen de 10-1 a 10-5. (B) Diluciones de chapado para recuentos de colonias bacterianas. Se chapa un total de 5 l de cada columna de la serie de dilución, desde la más diluja hasta la más concentrada. Después de que las colonias se hayan secado completamente, la placa se incuba a 28 oC durante 36-48 h. Las colonias se cuentan bajo un microscopio de disección de 10x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Cuente las colonias bajo un microscopio de disección antes de fusionarse(Figura 2B). Cuente las colonias de las placas de la serie de dilución con menos de 100 colonias.
  2. Después de obtener recuentos de colonias(Figura 2B),normalice los recuentos a 0,01 g de tejido para plántulas y conviértalo en crecimiento bacteriano log (Tabla 1).
    NOTA: La masa media de un cotiledón Moneymaker-PtoS es de 0,01 g y se determina empíricamente22.
Genotipo1 Columna APeso tisú (g) Columna BN.o de colonias en un lugar Columna CFactor de dilución para el punto2 Columna DAjustado n.o de colonias3 Columna EFactor de dilución para dilución en serie Columna FNúmero total de Colonias Columna G (cfu/0.01 g)4Número promedio de colonias (cfu/0.01 g) Columna HCrecimiento medio del registro (cfu/0,01 g (log10)) Columna I
Muestra 10.004 g10200calculado según: (C2 x 0,01 g) / B2 a 251000calculado según: (D2 x E2 x F2) a 5000000promedio para la muestra 1 hasta la última muestra: (es decir, promedio G1:G3) a 7000000registro de promedio, es decir. log(H2) á 6,85
Muestra 20.003 g1520050100010000000
Muestra 30.002 g62003010006000000
1 Datos mostrados para 3 muestras
2 Basado en chapado de 5 l x 200 para 1 ml
3 Los cotiledones son demasiado pequeños para el núcleo, por lo que los recuentos de colonias se normalizaron a 0,01 g de tejido en función de la masa media de un cotiledo MoneyMaker-PtoS (datos no mostrados)
4 Ajustado por ml en función del volumen chapado

Tabla 1: Cálculos de muestra para el ensayo de crecimiento bacteriano de plántulas. Los cálculos de muestras demuestran cómo normalizar los recuentos bacterianos y determinar el crecimiento bacteriano del tronco.

  1. Para las adhesiones silvestres y otras líneas con orígenes genéticos complejos, correlacionar el nivel de crecimiento bacteriano en plántulas individuales con su fenotipo como se describe en la sección 11.

11. Fenotipado para resistencia

  1. Retire las placas de la cámara de crecimiento y las plántulas individuales de fenotipo para la muerte (debido a la enfermedad) o la supervivencia (debido a la resistencia) después de 7-14 días.
  2. Plantas de fenotipo infectadas con una cepa altamente virulenta como PstDC3000 antes, a los 7-10 días después de la inoculación de inundación.
  3. Plantas de fenotipo infectadas con PstT1 a los 10-14 días después de la inoculación de inundación.
  4. Determinar un sistema de puntuación basado en el rango de fenotipos de resistencia observado. Registrar fenotipos binarios para cultivares, líneas isogénicas y adhesiones silvestres con fenotipos consistentes, fuertes a de resistencia intermedia(Figura 4A, 4B).
  5. Si la plántula muestra un nuevo crecimiento del meristem apical dentro del período de tiempo para el fenotipado, cuente como una supervivencia. Si la plántula tiene un meristem apical marrón y no muestra un nuevo crecimiento vegetativo verde, cuente como una muerte(Figura 3).

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Figura 3: Representación esquemática de una plántula de tomate. Se representan diferentes partes de una plántula de tomate, incluyendo el hipocoal, cotiledons, epicotyl, meristem apical de brote, y hojas verdaderas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Registrar fenotipos en un espectro de enfermedades para poblaciones, como las poblaciones de mapeo F2, con una amplia gama de fenotipos de resistencia(Figura 4C).
  2. Supervise cuidadosamente las plántulas para la aparición de los síntomas de la enfermedad y la muerte para identificar la ventana apropiada para el fenotipado.

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Figura 4: Representación esquemática de fenotipos esperados para la resistencia a la plántula y la muerte en diversos orígenes genéticos. (A) Las plántulas de Rio Grande-PtoR y el cultivar casi isogénico Rio Grande-PtoS se muestran 7 días después de la inundación con PstDC3000 (OD600 a 0.005) + 0.015% tensioactivo. Rio Grande-PtoR muestra una resistencia constante, y Rio Grande-PtoS muestra la susceptibilidad constante a la infección con PstDC3000. Estas líneas dan lugar a fenotipos discretos y binarios. (B) Las plántulas de una adhesión silvestre, como Solanum neorickii LA1329, se muestran 10 días después de la inundación con PstT1 (OD600 a 0,0075) + 0,015% tensioactivo. Las plántulas muestran variabilidad fenotípica, pero se registraron como fenotipos binarios. La cantidad de variabilidad fenotípica y el método de fenotipado (espectro de resistencia binaria o resistencia) dependerán de la adhesión concreta probada. (C) La cartografía de las poblaciones generadas por la salida a las adhesiones silvestres a cultivares susceptibles puede mostrar un espectro más amplio de fenotipos en las poblaciones segregadas de F2. En este caso, puede ser más apropiado registrar fenotipos de plántulas en un espectro. Las plántulas altamente susceptibles de una población cartografiante pueden ser fenotipo para la muerte tan pronto como el día 7 cuando se inundan con PstT1, y por lo general muestran un meristem apical marrón, no a muy poca extensión del epicotilo, y no hay un nuevo crecimiento vegetativo verde. El meristem apical de las plántulas susceptibles puede permanecer verde o marrón muy claro durante más tiempo, y puede haber alguna extensión del epicotilo y muy poco crecimiento vegetativo, que se vuelve marrón y detenciones para el día 10. Las plántulas individuales pueden ser fenototipadas para la resistencia basada en la cantidad de crecimiento vegetativo nuevo y continuo para el día 14. Las plántulas se pueden agrupar en función de los fenotipos descritos anteriormente en diferentes categorías de resistencia, como resistencia débil, media o fuerte. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Resultados

