El objetivo de este método es determinar la densidad CR1 en los eritrocitos de cualquier sujeto comparando con tres sujetos cuya densidad de eritrocitos CR1 se conoce. El método utiliza citometría de flujo después de la inmunomancha de los eritrocitos de los sujetos por un anticuerpo monoclonal anti-CR1 acoplado a un sistema amplificado utilizando fileeritrina (PE).
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Artículo de método
Medición del receptor de complemento de eritrocitos 1 mediante citometría de flujo
En este artículo
Resumen
Resumen
CR1 (CD35, Receptor De complemento tipo 1 para C3b/C4b) es una glicoproteína de membrana de alto peso molecular de unos 200 kDa que controla la activación de complemento, transporta complejos inmunológicos y participa en respuestas inmunitarias humorales y celulares. CR1 está presente en la superficie de muchos tipos de células, incluyendo eritrocitos, y exhibe polimorfismos en longitud, estructura (Knops, o KN, grupo sanguíneo), y densidad. La densidad media de CR1 por eritrocitos (CR1/E) es de 500 moléculas por eritrocitos. Esta densidad varía de un individuo a otro (100–1,200 CR1/E) y de un eritrocitos a otro en el mismo individuo. Presentamos aquí un método de citometría de flujo robusto para medir la densidad de CR1/E, incluso en sujetos que expresan una baja densidad, con la ayuda de un sistema de inmunomancha amplificante. Este método nos ha permitido mostrar la disminución de la expresión de eritrocitos CR1 en enfermedades como la enfermedad de Alzheimer (AD), el lupus eritematoso sistémico (LES), el SIDA o la malaria.
Introducción
CR1 (receptor de complemento tipo 1, CD35) es una glicoproteína transmembrana de 200 kDa presente en la superficie de muchos tipos de células, tales como eritrocitos1, linfocitos B2, células monocíticas, algunas células T, células dendríticas foliculares3, astrocitos fetales4,y podocitos glomerulares5. CR1 interfiriendo con sus ligandos C3b, C4b, C3bi6,7,8,9, una subunidad del primer componente de complemento, C1q
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Protocolo
El protocolo para la recolección y el manejo de la sangre humana fue revisado y aprobado por el comité de ética regional (CPP Est II), y el número de protocolo es 2011-A00594-37. Debido a que el siguiente protocolo describe el manejo de la sangre humana, se deben seguir las pautas institucionales para la eliminación de material biopeligroso. Se debe usar equipo de seguridad de laboratorio, como batas de laboratorio y guantes.
1. Lavado de eritrocitos
NOTA: El día antes de manipularlo, prepare un tampón PBS-BSA con solución salina tamponada de fosfato (PBS) que contenga el 0,15% de la albúmina sérica bovina (BSA) y ....
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Resultados
Los eritrocitos de tres sujetos cuya densidad de CR1 se conoce ("sujeto bajo" [180 CR1/E], sujeto "medio" [646 CR1/E] y sujeto "alto" [966 CR1/E]), y de dos sujetos cuya densidad CR1 debía determinarse fueron inmunomanchados por un anticuerpo anti-CR1 acoplado a un sistema de amplificación utilizando la fluoracrotrina fierrín. Al principio, la densidad CR1 de los sujetos del rango bajo-alto fue determinada por el método Scatchard29 utilizando anticuerpos radiomarcados. Los estándares (bajos, medio.......
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Discusión
Hay varias técnicas disponibles para determinar la densidad del eritrocito CR1 (CR1/E). Las primeras técnicas utilizadas fueron la aglutinación de glóbulos rojos por anticuerpos anti-CR131 y la formación de rosetas en presencia de eritrocitos recubiertos con C3b32. Estas técnicas rudimentarias fueron rápidamente reemplazadas por métodos de inmunomancha utilizando anticuerpos radiomarcados anti-CR11,33. También es po.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a todos los miembros de la URCACyt, plataforma técnica de citometría de flujo, el personal del Departamento de Inmunología, y el personal del Departamento de Medicina Interna y Geriatría, que contribuyeron a optimizar y validar el protocolo. Este trabajo fue financiado por los hospitales universitarios de Reims (número de subvención AOL11UF9156).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1000E Punta de barrera | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, Francia | 2079E | pipeteo de muestras |
| 1-100 µ L Biselado, punta de filtro | Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Alemania | Pipeteo de muestras | S1120-1840 |
| Anticuerpo monoclonal anti-CR1 biotinilado (J3D3) | Producción casera de anticuerpo monoclonal no comercial, cortesía del Dr. J. Cook | inmunotinción | |
| Protección de la blusa | |||
| Albúmina sérica Bovin (7,5%) | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, Francia | 15260037 | citometría |
| centrífuga | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, Francia | 11176917 | centrifugación |
| Clean Solution | BD, F-38801 Le Pont de Claix, Francia | 340345 | citometría |
| Comorack-96 | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 944060P | rack |
| Configuración del citómetro & Kit de perlas de seguimiento | BD, F-38801 Le Pont de Claix, Francia | 655051 | citometría |
| Solución de formaldehído 36.5 % | Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, Francia | F8775-25ML | Fijación |
| 10 µ L Graduado, punta de filtro | Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Alemania | S1121-3810 | pipeteo de muestras |
| LSRFORTESSA citómetro de flujo | BD, F-38801 Le Pont de Claix, Francia | 647788 | citometría |
| Microman pistones capilares | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 067494 | pipeteo de muestras |
| Micronic 1,40 mL tubos de fondo redondo | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | Micropipeta | de mezcla |
| Microman - tipo M25 - | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 066379 | pipeteo de muestras |
| solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, Francia | Citometría | 10010031 |
| Pipeta PS 325 mm, 10 mL | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 391952 | pipeteo de muestras |
| sin polvo Examen de nitrilo guantes | Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, EE. UU. | 486802 | protección de muestras |
| Reference 2 pipeta, 0,5-10 µ L | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, Francia | 4920000024 | pipeteo de muestras |
| Reference 2 pipeta, 20-100 y micro; L | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, Francia | 4920000059 | pipeteo de muestras |
| Reference 2 pipeta, 100-1000 µ L | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, Francia | 4920000083 | pipeteo de muestras |
| Solución de enjuague | BD, F-38801 Le Pont de Claix, Francia | 340346 | citometría |
| Tubo de fondo redondo | Sarstedt, F-70150 Marnay, Francia | 55.1579 | citometría |
| Tubos Safe-Lock, 1,5 mL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, Francia | 0030120086 | mix |
| estreptavidina R-PE | Tebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, Francia | AS-60669 | inmunotinción |
| Tubos de centrífuga cónicos 50 mL | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, Francia | 10203001 | mix |
| Vector anti estreptavidina biotina | Eurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, Francia | BA-0500 | inmunotinción |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, EE. UU. | Mezcla SI-0236 |
Referencias
- Fearon, D. T. Identification of the membrane glycoprotein that is the C3b receptor of the human erythrocyte, polymorphonuclear leukocyte, B lymphocyte, and monocyte. Journal of Experimental Medicine. 152 (1), 20-30 (1980).
- Ross, G. D., Winchester, R. J., Rabellino, E. M., Hoffman, T.
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Reimpresiones y permisos
