In Vitro dirigió la evolución de una endonucleasa de restricción con una especificidad más estricta

Resumen

Las endonucleasas de restricción con nueva especificidad de secuencia se pueden desarrollar a partir de enzimas que reconocen una secuencia parcialmente degenerada. Aquí proporcionamos un protocolo detallado que utilizamos con éxito para alterar la especificidad de la secuencia de la enzima NlaIV. Los ingredientes clave del protocolo son la compartimentación in vitro de la reacción de transcripción/traducción y la selección de variantes con nuevas especificidades de secuencia.

Resumen

La ingeniería de especificidad de endonucleasa de restricciones (REase) es extremadamente difícil. Aquí describimos un protocolo de varios pasos que ayuda a producir variantes REase que tienen una especificidad más estricta que la enzima parental. El protocolo requiere la creación de una biblioteca de casetes de selección de expresiones (ESC) para las variantes del REase, idealmente con variabilidad en posiciones que puedan afectar a la unión al ADN. El ESC está flanqueado por un lado por una secuencia para la actividad del sitio de restricción deseada y una etiqueta de biotina y en el otro lado por un sitio de restricción para la actividad no deseada y un sitio de recocido de imprimación. Los ESC se transcriben y traducen en una emulsión de agua en aceite, en condiciones que hacen improbable la presencia de más de una molécula de ADN por gota. Por lo tanto, el ADN de cada molécula de casete se somete únicamente a la actividad de la enzima traducida y codificada. Las variantes REase de la especificidad deseada eliminan la etiqueta de biotina, pero no el sitio de recocido de imprimación. Después de romper la emulsión, las moléculas de ADN se someten a un pulldown de biotina, y sólo se conservan las del sobrenadante. Este paso garantiza que solo se conservan las ESC para las variantes que no han perdido la actividad deseada. Estas moléculas de ADN se someten a una primera reacción de PCR. El escote en la secuencia no deseada corta el sitio de encuadernación de la imprimación para una de las imprimaciones. Por lo tanto, PCR amplifica solamente los ESC de las gotas sin la actividad no deseada. A continuación, se lleva a cabo una segunda reacción de PCR para reintroducir el sitio de restricción para la especificidad deseada y la etiqueta de biotina, de modo que se pueda reiterar el paso de selección. Los marcos de lectura abiertos seleccionados pueden expresarse en células bacterianas que también expresan la metiltransferasa cognada del REase parental, porque el REase recién evolucionado se dirige sólo a un subconjunto de los sitios de destino de la metiltransferasa.

Introducción

La ingeniería de especificidad de secuencia es extremadamente difícil para los REases de clase II. En esta clase de endonucleasasas, el reconocimiento de secuencias y la catálisis están estrechamente entrelazados, probablemente como una salvaguardia evolutiva contra la creación de una endonucleasa de especificidad más amplia que su metiltransferasa cognada, que dañaría el ADN del huésped. La evolución dirigida de nuevas especificidades en las células se complica aún más por la necesidad de proteger el ADN del huésped contra la actividad de endonucleasa recién diseñada. Por lo tanto, hay sólo unos pocos intentos exitosos de ingeniería REase reportados y todos ellos explotar las características únicas de una enzima en particular^{1,2,3,4,5,6,7}.

Aquí proporcionamos un protocolo detallado para la ingeniería de especificidad que se puede utilizar para generar variantes de endonucleasa que tienen una especificidad más estrecha que una enzima parental que se basa en nuestra ingeniería exitosa de una endonucleasa NlaIV⁸. Para cualquier enzima de este tipo con una secuencia de reconocimiento arbitraria, se puede introducir una especificidad adicional para las bases en los flancos. Para las enzimas parentales que reconocen secuencias parcialmente degeneradas (como NlaIV con su objetivo GGNNCC), también se puede introducir especificidad adicional dentro de la secuencia de reconocimiento. Como es probable que la especificidad adicional requiera contactos proteico-ADN, las bases recientemente reconocidas deben estar dentro de la huella de la endonucleasa parental en el ADN. En principio, se pueden configurar esquemas de selección para cualquier especialización deseada de la secuencia de reconocimiento. Sin embargo, la mayoría de los REases que reconocen secuencias diana palindrómicas y casi palindrómicas son dimers funcionales que reconocen sólo un medio sitio del palíndromo. Por lo tanto, es poco probable que la selección de nuevas especificidades que violen la simetría de las interacciones nucleicas proteicas funcione. Para el NlaIV dimerico, por ejemplo, la secuencia GGNNCC teóricamente se puede reducir a GGATCC, pero se espera que reducir la especificidad a GGAACC sea más difícil. Nuestro esquema implica una selección positiva y negativa.

El proceso es más eficiente cuando la selección negativa también se utiliza para eliminar las especificidades capaces de cleave todas las secuencias que no sea la especificidad más estrecha preferida. Por ejemplo, la selección para GGATCC podría combinarse con la antiselección contra GGBVCC (donde B es cualquier base que no sea A, y V es cualquier base distinta de T). Cuando algunas de las posibles secuencias de destino no están cubiertas, el resultado del experimento de selección depende de la eficacia de la selección positiva y negativa. En nuestro trabajo NlaIV, seleccionamos para GGATCC, y contra GGSSCC (donde S es G o C), y obtuvimos una especificidad que, ignorando los objetivos de ruptura de simetría, podría describirse como GGWWCC (donde W es A o T), lo que sugiere que en este caso en particular, la selección negativa era más selección importante que positiva.