Detección de inmunidad mediada por PtoRen cultivares y líneas isogénicas utilizando el ensayo de resistencia a la plántula
La Figura 5 muestra resultados representativos para los cultivares Moneymaker-PtoR y Moneymaker-PtoS 7-10 días después de la inundación con PstDC3000. Antes de la infección, las plántulas de 10 días de edad mostraron cedías completamente y ampliaron los cotiledón y las primeras hojas verdaderas emergentes. Las plánt...

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Discusión

Se describe un protocolo para la inoculación por inundación con PstDC3000 o PstT1 optimizado para detectar resistencia a estas cepas bacterianas en plántulas de tomate. Existen varios parámetros críticos para obtener resultados óptimos en el ensayo de resistencia a la plántula, incluida la concentración bacteriana y la concentración de surfactantes, que se determinaron empíricamente22. Para PstDC3000, la densidad óptica fue optimizada para lograr una supervivencia comple...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a Jamie Calma por probar el efecto del volumen de los medios en los resultados de enfermedades o resistencia. Agradecemos al Dr. Maél Baudin y al Dr. Karl J. Scheiber del Laboratorio Lewis por proporcionar comentarios constructivos y sugerencias sobre el manuscrito. La investigación sobre la inmunidad vegetal en el laboratorio Lewis fue apoyada por el USDA ARS 2030-21000-046-00D y 2030-21000-050-00D (JDL), y la Dirección de Ciencias Biológicas de la NSF IOS-1557661 (JDL).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Cinta 3M Micropore 1/2" x 10 YD CS 240 (1,25 cm x 9,1 m)VWR International56222-182
Perlas de vidrio de borosilicato de 3 mmFriedrich & DimmockGB3000B
Bacto peptonaBD 211677
Bacto agarBD214010
Biofotómetro PlusEppendorfE952000006
Cabina de bioseguridad, clase II tipo A2
MARCA Cubetas de plástico desechables, poliestirenoVWR International47744-642
Palillos de dientes de madera plana kraft de chenillaVWR International500029-808
cicloheximidaProducts InternationalC81040-5.0
Fosfato de potasio dibásico anhidro, grado ACSFisher ScientificP288-500
Dimetilformamida
Microscopio de disección (aumento de al menos 10x)
Etanol - 190 Proof
Falcon poliestireno 96 pocillos microplacas, fondo planoFisher Scientific08-772-3
Quemador de alcohol de vidrio WickFisher ScientificS41898A / No. W-125
Quemadores de alcohol de vidrioFisher ScientificS41898 / No. BO125
Reactivo de glicerol ACSVWR InternationalEMGX0185-5
Kimberly-Clark™ Kimtech Ciencia y Comercio; Kimwipes&comercio; Limpiaparabrisas para trabajos delicadosFisher Scientific06-666-A
Cloruro de magnesio, grado ACSVWR International97061-356
Sulfato de magnesio heptahidratado, grado ACSVWR International97062-130
Tubos de microcentrífuga, 1,5 mL
Tubos de microcentrífuga, 2,2 mL
Mini Beadbeater-96, 115 voltiosBio Spec Products Inc.1001
Murashige & Skoog, Laboratorios Caisson de Sales Basales, Inc.MSP01-50LT
Pipet-Lite XLS LTS 8-CH Pipeta 20-200uLRaininL8-200XLS
Pipet-Lite XLS LTS 8-CH Pipeta 2-20uLRaininL8-20XLS
Poliestireno 100mm x 25mm placa de Petri estérilVWR International89107-632
Poliestireno 150mm x 15mm placa de Petri estérilFisher ScientificFB08-757-14
Placa de Petri estéril de poliestireno 150x15mmFisher Scientific08-757-148
Pure Bright Germicidal Ultra Bleach 5.7% Cloro disponible (definido como 100% bleach)Grapas1013131
RifampicinaGold BiotechnologyR-120-25
Silwet L-77 (copolímero de surfactante de organosilicona no iónica C13H34O4 Si3 surfactante)Fisher ScientificNCO138454
Tips LTS 20 μ L 960/10 GPS-L10Consejosde 17005091
Rainin LTS 250 μ L 960/10 GPS-L250Pinza
VWR punta fina, 4,5"VWR International82027-386
Research de disección Rainin 17005093

Referencias

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Erratum


Formal Correction: Erratum: High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay
Posted by JoVE Editors on 10/18/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay. The Introduction, Protocol, Representative Results and Discussion sections were updated.

