Derribo estable de genes que codifican proteínas de matriz extracelular en la línea celular de mioblaste C2C12 utilizando small-Hairpin (sh)RNA

Nandaraj Taye; Sarah Stanley; Dirk Hubmacher

doi:10.3791/60824

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Artículo de método

Derribo estable de genes que codifican proteínas de matriz extracelular en la línea celular de mioblaste C2C12 utilizando small-Hairpin (sh)RNA

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DOI:

10.3791/60824

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12 de febrero de 2020

Nandaraj Taye¹ , Sarah Stanley¹ , Dirk Hubmacher¹

¹Orthopaedic Research Laboratories, Leni & Peter W. May Department of Orthopaedics, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

En este artículo

Resumen

Proporcionamos un protocolo para derribar genes que codifican las proteínas de matriz extracelular (ECM) en los mioblastos C2C12 utilizando ARN de horquilla pequeña (sh). Apuntando a ADAMTSL2 como ejemplo, describimos los métodos para la validación de la eficiencia de derribo en el ARNm, la proteína y el nivel celular durante la diferenciación de mioblasto c2C12 a miotubo.

Resumen

Las proteínas de matriz extracelular (ECM) son cruciales para el desarrollo del músculo esquelético y la homeostasis. El derribo estable de genes que codifican proteínas ECM en mioblastos C2C12 se puede aplicar para estudiar el papel de estas proteínas en el desarrollo del músculo esquelético. Aquí, describimos un protocolo para agotar la proteína ECM ADAMTSL2 como ejemplo, utilizando ARN de horquilla pequeña (sh) en células C2C12. Tras la transfección de plásmidos de ARNS, las células estables se seleccionaron por lotes mediante puromicina. Además, describimos el mantenimiento de estas líneas celulares y el análisis fenotípico a través de la expresión de ARNm, la expresión de proteínas y la diferenciación C2C12. Las ventajas del método son la generación relativamente rápida de células de derribo C2C12 estables y la diferenciación confiable de células C2C12 en miotubos multinucleados tras el agotamiento del suero en el medio de cultivo celular. La diferenciación de las células C2C12 puede controlarse mediante microscopía de campo brillante y midiendo los niveles de expresión de los genes marcadores canónicos, como MyoD, miogenina o cadena pesada de miosina (MyHC), lo que indica la progresión de la diferenciación de mioblastos C2C12 en miotubos. En contraste con el derribo transitorio de genes con ARN de interferencia pequeña (si), los genes que se expresan más tarde durante la diferenciación C2C12 o durante la maduración del miotubo pueden ser dirigidos de manera más eficiente mediante la generación de células C2C12 que expresan establemente el ARNS. Las limitaciones del método son una variabilidad en las eficiencias de derribo, dependiendo del ARNS específico que se puede superar mediante el uso de estrategias de eliminación genética basadas en CRISPR/Cas9, así como los posibles efectos fuera del objetivo del ARNS que deben ser considerados.

Introducción

Las proteínas de matriz extracelular (ECM) proporcionan soporte estructural para todos los tejidos, median la comunicación celular y determinan el destino celular. La formación y remodelación dinámica de ECM es por lo tanto crítica para mantener la homeostasis tisular y órgano¹^,². Variantes patológicas en varios genes que codifican proteínas ECM dan lugar a trastornos musculoesqueléticos con fenotipos que van desde distrofias musculares hasta pseudomouscular build³^,⁴. Por ejemplo, las variantes patógenas en ADAMTSL2 causan la displasia geleóís....