Nuestro enfoque comienza con la creación de un casete de selección de expresiones (ESC). El ESC se estructura en secciones. En la sección del núcleo interior, hay variantes del marco de lectura abierto (ORF) del REase, bajo el control del promotor T7. Esta sección principal del ESC no puede contener ningún sitio de cognado para el REase diseñado. El núcleo se intercala entre dos sitios de cognado para el tipo salvaje REase: un sitio de escote para la actividad no deseada (secuencia de contador seleccionada, GGSSCC en este ejemplo) y un sitio de escote para la actividad deseada (secuencia seleccionada, GGATCC en el ejemplo). El paso final de la preparación del ESC en PCR añade biotina cerca de la actividad deseada en el extremo de 5' y crea una variedad de secuencias seleccionadas de contador (GGSSCC en el ejemplo). La estrategia de selección se basa en el uso de imprimaciones cuidadosamente diseñadas en el protocolo de reamplificación ESC después de un protocolo in vitro de transcripción/traducción/selección(Figura 1A). La biblioteca ESC se expresa en una transcripción compartimentada in vitro de traducción de la emulsión agua en aceite^9,10,11. Dentro de cada gota, la especificidad de la enzima expresada afecta el estado de la ESC(Figura 1B,paso I). Para la disposición descrita, la actividad de escisión deseada de la proteína traducida elimina la etiqueta de biotina del ADN, pero no afecta al otro extremo ESC con la secuencia de contador seleccionada. Cuando se rompe la emulsión, los fragmentos biotinylados se eliminan mediante el desplegable de afinidad de estreptavidina, de modo que solo queden fragmentos de gotas con la actividad deseada(Figura 1B,paso II). Este paso elimina las variantes rease inactivas. La fracción sobrenadante del paso desplegable es entonces amplificada por PCR. En los primeros cebatos de reacción PCR se utilizan f2 y R1(Figura 1A,B,paso III). Primer F2 se une a la sección ESC entre la secuencia de contador seleccionada y el extremo de la molécula. Por lo tanto, los ESC que expresan variantes que son capaces de cortar la secuencia seleccionada del contador (y, por lo tanto, separan los sitios de unión para los imprimadores F2 y R1 en dos moléculas de ADN diferentes) no se amplifican y, por lo tanto, se eliminan de la biblioteca. El primer R1 se une entre el sitio seleccionado y el núcleo del ESC para que no se vea afectado por el estado de escisión del sitio seleccionado y restaure el sitio de escisión para la actividad deseada (GGATCC). El ciclo se cierra con un segundo PCR (con imprimaciones F1 y R2) que añade biotina en el extremo de 5' cerca del sitio seleccionado y restaura la variación diseñada en el sitio seleccionado del contador cerca del extremo opuesto del ESC(Figura 1B,paso IV). La mezcla de ADN resultante está lista para otra ronda de selección.

El éxito del protocolo de selección depende en gran medida de la elección adecuada de la nueva secuencia de reconocimiento de objetivos más estricta y del diseño cuidadoso de la estrategia de mutagénesis y su implementación efectiva. Debido a que es mucho más fácil mejorar las ligeras preferencias preexistentes del REase que superarlas, recomendamos comenzar con un estudio cinético de cualquier preferencia preexistente. La necesidad de un diseño cuidadoso de la mutagénesis resulta del tamaño limitado de una biblioteca mutante que puede ser procesada por el protocolo presentado (10⁹ clones en un solo experimento). Por lo tanto, las 20 posibles sustituciones de aminoácidos se pueden probar eficazmente en sólo unas pocas posiciones (ver discusión). La mutagénesis aleatoria, como la PCR propensa a errores (EP-PCR) presentada como un método alternativo, conducirá a un profundo submuestreo de la complejidad existente. Si hay disponible alguna información sobre posibles posiciones de aminoácidos implicadas en contactos con ADN (o incluso situadas cerca de los nucleótidos degenerados en una secuencia deconada), ciertamente debe utilizarse para seleccionar algunos aminoácidos para la mutagénesis de saturación guiada por oligonucleótidos (pasos de protocolo 1.6-3.10).

Protocolo

1. Preparación de ESCs

1. Clonar metiltransferasa del sistema de restricción-modificación para ser diseñado en un plásmido de bajo número de copia (por ejemplo, pACYC184 o pACYC174 o sus derivados).
   NOTA: La cepa bacteriana del huésped debe ser capaz de tolerar la metilación introducida por la enzima clonada y proporcionar una expresión inducible de la arnasa T7 polimerasa. Se recomienda el uso de la cepa ER2566 (portadora de mutaciones McrA, McrBC y Mrr).
2. Confirme que el ADN de plásmido recombinante está protegido contra el escote mediante la endonucleasasa cognado mediante el tratamiento de 0,5 g de ADN plásmido con 10 unidades de REase cognado en tampón y temperatura recomendado por el proveedor de enzimas durante 2 horas.
3. Preparar células competentes de esta cepa.
   NOTA: Se puede utilizar cualquier método. El proyecto de ingeniería NlaIV utilizó un método simple de cloruro de calcio^12.
4. Construir plásmido recombinante con el ORF para el REase bajo el control del promotor T7 de un grupo de exclusión diferente y con un marcador de selección diferente al que contiene el gen metiltrasferasa en el paso 1.1. Se pueden utilizar vectores pET28 y pET30.
5. Eliminar todos los sitios de reconocimiento de la enzima diseñada de la sección del plásmido recombinante entre el promotor T7 y el codón de parada de la enzima ORF mediante la introducción de mutaciones silenciosas(Figura 2,Tabla 1A).
   NOTA: Si se debe eliminar más de uno de estos sitios, serán necesarias varias rondas de mutación (pasos 1.5.1–1.5.7).
   1. Utilice una reacción pcR de adentro hacia afuera que amplifica el plásmido de longitud completa con variaciones diseñadas introducidas en los extremos de 5' de las imprimaciones(Tabla 2A).
   2. Elimine el ADN de la plantilla añadiendo 10 U de endonucleasa dpnI a los 50 s de la reacción de PCR e incubar durante 2 h a 37 oC.
   3. Resolver los productos mediante electroforesis de gel de agarosa. Corta la banda correspondiente al plásmido de cuerpo entero y purificarla con un kit comercial.
   4. Añadir 10x tampón de ligación (a una concentración 1x) y suplemento con ATP (a 1 mM). Añadir 10 U de polinucleótido quinasa T4 e incubar durante 20 min a 37oC. Inactivar la enzima calentando a 70 oC durante 10 min.
   5. Añadir PEG 4000 a 5%, complementar de nuevo con ATP (a 1 mM), y añadir 5 U de ligasa de ADN T4. Incubar durante 2 h a temperatura ambiente (RT).
   6. Transformarse en una cepa bacteriana competente que lleva la cognate metiltransferasa (paso 1.1).
   7. Aísle el ADN plásmido a pequeña escala y confirme la introducción de cambios de secuencia por secuenciación dideoxi.
6. Introducir sitios de restricción únicos cercanos a las secuencias a las que se dirige la mutagénesis guiada por oligonucleótidos(Figura 2, Tabla 1B). Siga los pasos 1.5.1–1.5.7 para cada sitio.
   NOTA: Este paso solo se realiza cuando se utiliza una mutagénesis dirigida. Si realiza mutagénesis aleatoria, omita los pasos 2-3 y proceda a la sección 3 en su lugar. En el ejemplo presentado, todos los sitios se introdujeron aguas arriba de las regiones de destino, pero también se pueden introducir aguas abajo.
7. Imprimaciones de diseño para la amplificación del ESC (Tabla 1C).
   1. Diseñar una unión de imprimación inversa aguas abajo del ORF endonucleado que introducirá el sitio de reconocimiento seleccionado (R1) y su versión más corta (R2) que se une fuera de la secuencia NlaIV seleccionada y contiene biotina en el extremo de 5' (ver Figura 1).
   2. Diseñar una imprimación delantera (F1) que se adhiera al ESC aguas arriba del promotor T7. Esta imprimación también debe introducir variantes contraseleccionadas de la secuencia de reconocimiento original (es decir, el máximo de variaciones de secuencia reconocidas por la enzima original con la excepción de la secuencia inversa seleccionada).
      NOTA: Una versión más corta de esta imprimación (F2) que cubre la secuencia distal a la secuencia contraseleccionada se utilizará más adelante en el PCR selectivo (paso 5.9).