The last paragraph of the Introduction section was updated from:

In the seedling flood assay described in this protocol, tomato seedlings are grown on Petri dishes of sterile Murashige and Skoog (MS) media for 10 days and then are flooded with an inoculum containing the bacteria of interest and a surfactant. Following flooding, seedlings can be quantitatively evaluated for disease resistance via bacterial growth assays. Additionally, seedling survival or death can act as a discrete resistance or disease phenotype 7–14 days after flooding. This approach offers a high-throughput alternative for screening large numbers of wild tomato accessions for resistance to Pst race 1 strains, such as Pst strain T1 (PstT1), and can easily be adapted to other bacterial strains of interest.

to:

In the seedling flood assay described in this protocol, tomato seedlings are grown on Petri dishes of sterile Murashige and Skoog (MS) media for 10 days and then are flooded with an inoculum containing the bacteria of interest and a surfactant. Following flooding, seedlings can be quantitatively evaluated for disease resistance via bacterial growth assays. Additionally, seedling survival or death can act as a discrete resistance or disease phenotype 7–14 days after flooding. This approach offers a high-throughput alternative for screening large numbers of wild tomato accessions for resistance to Pst race 1 strains, such as Pst strain 19 (Pst19), and can easily be adapted to other bacterial strains of interest.

Step 4.8 of the Protocol section was updated from:

  1. After 1 h, transfer the bottle to the biosafety cabinet and under aseptic conditions, add 1,600 µL of sterile 1 M MgSO4, and appropriate antibiotics to the media.
    NOTE: For rifampicin resistant strains PstDC3000 and PstT1, use rifampicin dissolved in dimethylformamide at a final concentration of 50 µg/mL. Use cycloheximide dissolved in ethanol at a final concentration of 50 µg/mL to prevent fungal growth on the plates.

to:

  1. After 1 h, transfer the bottle to the biosafety cabinet and under aseptic conditions, add 1,600 µL of sterile 1 M MgSO4, and appropriate antibiotics to the media.
    NOTE: For rifampicin resistant strains PstDC3000 and Pst19, use rifampicin dissolved in dimethylformamide at a final concentration of 50 µg/mL. Use cycloheximide dissolved in ethanol at a final concentration of 50 µg/mL to prevent fungal growth on the plates.

Step 5.2 of the Protocol section was updated from:

  1. Patch bacteria (i.e., PstT1) from a glycerol stock onto KB agar with appropriate antibiotics (section 4).

to:

  1. Patch bacteria (i.e., Pst19) from a glycerol stock onto KB agar with appropriate antibiotics (section 4).

Step 5.6 of the Protocol section was updated from:

  1. For PstT1, incubate the KB plate at 28 ˚C for 48 h prior to using bacteria in the flood experiment.

to:

  1. For Pst19, incubate the KB plate at 28 ˚C for 48 h prior to using bacteria in the flood experiment.

Step 6 of the Protocol section was updated from:

6. Preparation of PstT1 inoculum

to

6. Preparation of Pst19 inoculum

Step 6.2 of the Protocol section was updated from:

  1. Perform serial dilutions using sterile 10 mM MgCl2 solution in the biosafety cabinet. For PstT1, use a spectrophotometer to make inoculum with a starting concentration of OD600 = 0.1.

to:

  1. Perform serial dilutions using sterile 10 mM MgCl2 solution in the biosafety cabinet. For Pst19, use a spectrophotometer to make inoculum with a starting concentration of OD600 = 0.1.

Step 6.3 of the Protocol section was updated from:

  1. For PstT1, make a 1/10 dilution from the initial resuspension at OD600 = 0.1 to obtain a serial dilution at a concentration of OD600 = 0.01.

to:

  1. For Pst19, make a 1/10 dilution from the initial resuspension at OD600 = 0.1 to obtain a serial dilution at a concentration of OD600 = 0.01.

Step 8.3 of the Protocol section was updated from:

  1. Set a timer for 3 min. Measure 6 mL of final inoculum (PstT1 OD600 = 0.0075 [section 6] or PstDC3000 OD600 = 0.005 [section 7]) and transfer 6 mL of inoculum to each plate with the 10-day-old seedlings.

to:

  1. Set a timer for 3 min. Measure 6 mL of final inoculum (Pst19 OD600 = 0.0075 [section 6] or PstDC3000 OD600 = 0.005 [section 7]) and transfer 6 mL of inoculum to each plate with the 10-day-old seedlings.

Step 8.11 of the Protocol section was updated from:

  1. Phenotype after 7–10 days for PstDC3000 or 10–14 days for PstT1 (section 11). If carrying out bacterial growth assays, collect leaf tissue after 4 days (sections 9 and 10) and then phenotype (section 11). Alternatively, perform phenotypic analysis and bacterial growth assays on separate sets of plants.

to:

  1. Phenotype after 7–10 days for PstDC3000 or 10–14 days for Pst19 (section 11). If carrying out bacterial growth assays, collect leaf tissue after 4 days (sections 9 and 10) and then phenotype (section 11). Alternatively, perform phenotypic analysis and bacterial growth assays on separate sets of plants.