2. Síntesis dividida y mixta de imprimadores mutagénicos

NOTA: Este paso solo se utiliza para proyectos que requieren mutagénesis de subsaturación en más de un sitio. Se requiere un sintetizador con múltiples columnas de síntesis. Asigne columnas para la síntesis de trillizos de codón NNS aleatorios y trillizos de codón de tipo salvaje de acuerdo con las frecuencias de mutagénesis. Por ejemplo, si hay siete columnas de síntesis de volumen iguales disponibles y es deseable una tasa de mutagénesis de 0,3 en un sitio determinado, agregue codones NNS aleatorios en 0,3 x 7 o dos columnas, y codones de tipo salvaje en 0,7 x 7 o cinco columnas(Figura 3).

1. Decida sobre los sitios para la mutagénesis de subsaturación. Elija frecuencias de mutagénesis de acuerdo con la importancia hipotética de los sitios (es decir, cuanto más importante sea el sitio, mayor será la frecuencia), teniendo en cuenta los límites de la complejidad general de la biblioteca (ver Discusión).
2. Sintetizar oligonucleótidos en todas las columnas, hasta el triplete inmediatamente anterior al segundo sitio de mutagénesis de subsaturación contando desde el extremo 3' . No retire el grupo protector de 5'-trityl en el último ciclo de síntesis (utilice la opción triyl-on en el sintetizador). El grupo de protección se eliminará al principio del siguiente ciclo de síntesis (paso 1 en la Figura 3).
3. Abra las columnas de síntesis. Recoger el soporte de síntesis de vidrio de poro controlado (CPG) en un tubo seco de 1,5 ml y mezclar por vórtice. Reparticione la resina CPG mixta en nuevas columnas de síntesis. Evite introducir humedad, ya que disminuirá el rendimiento general (pasos 2 y 4 en la Figura 3).
4. Continuar la síntesis, a partir del triplete del sitio de mutagénesis de subsaturación. Asigne columnas a trillizos NNS aleatorios o trillizos de tipo salvaje según la frecuencia de mutagénesis deseada (ver nota anterior). Si hay sitios de subsaturación adicionales, proceda únicamente al triplete que precede al siguiente sitio de mutagénesis de subsaturación. Una vez más, deje un grupo de 5'-trityl al final (opción 5'-trityl-on en el sintetizador) (paso 3 en la Figura 3). A continuación, continúe con el paso 2.3.
5. Si no hay más sitios de subsaturación en sentido descendente, complete la síntesis, dejando un grupo de 5'-trityl al final (opción 5'-trityl-on en el sintetizador) (paso 5 en la Figura 3).
6. Desproteja y purifique la biblioteca de oligonucleótidos de acuerdo con las instrucciones del fabricante del cartucho de purificación.
   NOTA: Los oligonucleótidos liberados por la desprotección del CPG también se pueden purificar en la fase inversa de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) con tritilo-on seguido de una eliminación manual del grupo de tritilo (1 h de tratamiento con 80% de ácido acético a RT) y una segunda purificación de HPLC.
7. Compruebe la calidad de la biblioteca de oligonucleótidos en un gel de urea-PAGE.

3. Generación de bibliotecas de variantes

NOTA: Utilice el plásmido recombinante del paso 1.6.

1. Genere las bibliotecas mediante mutagénesis dirigida por oligonucleótidos.
   NOTA: Alternativamente, utilice el protocolo EP-PCR (paso 3.2).
   1. Amplificar una sección desde el promotor T7 hasta el sitio único de enzimas de restricción que flanquea la secuencia dirigida con mutagénesis (en el caso de NlaIV: SalI, EcoRI o Eco52I)(Tabla 1B-C, Tabla 2B, Figura 4). Amplificar la segunda parte desde el sitio de enzimas de restricción único hasta el extremo de 3' del ESC.
   2. Mezcle por separado 5 l de las reacciones de PCR (a partir del paso 3.1.1) con 8 ml de agua, 1,5 ml de tampón de enzimas de restricción de 10x y 5 unidades de las enzimas de restricción apropiadas (SalI, EcoRI o Eco52I) e incubar a la temperatura adecuada durante 2 horas.
   3. Resolver los productos de ambas reacciones utilizando electroforesis de gel de agarosa. Corte las bandas de tamaño esperadas y purifique con un kit comercial.
   4. Ejecutar hasta 1/3 de los productos purificados en un gel de agarosa y medir la concentración de cada banda purificada por densitometría.
   5. Configurar la ligadura de dos partes de los ESC en una relación molar 1:1 con 1x tampón de ligasa y 1 U de ligadosa de ADN T4 e incubar durante 2 h a RT.
   6. Resolver los productos de reacción en el gel de agarosa. Corte los productos de tamaño esperado y purifique con un kit comercial.
   7. Amplificar los productos de ligadura purificados en una reacción PCR con imprimaciones F1 y R2(Tabla 1C y Tabla 2A). No ejecute más de 20 ciclos de amplificación.
   8. Fracciona las reacciones de PCR en un gel de agarosa. Corte los productos y purificar con un kit comercial.
   9. Ejecuta una alícuota de 5 l de la biblioteca purificada a partir del paso anterior en el gel de agarosa y mide la concentración por densitometría.
   10. Clonar una pequeña muestra de la biblioteca (hasta 5 l) y secuencia >15 clones para comprobar la frecuencia y distribución de la mutación (Tabla 3). Continúe con el paso 4.
       NOTA: Alternativamente, se puede utilizar la secuenciación de alto rendimiento de la pequeña muestra de los ESC.
2. Realizar EP-PCR.
   1. Amplificar el ESC del plásmido obtenido en el paso 1.5.7 con las imprimaciones F1 y R1. Ejecutar 20 ciclos con Taq I polimerasa (Tabla 1B).
   2. Gel purificar el producto PCR.
   3. Configure EP-PCR con 2 ng de producto PCR purificado del paso anterior y ejecute 15 ciclos de EP-PCR(Tabla 1C)con imprimaciones F1 y R1.
   4. Gel purificar el producto y cuantificarlo por densitometría de gel.
      NOTA: Debido a la baja concentración del producto EP-PCR purificado, utilice aproximadamente 1/3 para la cuantificación.
   5. Clonar una pequeña muestra de la biblioteca (hasta 1/5) y secuencia >15 clones para comprobar la frecuencia y distribución de mutaciones (Tabla 4).
      NOTA: Alternativamente, realice la secuenciación de alto rendimiento de la pequeña muestra de los ESC.

4. Realización de la reacción de transcripción-traducción compartimentada in Vitro

1. Prueba de expresión endonucleasa y actividad enzimática en transcripción-traducción in vitro.
   1. Preparar un sustrato corto (200–500 bp) con un único sitio de reconocimiento para la endonucleasa ubicada cerca del centro de la molécula para que la reacción de escisión pueda detectarse fácilmente.
      NOTA: La forma más fácil de preparar el sustrato es mediante la amplificación pcR de un fragmento apropiado de cualquier molécula de ADN. El sustrato puede ser radioetiquetado o etiquetado fluorescentemente para simplificar la detección de escote.
   2. Configurar 50 l de una reacción de transcripción-transcripción con 0,5 g de ESC de tipo salvaje de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Añadir sal de magnesio (MgCl_2,MgSO₄y acetato de magnesio se puede probar) a 1,5 mM y la cantidad adecuada de sustrato del paso anterior (al menos 0,5 g en caso de ADN sin etiquetar).
      NOTA: Se puede utilizar cualquier kit de transcripción/traducción que no contenga nucleasa activada por magnesio. Algunos proveedores de kits utilizan nucleasas para eliminar la contaminación del ADN durante la producción y luego agregan quelantes como inhibidores de la nucleasa. Estos kits no son compatibles con este método.
   3. Incubar la reacción de transcripción-traducción de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación, transfiera la mezcla de reacción a la temperatura óptima para la enzima de restricción durante 2 h.
   4. Analizar la escisión del sustrato en un gel de agarosa seguido de una detección adecuada (por ejemplo, tinción de ADN, visualización de la fluorescencia o autoradiografía) (Figura 5).
      NOTA: Es necesario al menos el escote parcial del sustrato antes de proceder con la compartimentación. Si esto no se logra, es necesaria una mayor optimización de la forma química de magnesio o su concentración.
2. Preparar una mezcla aceite-surfactante añadiendo 225 ml de Span 80 y 25 éL de Tween 80 a 5 ml de aceite mineral en un tubo cónico de 15 ml. Mezclar bien invirtiendo suavemente el tubo 15x.
3. Para cada biblioteca transfiera 950 l de la mezcla aceite-surfactante a un vial criogénico de fondo redondo de 2 ml, etiquete con el nombre de una biblioteca y transfiera al hielo. Coloque una pequeña barra de agitación cilíndrica (5 x 2 mm²) en cada vial.
4. Preparar una mezcla de reacción de transcripción-traducción in vitro (50 l para cada biblioteca) de acuerdo con las sugerencias del fabricante. Complementar la mezcla con cloruro de magnesio a una concentración final de 1,5 mM (ver paso 4.1.4).
5. Dispensar alícuotas de 50 ml en tubos de 1,5 ml sobre hielo.
6. Añadir 1.7 fmole de la biblioteca (de la sección 3) a la mezcla de reacción sobre hielo.
   NOTA: No utilice una mayor cantidad de biblioteca de expresiones para la eficiencia de la selección. Es crucial minimizar la frecuencia de las gotas acuosas que contienen más de una molécula de ADN.
7. Prepare la emulsión de agua en aceite consecutivamente para cada biblioteca.
   1. Coloque un vaso de precipitados pequeño (o una taza de botella grande) lleno de hielo en un agitador magnético con la velocidad de agitación establecida a 1.150 rpm.
   2. Transfiera un vial criogénico con 950 ml de mezcla aceite-surfactante y una pequeña barra de agitación del paso 4.3 a un vaso helado en el agitador magnético. Compruebe que la barra de agitación esté girando.
   3. Añadir cinco alícuotas de 10 l de la mezcla in vitro biblioteca-transcripción-traducción durante un período de 2 minutos en intervalos de 30 s y continuar revolviendo durante un minuto adicional. Transfiera el vial con la emulsión a un recipiente de hielo. Continúe con la siguiente biblioteca a partir del paso 4.7.2.
   4. Después de que todas las bibliotecas se procesan iniciar la incubación de todas las bibliotecas de acuerdo con las recomendaciones del fabricante del kit.
8. Transfiera los viales a la temperatura óptima para la endonucleasa de ingeniería durante 2 h adicionales y luego colóquelos en hielo durante al menos 10 minutos.