Step 10.7 of the Protocol section was updated from:

  1. After obtaining colony counts (Figure 2B), normalize the counts to 0.01 g of tissue for seedlings and convert to log bacterial growth (Table 1).
    NOTE: The average mass of one Moneymaker-PtoS cotyledon is 0.01 g and is empirically determined22.
Genotype1 Column ATissue Weight (g) Column B# of Colonies in a spot Column CDilution factor for spot2 Column DAdjusted # of Colonies3 Column EDilution factor for serial dilution Column FTotal # of Colonies Column G (cfu/0.01 g)4Average # of Colonies (cfu/0.01 g) Column HAverage Log Growth (cfu/0.01 g (log10)) Column I
Sample 10.004 g10200calculated as: (C2 x 0.01 g) / B2 = 251000calculated as: (D2 x E2 x F2) = 5000000average for sample 1 through last sample: (ie. average G1:G3) = 7000000log of average ie. log(H2) = 6.85
Sample 20.003 g1520050100010000000
Sample 30.002 g62003010006000000
1Data shown for 3 samples
2Based on plating 5 µL x 200 for 1 mL
3Cotyledons are too small to core so colony counts were normalized to 0.01 g of tissue based on the average mass of one MoneyMaker-PtoS cotyledon (data not shown)
4Adjusted per mL based on volume plated

Table 1: Sample calculations for seedling bacterial growth assay. Sample calculations demonstrate how to normalize bacterial counts and determine log bacterial growth.

to:

  1. After obtaining colony counts (Figure 2B), normalize the counts to 0.1 g of tissue for seedlings and convert to log bacterial growth (Table 1).
    NOTE: The average mass of one Moneymaker-PtoS cotyledon is 0.1 g and is empirically determined22.
Genotype1 Column ATissue Weight (g) Column B# of Colonies in a spot Column CDilution factor for spot2 Column DAdjusted # of Colonies3 Column EDilution factor for serial dilution Column FTotal # of Colonies Column G (cfu/0.01 g)4Average # of Colonies (cfu/0.01 g) Column HAverage Log Growth (cfu/0.1 g (log10)) Column I
Sample 10.04 g10200calculated as: (C2 x 0.1 g) / B2 = 251000calculated as: (D2 x E2 x F2) = 5000000average for sample 1 through last sample: (ie. average G1:G3) = 7000000log of average ie. log(H2) = 6.85
Sample 20.03 g1520050100010000000
Sample 30.02 g62003010006000000
1Data shown for 3 samples
2Based on plating 5 µL x 200 for 1 mL
3Cotyledons are too small to core so colony counts were normalized to 0.1 g of tissue based on the average mass of one MoneyMaker-PtoS cotyledon (data not shown)
4Adjusted per mL based on volume plated

Table 1: Sample calculations for seedling bacterial growth assay. Sample calculations demonstrate how to normalize bacterial counts and determine log bacterial growth.

Step 11.3 of the Protocol section was updated from:

  1. Phenotype plants infected with PstT1 at 10–14 days after flood inoculation.

to:

  1. Phenotype plants infected with Pst19 at 10–14 days after flood inoculation.

Figure 4 in the Protocol section was updated from:

Tomato resistance-susceptibility diagram; PstDC3000, PstT1 assay; cultivars, mapping analysis.
Figure 4: Schematic representation of expected phenotypes for seedling resistance and death in various genetic backgrounds. (A) Seedlings of Rio Grande-PtoR and the near-isogenic cultivar Rio Grande-PtoS are displayed 7 days after flooding with PstDC3000 (OD600 = 0.005) + 0.015% surfactant. Rio Grande-PtoR displays consistent resistance, and Rio Grande-PtoS displays consistent susceptibility to infection with PstDC3000. These lines give rise to discrete and binary phenotypes. (B) Seedlings of a wild accession, such as Solanum neorickii LA1329, are shown 10 days after flooding with PstT1 (OD600 = 0.0075) + 0.015% surfactant. Seedlings display phenotypic variability but were recorded as binary phenotypes. The amount of phenotypic variability and the method of phenotyping (binary resistance or resistance spectrum) will depend on the particular accession tested. (C) Mapping populations generated by outcrossing wild accessions to susceptible cultivars may display a wider spectrum of phenotypes in F2 segregating populations. In this case, it may be most appropriate to record seedling phenotypes on a spectrum. Highly susceptible seedlings from a mapping population may be phenotyped for death as early as day 7 when flooded with PstT1, and typically show a brown apical meristem, no to very little extension of the epicotyl, and no new, green vegetative growth. The apical meristem of susceptible seedlings may stay green or very light brown for more time, and there may be some extension of the epicotyl and very little vegetative growth, which turns brown and arrests by day 10. Individual seedlings can be phenotyped for resistance based on the amount of new and ongoing vegetative growth by day 14. Seedlings can then be grouped based on the phenotypes described above into different categories of resistance such as weak, medium, or strong resistance. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Cultivar resistance diagram; tomato genotypes PstDC3000, Pst19, resistance vs. susceptibility analysis.
Figure 4: Schematic representation of expected phenotypes for seedling resistance and death in various genetic backgrounds. (A) Seedlings of Rio Grande-PtoR and the near-isogenic cultivar Rio Grande-PtoS are displayed 7 days after flooding with PstDC3000 (OD600 = 0.005) + 0.015% surfactant. Rio Grande-PtoR displays consistent resistance, and Rio Grande-PtoS displays consistent susceptibility to infection with PstDC3000. These lines give rise to discrete and binary phenotypes. (B) Seedlings of a wild accession, such as Solanum neorickii LA1329, are shown 10 days after flooding with Pst19 (OD600 = 0.0075) + 0.015% surfactant. Seedlings display phenotypic variability but were recorded as binary phenotypes. The amount of phenotypic variability and the method of phenotyping (binary resistance or resistance spectrum) will depend on the particular accession tested. (C) Mapping populations generated by outcrossing wild accessions to susceptible cultivars may display a wider spectrum of phenotypes in F2 segregating populations. In this case, it may be most appropriate to record seedling phenotypes on a spectrum. Highly susceptible seedlings from a mapping population may be phenotyped for death as early as day 7 when flooded with Pst19, and typically show a brown apical meristem, no to very little extension of the epicotyl, and no new, green vegetative growth. The apical meristem of susceptible seedlings may stay green or very light brown for more time, and there may be some extension of the epicotyl and very little vegetative growth, which turns brown and arrests by day 10. Individual seedlings can be phenotyped for resistance based on the amount of new and ongoing vegetative growth by day 14. Seedlings can then be grouped based on the phenotypes described above into different categories of resistance such as weak, medium, or strong resistance. Please click here to view a larger version of this figure.