5. Procesamiento continuo de bibliotecas y selección

1. Transfiera las emulsiones de los viales criogénicos a tubos fríos de 1,5 ml, añada 1 ml de EDTA de 0,5 M y centrifugarlas a 13.000 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
2. Retire la fase superior del aceite con una pipeta. Si una interfase aceite-agua no es visible, incubar el tubo durante al menos 5 minutos a -20 oC para congelar la fase acuosa, luego pipetee inmediatamente la fase de aceite líquido.
3. Añadir 100 ml de 10 mM Tris HCl pH 8.0 e inmediatamente realizar la extracción con 150 l de fenol:cloroformo (1:1 v/v) mediante vórtice corto seguido de separación de fase por 30 s centrifugación a 13.000 x g. Recoger la fase acuosa superior.
4. Precipita rallaelidad del ADN añadiendo 0,1 vol (15 l) de acetato de sodio de 3 M (pH a 5,2), 2,5–5 g de glucógeno y 2,5 vol (375 ml) de etanol. Incubar a -20oC durante 1 h y centrifugar durante 15 min a 13.000 x g,4oC. Deseche el sobrenadante y lave brevemente el pellet con 1 ml de etanol frío 70%.
5. Seque el pellet de ADN/glucógeno en una speedvac o seque al aire durante >5 min.
6. Disolver el pellet en 50 s de 10 mM Tris-HCl (pH a 7,5). Añadir 5 l de perlas magnéticas de estreptavidina preparadas de acuerdo con las instrucciones del fabricante y mezclar durante 1 h en RT, preferiblemente en un mezclador de carrusel o mediante vórtice suave.
7. Separe las cuentas en un soporte magnético y recoja el líquido enriquecido en el ADN sin biotina.
8. Concentrar el ADN por precipitación de etanol (pasos 5.4–5.5).
9. Disolver el ADN concentrado del paso anterior en 5 ml de agua y utilizar como plantilla en una reacción pcR con imprimaciones F2 y R1 (Tabla 1A).
   NOTA: Para evitar problemas con la contaminación de la plantilla y minimizar los artefactos de PCR, utilice Taq polimerasa (no Pfu o Phusion) y ejecute de 18 a 20 ciclos con el tiempo de extensión proporcional al tamaño de la plantilla (1 kb a 1 min) (véase el Cuadro 2B).
10. Fraccionar el producto PCR en un gel de agarosa y cortar el producto de tamaño esperado. Algunos frotis indican que hay productos de diferentes tamaños (ver Figura 6). Purificar el ADN de la losa de gel con un kit comercial.
11. Ejecute una segunda reacción de PCR con hasta 50 ng de ADN del paso 5.10 y imprima F1 y R2 utilizando el mismo protocolo que en el paso 5.9. Proceda con la purificación del producto como se describe en 5.10. El ADN purificado después de la cuantificación por densitometría de gel de agarosa (no espectroscopia UV) se puede utilizar en la siguiente ronda de selección in vitro (paso 4.6).

6. Variantes de pantalla para la especificidad de la secuencia alterada

1. Clonar variantes seleccionadas.
   1. Digerir el producto del paso 5.10 durante 2 h con 10 U de enzimas de restricción adecuadas para la clonación del ORF en el vector de expresión (para NlaIV: NcoI y XhoI) en la temperatura y tampón recomendados por el proveedor de enzimas. Resuelva los productos con electroforesis de gel de agarosa y aísle el fragmento de tamaño esperado.
   2. Preparar el vector plásmido (por ejemplo, pET28) por doble escisión con las mismas enzimas que en el paso 6.1.1 y purificar el producto con un kit comercial de purificación de gel de ADN.
   3. Estimar las concentraciones de vector e insertar por densitometría con electroforesis de gel de agarosa.
   4. Configure una ligadura con 1–5 U de ligadosa de ADN T4 y vector:inserte la relación molar 1:3–1:5 en 1x tampón de la ligasa recomendado por el proveedor de enzimas. Incubar durante 2 h en RT e introducir en bacterias huésped apropiadas (a partir del paso 1.3) por transformación o electroporación¹².
   5. Seleccione extransformadores en placas LB que contengan el antibiótico adecuado (50 g/ml de kanamicina para vectores pET28 o pET30) y 1% de glucosa.
2. Variantes de proteínas exprés.
   1. Inocular colonias individuales a partir de la transformación (hasta 24 clones se pueden procesar fácilmente en una sola carrera) en 2 ml de LB con kanamicina (50 g/ml) y 1% de glucosa y crecer durante la noche a 37 oC con agitación.
   2. Inocular 15 ml de LB caliente (37 oC) que contiene 100 g de kanamicina y sin glucosa con 0,75 ml del cultivo nocturno e incubar a 37oC con agitación vigorosa.
      NOTA: Se pueden utilizar tubos centrífugos de 50 ml o matraces Erlenmayer de 100 ml.
   3. Añadir 176 l de glicerol a 1 ml de cultivo nocturno (concentración final de glicerol á 15%) mezclar a fondo y congelar a -70 oC.
   4. Después de 2-3 h suplemento 15 mL de la cultura (del paso 6.2.1) con IPTG a 1 mM y cultivo por 5 h adicional.
   5. Recoger el pellet bacteriano por centrifugación (10.000 x g,4 oC, 10 min) y congelar a -70 oC.
3. Purificar las variantes proteicas.
   1. Transfiera la suspensión de resina de afinidad de níquel de 20 ml en 200 ml de tampón B1 en un tubo de 1,5 ml con una punta de pipeta de diámetro ancho, mezcle suavemente y centrífuga (5.000 x g,30 s, 4 oC). Retire el sobrenadante pipeteando y deje el tubo en hielo.
   2. Resuspenda el pellet bacteriano del paso 6.2.5 en 300 oL de B1 por vórtice vigoroso. Transfiera la suspensión a un tubo de 1,5 ml.
   3. Añadir 3 l de cóctel inhibidor de la proteasa de 100x y solución de lisosoma en B1 (concentración final de 1 mg/ml). Desintegrar las células por sonicación con una sonda equipada con punta. Utilice seis ráfagas de 10 s por muestra con >15 s de tiempo de enfriamiento de punta en el hielo en el medio. Mantenga las suspensiones celulares en hielo todo el tiempo.
   4. Residuos de células de pellets por centrifugación (2 min, 12,000 x g, 4oC) y transferir 250 oC de sobrenadante a la resina alícuota desde el paso 6.3.1.
   5. Mezclar durante 15 minutos en una sala fría, preferiblemente en una batidora de carrusel o mediante vórtice suave.
   6. Centrífuga (5.000 x g,30 s, 4oC) y aspira el sobrenadante con una pipeta.
   7. Añadir 500 s l de tampón W y resuspender suavemente la resina. Centrífuga (5.000 x g,30 s, 4oC) y aspira el sobrenadante con una pipeta.
   8. Repita el paso 6.3.7.
   9. Añadir 20 l de tampón E, resuspender suavemente la resina y dejar la muestra en hielo durante 2-5 min. Centrifugar (5.000 x g,30 s, 4 oC) y recoger el sobrenadante.
   10. Repita el paso 6.3.9. Supernatants de piscina.
   11. Analizar las muestras de proteínas por SDS-PAGE (5-10 l)(Figura 7).
4. Pantalla para variantes con la especificidad alterada.
   1. Ensayo de la actividad del escote en el ADN lambda del bacteriófago. La muestra de proteína puede constituir hasta el 10% del volumen de reacción final. Un total de 2 ml de muestra de proteína por cada 0,5 g de ADN y 2 h de tiempo de reacción es un buen punto de partida.
   2. Analizar los productos de reacción mediante electroforesis de gel de agarosa junto con los productos generados por la enzima de tipo silvestre. Seleccione los clones que generan patrones de escisión claramente distinguibles del generado por la enzima de tipo salvaje para su posterior análisis(Figura 8).

Resultados

Este protocolo es sólo una herramienta para aumentar la frecuencia de las variantes deseadas de un REase diseñado agotando (pero no eliminando) dos clases no deseadas: enzimas inactivas y endonucleasas con especificidad de secuencia de tipo salvaje sin cambios. Por otro lado, debido a que cambiar la especificidad de REase es extremadamente difícil, encontrar incluso una de estas variantes produciendo un patrón de escisión que sea diferente de la enzima de tipo salvaje en un solo cribado de 24 clones debe considerarse un éxito. En nuestras manos las mejores pantallas podrían identificar hasta el 20% de las variantes prometedoras(Figura 8A).

El resultado positivo depende en gran medida de la calidad de la biblioteca (es decir, la frecuencia limitada de sustituciones y su distribución aleatoria) y de la captura eficiente de la población biotinicada de los miembros de la biblioteca (pasos 3.6 a 3.7). Ambos problemas se pueden detectar. La calidad de la biblioteca debe comprobarse antes de la selección mediante la secuenciación de tantos clones como sea posible (>15) o mediante la secuenciación directa de la biblioteca mediante la secuenciación de alto rendimiento (paso 3.10, Tabla 3). Si la mayoría de los clones seleccionados no están activos, esto es una indicación clara de un error de la selección de captura de estreptavidina. Un efecto similar se observa en el caso de las bibliotecas que sufren muchos ciclos de selección, porque estas bibliotecas están probablemente dominadas por variantes inactivas que escaparon del paso de selección de captura de estreptavidina(Figura 8B). Por lo tanto, es aconsejable ejecutar el cribado después de cada ciclo de selección y desarrollar más variantes prometedoras seleccionadas manualmente en lugar de depender de la iteración de la selección.

Figura 1: Selección in vitro de una nueva especificidad de secuencia basada en la ingeniería NlaIV. (A) La organización del casete de expresión/selección (ESC) incluye dos sitios de reconocimiento para REase, 1) la secuencia seleccionada (GGATCC) cerca del extremo derecho y 2) la secuencia seleccionada del contador (GGSSCC) cerca del extremo izquierdo, así como el promotor T7p y T7t-T7 y el terminador T7. Los sitios de encuadernación de imprimación se muestran a continuación. El escote por tipo salvaje y las variantes NlaIV seleccionadas se muestran como triángulos rojos y verdes respectivamente. (B) Pasos del ciclo de selección: I) Emulsificación de las mezclas de reacción transcripción-traducción-escisión con la biblioteca ESC; II) Todo el ADN biotinilado se captura en partículas magnéticas recubiertas con estreptavidina y se elimina, eliminando así las variantes inactivas de codificación; III) Los ESC que codifican REases con actividad de tipo salvaje (es decir, aquellos capaces de corte rinde la secuencia GGSSCC) se eliminan porque el escote de la secuencia separa los sitios de enlace para las imprimaciones delanteras e inversas. Por lo tanto, no se produce ninguna amplificación de estos ESC; IV) La entrada para la siguiente ronda de selección se crea mediante la adición de biotina en el extremo derecho y la reintroducción de la variación del contador seleccionado en el extremo izquierdo. ⁸ con permiso de Elsevier. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Preparación del ESC. El fragmento derivado de la construcción original en un vector de expresión que contiene NlaIV ORF bajo el control del promotor T7 se modificó para que fuera adecuado para la expresión/selección. El sitio NlaIV aguas abajo del NlaIV ORF fue eliminado y sitios únicos (SalI, EcoRI y Eco52I) que se utilizaron para mutar las posiciones seleccionadas fueron introducidos en el NlaIV ORF como mutaciones silenciosas. La construcción final se amplificó con imprimaciones de flanqueo que introdujeron dos sitios NlaIV flanqueantes: la secuencia de contador seleccionada (GGSSCC) a la izquierda y la secuencia seleccionada (GGATCC) a la derecha. La imprimación inversa también introdujo biotina. Los imprimaciones utilizadas en la creación de ECS mutado se muestran como flechas azules y se etiquetan a continuación (véase el Cuadro 1B,C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Esquema de síntesis de división y mezcla. El ejemplo se refiere a la síntesis de imprimación MutB donde se introdujo una secuencia NNS a una frecuencia de 0,8 en cuatro posiciones (véase también el Cuadro 3). Tenga en cuenta que la síntesis química se lleva a cabo de 3' a 5', pero todas las secuencias se muestran en orientación canónica 5'-3' (es decir, procede de derecha a izquierda en este esquema). Las secuencias de tipo salvaje en posiciones mutagenizadas se muestran en verde, mientras que las secuencias mutagénicas NNS están en rojo. Se subraya el sitio de reconocimiento SalI que más tarde se utiliza para introducir mutaciones en los ESC. Se indican los puntos de mezcla y división de pasos (2 y 4). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Uso de sitios de enzimas de restricción únicos en mutagénesis dirigida a oligonucleótidos. La estrategia de introducción de mutaciones se muestra en un ejemplo de la construcción de bibliotecas A-C (véanse los pasos 3.1–3.7). ⁸ con permiso de Elsevier. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Escote endonucleólítico en transcripción-traducción in vitro. (A) Escisión de un sustrato de ensayo en tampón REase óptimo: 1) Sustrato, producto PCR de 612 bp con un único sitio de reconocimiento NlaIV; 2) Productos de escisión, 355 bp y 257 bp. (B) Escisión en una reacción de transcripción-traducción in vitro (que contiene 0,5 g de ESC): 1–2) alícuotas de 15 ml de traducción de transcripción in vitro sin sustrato (línea 2: reacción suplementada con 1,5 mM MgCl_2); 3–4) Alícuotas de 15 l de transcripción-traducción in vitro con 1 g de sustrato de ensayo; (línea 4: reacción suplementada con 1,5 mM MgCl₂). Marcador de tamaño S-DNA (pBR322 digerido con MspI). Las muestras se resolvieron en un 6% de PAGE nativo. El ADN estaba manchado con bromuro de etidio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Productos del primer PCR en el ciclo de selección. Vea la Figura 1B, paso III; protocolo 5.10. Los conjuntos de columnas 1 y 2 son alícuotas de dos bibliotecas diferentes cargadas por triplicado. Estándar de tamaño S-DNA (ADN lambda digerido con HindIII y EcoRI). La flecha indica la posición del ESC de longitud completa (1.050 bp). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Variantes NlaIV purificadas para su posterior cribado en miniescala. Consulte el paso 6.3.11. Cada línea contiene una alícuota de 10 l de una variante diferente. Estándar de peso molecular de proteína S. La masa molecular de la subunidad NaIV REase es de 29,9 kDa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Ejemplos de cribado de variantes NlaIV para la alteración de la especificidad de la secuencia. Consulte el paso 6.4.2. (A) Cribado exitoso con alta frecuencia de variantes prometedoras. S - marcador de tamaño de ADN, ADN lambda estallado con HindIII y EcoRI; tipo salvaje (wt) - ADN lambda se vacíe con el tipo salvaje NlaIV; • Sustrato de ADN lambda, no se lanzó; otras columnas-variantes con muy baja actividad. ¡Las variantes están etiquetadas ! • variantes prometedoras que producen un patrón de escote distinto de la enzima de tipo salvaje; ? • Variantes que también podrían tener una preferencia de secuencia alterada. (B) Cribado infructuoso, con una mayoría de variantes inactivas y una variante con patrón de escote aparentemente inalterado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9: Selección alternativa por ligadura. Esta alternativa se puede utilizar para todos los REases que generan extremos pegajosos. Aquí presentamos un protocolo de ejemplo para un esquema de selección para la enzima MwoI (inédita). I) Secuencia seleccionada (situada en el extremo derecho del ESC) con residuos definidos mostrados en rojo y variación seleccionada de la secuencia de cognado que se muestra en azul. Entre paréntesis debajo de la secuencia seleccionada del contador que se colocará en el extremo izquierdo del ESC se muestra; II) Producto de escote MwoI; III) Después de terminar la transcripción/traducción in vitro, los productos se purifican y la ligadura se realiza con el exceso de adaptador. Solo los productos de escisión que se han esgrimido en la secuencia seleccionada pueden participar en la ligadura. Por lo tanto, se eliminan las variantes inactivas y el paso desplegable es innecesario. El producto de escisión en la secuencia de contador seleccionada (en el extremo izquierdo del ESC, no se muestra) no puede participar en esta ligadura porque el extremo saliente del adaptador no es complementario a la secuencia de contador seleccionada; IV) El PCR selectivo utiliza la misma estrategia que en el protocolo principal para eliminar variantes con la especificidad de secuencia degenerada de tipo comodín (f1 primer enlace disal al sitio seleccionado del contador) mientras que las variantes inactivas se eliminan por la imprimación inversa selectiva que no se puede enlazar al extremo derecho no modificado (y por lo tanto no modificado por la ligadura del adaptador). En el siguiente ciclo, el proceso puede iterar mediante el uso de un adaptador idéntico al producto de escisión del paso anterior (es decir, el "cassette de salvia" en el panel III) y una imprimación inversa selectiva adecuada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Primers utilizados en la ingeniería NlaIV. Se subrayan las secuencias de los sitios de restricción mencionados en los comentarios. Las letras pequeñas indican secuencias que no tienen complementos en las plantillas de ADN. Haga clic aquí para ver esta tabla (haga clic con el botón derecho para descargar).