The second paragraph of the Representative Results section was updated from:

Phenotypic screening of wild accessions using the seedling resistance assay
Figure 6 shows representative results for seedlings of susceptible and resistant accessions 10–14 days after flooding with PstT1. Susceptible accessions include RG-PtoR, S. pimpinellifolium LA1375, and S. pimpinellifolium LA1606, and resistant accessions include S. neorickii LA1329. Ten-day-old seedlings were flooded with 10 mM MgCl2 + 0.015% surfactant as a negative control, and PstT1 at an optical density of 0.0075 + 0.015% surfactant. The seedlings were phenotyped at least 10 days after flooding, as PstT1-infected seedlings died more slowly than PstDC3000-infected seedlings. Mock-inoculated seedlings were green, healthy, and actively growing. This control is important to ensure that the accessions are not sensitive to the concentration of surfactant, and to ensure there is no bacterial contamination. Susceptible accessions (Rio Grande-PtoR [n = 7], S. pimpinellifolium LA1375 [n = 7], and S. pimpinellifolium LA1606 [n = 5]) were dead, had brown apical meristems, and lacked new growth 10–14 days after inoculation with PstT1. In contrast, two S. neorickii LA1329 (n = 3) seedlings displayed a high level of new, green growth and survived infection with PstT1 (Figure 6). Three LA1329 seedlings did not germinate. Typically, 5–7 individuals were screened for each accession in a primary screen to determine the prevalence of resistance in the population. When a more genetically complex wild accession, such as LA1329, is flooded with PstT1, the resistance phenotypes display slightly more variability among individual seedlings, compared to Moneymaker-PtoR treated with PstDC3000. However, the resistance phenotypes were usually less variable than those seen in F2 mapping populations. Thus, binary phenotyping criteria was used for LA1329.

to:

Phenotypic screening of wild accessions using the seedling resistance assay
Figure 6 shows representative results for seedlings of susceptible and resistant accessions 10–14 days after flooding with Pst19. Susceptible accessions include RG-PtoR, S. pimpinellifolium LA1375, and S. pimpinellifolium LA1606, and resistant accessions include S. neorickii LA1329. Ten-day-old seedlings were flooded with 10 mM MgCl2 + 0.015% surfactant as a negative control, and Pst19 at an optical density of 0.0075 + 0.015% surfactant. The seedlings were phenotyped at least 10 days after flooding, as Pst19-infected seedlings died more slowly than PstDC3000-infected seedlings. Mock-inoculated seedlings were green, healthy, and actively growing. This control is important to ensure that the accessions are not sensitive to the concentration of surfactant, and to ensure there is no bacterial contamination. Susceptible accessions (Rio Grande-PtoR [n = 7], S. pimpinellifolium LA1375 [n = 7], and S. pimpinellifolium LA1606 [n = 5]) were dead, had brown apical meristems, and lacked new growth 10–14 days after inoculation with Pst19. In contrast, two S. neorickii LA1329 (n = 3) seedlings displayed a high level of new, green growth and survived infection with Pst19 (Figure 6). Three LA1329 seedlings did not germinate. Typically, 5–7 individuals were screened for each accession in a primary screen to determine the prevalence of resistance in the population. When a more genetically complex wild accession, such as LA1329, is flooded with Pst19, the resistance phenotypes display slightly more variability among individual seedlings, compared to Moneymaker-PtoR treated with PstDC3000. However, the resistance phenotypes were usually less variable than those seen in F2 mapping populations. Thus, binary phenotyping criteria was used for LA1329.