Tabla 2: Condiciones de las reacciones PCR que se utilizarán en el protocolo. T_m - temperatura de fusión de imprimación (si T_m es diferente para las imprimaciones, se debe utilizar la T_m inferior). Haga clic aquí para ver esta tabla (haga clic con el botón derecho para descargar).

Tabla 3: Resultados de la comprobación de la calidad de dos imprimaciones mutagénicas sintetizadas con estrategia de división y mezcla. Los codones mutagenizados se indican con [XXX]. Un número de índice inferior indica la posición de un aminoácido codificado. ⁸ con permiso de Elsevier. Haga clic aquí para ver esta tabla (haga clic con el botón derecho para descargar).

Cuadro 4: Resultados del EP-PCR. Parámetros principales derivados del análisis de secuencia de 22 clones de ECS. Haga clic aquí para ver esta tabla (haga clic con el botón derecho para descargar).

Discusión

El protocolo de selección descrito aquí fue probado para NlaIV⁸, una secuencia de reconocimiento de plegado dieric-(D/E)XK que reconoce un sitio de destino palindrómico con bases NN centrales y cataliza un corte final contundente entre las bases NN. NlaIV fue recogido porque el escote entre las bases NN sugiere que estas bases están cerca de la proteína en el complejo. En principio, el protocolo podría utilizarse para cualquier restricción específica de la secuencia endonucleasa, monomérica o dimerica, de cualquier grupo de plegado, catalizando roturas de doble hebra de cualquier escalonamiento, independientemente de si los dominios catalíticos y especificidad coinciden (como en el ejemplo NlaIV) o son separados (por ejemplo, FokI). Además, el protocolo en principio es útil no sólo para la generación de nueva especificidad enzimática más estrecha, sino que también podría utilizarse para eliminar las actividades estelares, o para crear endonucleasasas de alta fidelidad. Sin embargo, todo esto aún no ha sido probado. En particular, la eliminación dirigida de la actividad estelar puede ser complicada, porque los mismos residuos de aminoácidos podrían estar involucrados en la unión a las bases deseadas y no deseadas. Los pasos in vitro descritos en este protocolo no se limitan a la selección de especificidades reducidas, sino que también podrían utilizarse para seleccionar especificidades alteradas de otro modo. Sin embargo, entonces hay un problema con las endonucleasas variantes: si el espectro de sustratos incluye nuevos objetivos no aplacados por la endonucleasa parental, en general no hay una buena manera de proteger a las células de los efectos nocivos de esta actividad. Por el contrario, si la especificidad de la endonucleasa sólo se reduce, los objetivos son un subconjunto de los objetivos de tipo silvestre, y por lo tanto la metiltransferasa cognada ya disponible debe ser totalmente protectora.

Nuestro protocolo difiere en varios aspectos de muchos protocolos de evolución dirigida. La diversidad de fotogramas de lectura abierta se genera una vez al principio del experimento, no en todas las iteraciones. Además, se crea mediante la síntesis de división y mezcla, en lugar de por EP-PCR. Para las sustituciones NNS de codones, tal como se utiliza en este trabajo, hay (4 x 4 x 2)⁶ x 1,07 x 10⁹ combinaciones para seis posiciones. Por lo tanto, cualquier variante dada está presente en promedio una vez en 1,7 fmoles de ESC. Esta capacidad se puede aumentar a siete posiciones mediante el uso de síntesis con una mezcla de 20 precursores de trinucleótidos que es ofrecido por Glen Research o disminuyendo la frecuencia de mutación en posiciones menos prometedoras con síntesis de oligonucleótidos divididos y mixtos. Si es posible, se recomienda limitar el grado de variación a seis posiciones. Obviamente, este tipo de mutagénesis dirigida requiere cierto conocimiento preexistente sobre al menos las regiones del REase involucradas en la unión de sustratos. El protocolo de división y mezcla para generar diversidad tiene claras ventajas en comparación con el EEP-PCR. Utilizando el EP-PCR, obtuvimos variantes y secuencias sin cambios que llevaban ocho sustituciones para los EsC NlaIV en el mismo EP-PCR (cuadro 4). La biblioteca de EP-PCR contiene una fracción sustancial de clones que deben evitarse (secuencias de tipo salvaje, múltiples sustituciones, mutaciones de cambio de fotogramas y sin sentido, y mutaciones en lugares poco probables que afecten a la especificidad de la secuencia).

Nuestro protocolo también difiere de muchos otros protocolos de evolución dirigidos por la presencia de dos pasos de selección secuenciales. La selección positiva se asegura de que se conserva la actividad deseada, de lo contrario la etiqueta biotina no se elimina y la secuencia de codificación se puede eliminar mediante la extracción. Es técnicamente posible que la aparición fortuita de una especificidad no superesofosa no esnueva (por ejemplo, GCATGC) podría conducir a la separación de la etiqueta de biotina también, si un sitio de escote adecuado está presente cerca del escote deseado, pero no en otro lugar. Sin embargo, esto debería ser muy improbable. La selección negativa elimina los fotogramas de lectura abiertos que codifican para las enzimas que todavía tienen la actividad no deseada. Este paso no es estrictamente obligatorio, porque el protocolo todavía enriquecerá la biblioteca de salida con variantes que son capaces de cortar la secuencia de selección pero no pueden cortar en otro lugar del ESC, por lo tanto, lo que la hace inadecuada para la amplificación de PCR. Sin embargo, se espera que la eficacia de la selección sea menor porque las enzimas con la especificidad de la secuencia original no se eliminarán de la salida y superarán a las variantes prometedoras con especificidad alterada, sino también a una menor actividad enzimática. Tenga en cuenta que en el nivel de población, las secuencias de destino deseadas y no deseadas pueden, pero no es necesario, degenerar. En el ejemplo de NlaIV, el antiobjetivo era degenerado y el destino no degenerado. Incluso cuando hay degeneración a nivel de población, en una sola gota sólo está presente un objetivo (no degenerado) o un objetivo antiobjetivo. En nuestro protocolo, las secuencias de objetivo y antiobjetivo se reintroducen en cada repetición de los pasos de selección. Por lo tanto, un marco de lectura abierto debe codificar una enzima capaz de cortar todos los objetivos posibles, e incapaz de cortar ninguno de los objetivos antiobjetivos, para sobrevivir a múltiples rondas de selección. Observe que la necesidad de reintroducir el destino de antiselección en cada iteración del protocolo aplica dos PCR secuenciales. El primer PCR utiliza una imprimación que se recocido fuera del anti-objetivo, de modo que el escote del anti-objetivo previene la reacción PCR. El segundo PCR requiere una imprimación que va más allá del antiobjetivo, y reintroduce anti-target, para asegurarse de que durante múltiples rondas de selección, cada marco de lectura abierto se prueba contra todas las variantes del anti-objetivo.

Para las enzimas que generan extremos pegajosos, se puede utilizar un protocolo alternativo relacionado basado en un método descrito previamente para el aislamiento de REase ORF^10. El agotamiento de las variantes inactivas por captura de biotina que se utiliza en nuestros experimentos se sustituye en el protocolo alternativo por la ligadura del adaptador compatible con una secuencia que se utiliza como sitio de enlace de imprimación en un PCR selectivo(Figura 9). Solo los ESC que producen enzimas con la especificidad seleccionada generan extremos capaces de ligar y, por lo tanto, se seleccionarán. La secuencia del extremo pegajoso de la secuencia eseleccionada del contador debe diseñarse de tal manera que no pueda participar en la ligadura con adaptadores. La iteración del proceso de selección se puede lograr fácilmente cambiando entre dos adaptadores diferentes y, en consecuencia, dos imprimaciones inversas diferentes en PCR selectivo.

Incluso con nuevos protocolos, la tarea de ingeniería de nuevas especificidades in vitro sigue siendo muy difícil. Para los REases típicos de tipo II, la especificidad de la secuencia y la actividad endonucleólítica dependen de las mismas regiones proteicas. Por lo tanto, es difícil modificar uno sin afectar al otro. El éxito se hace más probable por una estrategia que tiene en cuenta la huella de la enzima, respeta la simetría de las interacciones proteína-ADN, y se basa en las preferencias enzimáticas preexistentes, que deben determinarse por adelantado en experimentos bioquímicos, como se hizo para el ejemplo⁸de NlaIV.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1000 y Aring; Soporte de CPG (dA, dT, dC, dG)	Biosset	45-1000-050	También se pueden utilizar otros proveedores
ASM-800 DNA/RNA	Biosset	800-001-000
GeneJET Gel Kit de extracción Thermo	Scientific	K0691	Cualquier otro kit puede ser utilizado
Glen-Pak Cartucho de purificación de ADN	Glen Research	60-5200
HIS-Select Nickel Affinity Gel	Sigma	P6611
		pET 28a	En su lugar, se puede utilizar cualquier otro vector con promotor T7 aguas arriba del sitio de clonación
de plyclon Phusion ADN polimerasa de alta fidelidad	Thermo Scientific	F530S	En su lugar, se puede utilizar cualquier otra polimeasa termófila de alta fidelidad y alta procesión
Lámina de acero porosa	Biosset	40-063
Sistema de traducción rápida RTS 100, E.coli HY Kit	Roche	3 186 148
Endonucleasas de restricción	Thermo Scientific		Obviamente otros proveedores, se pueden usar enzimas
Estreptavidina Perlas	magnéticas New England Biolabs	S1420S	También se pueden usar otros proveedores. Hemos probado positivamente lechos de productos químicos de síntesis Sigma
incluidas las fosforamidas	Carl Roth		También se pueden utilizar otros proveedores
Columnas de síntesis (diferentes tamaños)	Biosset
T4 DNA ligasa	Thermo Scientific	EL0011	Se puede utilizar cualquier otra ligasa