Figure 6 in the Representative Results section was updated from:

Plant resistance assay; petri dishes with seedlings; MgCl₂, PstT1 infection; comparative growth study.
Figure 6: Phenotypic characterization of resistance or disease symptoms 10–14 days post-infection in wild accessions. Rio Grande-PtoR, S. pimpinellifolium LA1606, S. pimpinellifolium LA1375 and S. neorickii LA1329 tomato seedlings were grown on 0.5x MS plates for 10 days, and then flooded with PstT1 (OD600 = 0.0075) + 0.015% surfactant. The number of surviving seedlings for each wild accession out of the total number tested is shown. Scale bar = 1 cm. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Plant-pathogen interaction in petri dishes; tomato seedlings, MgCl₂ treatment, pathogen resistance.
Figure 6: Phenotypic characterization of resistance or disease symptoms 10–14 days post-infection in wild accessions. Rio Grande-PtoR, S. pimpinellifolium LA1606, S. pimpinellifolium LA1375 and S. neorickii LA1329 tomato seedlings were grown on 0.5x MS plates for 10 days, and then flooded with Pst19 (OD600 = 0.0075) + 0.015% surfactant. The number of surviving seedlings for each wild accession out of the total number tested is shown. Scale bar = 1 cm. Please click here to view a larger version of this figure.

The third paragraph of the Representative Results section was updated from:

Quantitative assessment of bacterial growth using the seedling flood assay
To confirm that the observed resistance in LA1329 to PstT1 resulted in lower bacterial growth, bacterial growth assays were carried out in tomato seedlings. The level of PstT1 growth in Moneymaker-PtoS and S. neorickii LA1329 was determined 4 days post-infection. Moneymaker-PtoS is a near-isogenic line with consistent susceptibility among individual seedlings. Wild accessions such as S. neorickii LA1329 are often more genetically complex. LA1329 displays approximately 60% resistance to PstT1 across the population22. Because seedlings may drop their cotyledons after infection, one seedling was grown on each plate to correlate bacterial growth in the harvested cotyledon with overall seedling survival or death as determined phenotypically at least 10 days after flooding. The bacterial counts on day 4 for each seedling were normalized to 0.01 g of tissue and converted to log growth (CFU/0.01 g(log10)). Log growth for phenotypically resistant LA1329 seedlings (LA1329RES) or phenotypically susceptible seedlings (LA1329SUS) were separately pooled and compared to each other and the susceptible cultivar Moneymaker-PtoS. For example, there was a 1.7 log difference in bacterial growth between LA1329RES (log 6.3) and LA1329SUS (log 8.0), and a 1.6 log difference between LA1329RES (log 6.3) and Moneymaker-PtoS (log 7.9) (Figure 7). Therefore, phenotypic resistance correlated with quantitative resistance in the seedling assays.

to:

Quantitative assessment of bacterial growth using the seedling flood assay
To confirm that the observed resistance in LA1329 to Pst19 resulted in lower bacterial growth, bacterial growth assays were carried out in tomato seedlings. The level of Pst19 growth in Moneymaker-PtoS and S. neorickii LA1329 was determined 4 days post-infection. Moneymaker-PtoS is a near-isogenic line with consistent susceptibility among individual seedlings. Wild accessions such as S. neorickii LA1329 are often more genetically complex. LA1329 displays approximately 60% resistance to Pst19 across the population22. Because seedlings may drop their cotyledons after infection, one seedling was grown on each plate to correlate bacterial growth in the harvested cotyledon with overall seedling survival or death as determined phenotypically at least 10 days after flooding. The bacterial counts on day 4 for each seedling were normalized to 0.01 g of tissue and converted to log growth (CFU/0.01 g(log10)). Log growth for phenotypically resistant LA1329 seedlings (LA1329RES) or phenotypically susceptible seedlings (LA1329SUS) were separately pooled and compared to each other and the susceptible cultivar Moneymaker-PtoS. For example, there was a 1.7 log difference in bacterial growth between LA1329RES (log 6.3) and LA1329SUS (log 8.0), and a 1.6 log difference between LA1329RES (log 6.3) and Moneymaker-PtoS (log 7.9) (Figure 7). Therefore, phenotypic resistance correlated with quantitative resistance in the seedling assays.

Figure 7 in the Representative Results section was updated from:

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Bar chart of bacterial growth; cfu/0.01g (log 10) comparison in PstT1 infection study.
Figure 7: Resistant Solanum neorickii LA1329 seedlings support lower bacterial growth than Moneymaker-PtoS or susceptible S. neorickii LA1329. Bacterial counts were determined 4 days post-inoculation from S. neorickii LA1329 (n = 14) and Moneymaker-PtoS (n = 10) seedlings infected with PstT1 and normalization was performed to 0.01 g of tissue. For LA1329, the two phenotypic groups, susceptible (SUS) or resistant (RES), were observed and counted separately. Above the bar * = statistically significant difference determined by a one-factor analysis of variance. A general linear model procedure (p < 0.001) followed by a multiple comparison of means using Tukey's post hoc test was used. Error bars = standard error. The figure indicates one representative experiment. Please click here to view a larger version of this figure.

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Bar chart comparing bacterial cfu in tomato cultivars, highlighting resistance levels; Pst19 experiment.
Figure 7: Resistant Solanum neorickii LA1329 seedlings support lower bacterial growth than Moneymaker-PtoS or susceptible S. neorickii LA1329. Bacterial counts were determined 4 days post-inoculation from S. neorickii LA1329 (n = 14) and Moneymaker-PtoS (n = 10) seedlings infected with Pst19 and normalization was performed to 0.1 g of tissue. For LA1329, the two phenotypic groups, susceptible (SUS) or resistant (RES), were observed and counted separately. Above the bar * = statistically significant difference determined by a one-factor analysis of variance. A general linear model procedure (p < 0.001) followed by a multiple comparison of means using Tukey's post hoc test was used. Error bars = standard error. The figure indicates one representative experiment. Please click here to view a larger version of this figure.

The first paragraph of the Discussion section was updated from:

A protocol for flood inoculation with PstDC3000 or PstT1 optimized to detect resistance to these bacterial strains in tomato seedlings is described. There are several critical parameters for optimal results in the seedling resistance assay, including bacterial concentration and surfactant concentration, which were empirically determined22. For PstDC3000, the optical density was optimized to achieve complete survival on a resistant cultivar containing the Pto/Prf cluster and complete death on a susceptible cultivar lacking the Pto/Prf cluster22. For a strain such as PstT1, where there are no known resistant varieties, the optical density was optimized to be the lowest possible for consistent and complete plant death22. Uppalapati et al.24 designed a tomato seedling assay to investigate the pathogenesis of PstDC3000 and the virulence function of coronatine. In this virulence assay, infections were performed using bacteria concentrated to an OD600 of 0.124, 20x higher than the optical density of strains used in our resistance assay. Recognition of PstDC3000 effectors AvrPto and AvrPtoB in tomato seedlings carrying the Pto/Prf gene cluster results in ETI and a macroscopic HR22. In the context of a strong immune response such as ETI, a lower bacterial titer was used for PstDC3000 to avoid overwhelming genetic resistance from the Pto/Prf gene cluster22. In addition, these results suggest that a high bacterial concentration could overwhelm weaker immune responses such as PTI or quantitative partial resistance, where multiple genes contribute to the overall phenotype. Surfactant is necessary for the bacteria to adhere to the leaf surface; however, high concentrations can cause chlorosis of the leaf22. We previously tested a range of surfactant concentrations to empirically determine the ideal concentration in 10-day-old tomato seedlings22. When testing new species that may differ in their sensitivity to surfactant, the surfactant concentration should be optimized to identify a concentration that does not cause damage or chlorosis in the absence of bacteria. Appropriate assay conditions will require optimization of a surfactant concentration that does not cause damage, and a bacterial concentration that causes disease in all susceptible controls.

to:

A protocol for flood inoculation with PstDC3000 or Pst19 optimized to detect resistance to these bacterial strains in tomato seedlings is described. There are several critical parameters for optimal results in the seedling resistance assay, including bacterial concentration and surfactant concentration, which were empirically determined22. For PstDC3000, the optical density was optimized to achieve complete survival on a resistant cultivar containing the Pto/Prf cluster and complete death on a susceptible cultivar lacking the Pto/Prf cluster22. For a strain such as Pst19, where there are no known resistant varieties, the optical density was optimized to be the lowest possible for consistent and complete plant death22. Uppalapati et al.24 designed a tomato seedling assay to investigate the pathogenesis of PstDC3000 and the virulence function of coronatine. In this virulence assay, infections were performed using bacteria concentrated to an OD600 of 0.124, 20x higher than the optical density of strains used in our resistance assay. Recognition of PstDC3000 effectors AvrPto and AvrPtoB in tomato seedlings carrying the Pto/Prf gene cluster results in ETI and a macroscopic HR22. In the context of a strong immune response such as ETI, a lower bacterial titer was used for PstDC3000 to avoid overwhelming genetic resistance from the Pto/Prf gene cluster22. In addition, these results suggest that a high bacterial concentration could overwhelm weaker immune responses such as PTI or quantitative partial resistance, where multiple genes contribute to the overall phenotype. Surfactant is necessary for the bacteria to adhere to the leaf surface; however, high concentrations can cause chlorosis of the leaf22. We previously tested a range of surfactant concentrations to empirically determine the ideal concentration in 10-day-old tomato seedlings22. When testing new species that may differ in their sensitivity to surfactant, the surfactant concentration should be optimized to identify a concentration that does not cause damage or chlorosis in the absence of bacteria. Appropriate assay conditions will require optimization of a surfactant concentration that does not cause damage, and a bacterial concentration that causes disease in all susceptible controls.

The third paragraph of the Discussion section was updated from:

Pst is a foliar pathogen that preferentially colonizes the aerial parts of tomato seedlings, including the cotyledons24 (Figure 3). Therefore, qualitative phenotyping in the seedling flood assay focuses on growth and disease symptoms in aerial portions of the seedling, and tissue for the bacterial growth assay is sampled from the cotyledons for quantitative analysis. After flood inoculation, seedlings may die within 7–10 days after inoculation with PstDC3000 or 10–14 days after inoculation with PstT1, as discussed in section 11. Seedling death is visualized by a brown apical meristem, arrested epicotyl elongation, and/or arrested vegetative growth. If different bacterial strains are used, the timing will have to be empirically determined. In addition, the progression of disease on control plants should be monitored daily after flooding until a consistent time frame from the onset of disease symptoms to seedling death can be identified. Depending on the genotypes and treatments used in the flood assay, seedling phenotypes can be recorded as binary phenotypes or on a disease spectrum (Figure 4). A broader spectrum of phenotypes may be observed when flood inoculating F2 mapping populations from wild tomato accessions crossed to susceptible cultivars (Figure 4C). It may be best to phenotype segregating populations on a disease spectrum depending on how quickly the seedling dies and the degree of new vegetative growth and branching (Figure 4C). The seedling flood assay can also be used in conjunction with the seedling bacterial growth assay to quantitatively assess levels of bacterial growth associated with qualitative phenotypes in individual seedlings (Figure 7). Very large reductions (i.e., ~log 3) in bacterial growth or strong resistance in resistant seedlings of a wild accession compared to a susceptible cultivar suggest that the underlying genetic basis of resistance may be due to ETI22. Smaller reductions in bacterial growth (i.e., ~log 1.7), as observed in LA1329 seedlings, may be due to the contribution of weaker resistance from quantitative trait loci and/or PTI. Thus, the seedling growth assay can be an important tool in further characterizing resistance in wild tomato lines.

to:

Pst is a foliar pathogen that preferentially colonizes the aerial parts of tomato seedlings, including the cotyledons24 (Figure 3). Therefore, qualitative phenotyping in the seedling flood assay focuses on growth and disease symptoms in aerial portions of the seedling, and tissue for the bacterial growth assay is sampled from the cotyledons for quantitative analysis. After flood inoculation, seedlings may die within 7–10 days after inoculation with PstDC3000 or 10–14 days after inoculation with Pst19, as discussed in section 11. Seedling death is visualized by a brown apical meristem, arrested epicotyl elongation, and/or arrested vegetative growth. If different bacterial strains are used, the timing will have to be empirically determined. In addition, the progression of disease on control plants should be monitored daily after flooding until a consistent time frame from the onset of disease symptoms to seedling death can be identified. Depending on the genotypes and treatments used in the flood assay, seedling phenotypes can be recorded as binary phenotypes or on a disease spectrum (Figure 4). A broader spectrum of phenotypes may be observed when flood inoculating F2 mapping populations from wild tomato accessions crossed to susceptible cultivars (Figure 4C). It may be best to phenotype segregating populations on a disease spectrum depending on how quickly the seedling dies and the degree of new vegetative growth and branching (Figure 4C). The seedling flood assay can also be used in conjunction with the seedling bacterial growth assay to quantitatively assess levels of bacterial growth associated with qualitative phenotypes in individual seedlings (Figure 7). Very large reductions (i.e., ~log 3) in bacterial growth or strong resistance in resistant seedlings of a wild accession compared to a susceptible cultivar suggest that the underlying genetic basis of resistance may be due to ETI22. Smaller reductions in bacterial growth (i.e., ~log 1.7), as observed in LA1329 seedlings, may be due to the contribution of weaker resistance from quantitative trait loci and/or PTI. Thus, the seedling growth assay can be an important tool in further characterizing resistance in wild tomato lines.

The fourth paragraph of the Discussion section was updated from:

Typically, genetic screens have been performed on four- to five-week-old adult tomato plants to identify the genetic basis of P. syringae resistance in wild accessions20,21. Adult tomato plants require much longer growth times, require more space in the growth chamber, and are much larger plants, which means that usually few individuals are screened for each line. The seedling flood assay provides a powerful, alternative approach in the identification of P. syringae resistance in wild tomato accessions. Screening at the seedling stage permits a large sample size to be tested which can be particularly advantageous in detecting resistance in genetically complex populations. Reduced growth chamber space requirements and growth time facilitate a high-throughput approach and rapid detection of natural resistance in wild accessions to emerging pathogens. Furthermore, P. syringae resistance that was identified at the seedling stage in this assay is not restricted to the developmental stage. S. neorickii LA1329 and S. habrochaites LA1253 were initially identified at the seedling stage and also display resistance to PstT1 in adult plants as previously described22.

to:

Typically, genetic screens have been performed on four- to five-week-old adult tomato plants to identify the genetic basis of P. syringae resistance in wild accessions20,21. Adult tomato plants require much longer growth times, require more space in the growth chamber, and are much larger plants, which means that usually few individuals are screened for each line. The seedling flood assay provides a powerful, alternative approach in the identification of P. syringae resistance in wild tomato accessions. Screening at the seedling stage permits a large sample size to be tested which can be particularly advantageous in detecting resistance in genetically complex populations. Reduced growth chamber space requirements and growth time facilitate a high-throughput approach and rapid detection of natural resistance in wild accessions to emerging pathogens. Furthermore, P. syringae resistance that was identified at the seedling stage in this assay is not restricted to the developmental stage. S. neorickii LA1329 and S. habrochaites LA1253 were initially identified at the seedling stage and also display resistance to Pst19 in adult plants as previously described22.

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