Aquí se establece y se describe un protocolo de minería del genoma guiado por espectrometría de masas. Se basa en la información de la secuencia del genoma y el análisis LC-MS/MS y tiene como objetivo facilitar la identificación de moléculas a partir de extractos microbianos y vegetales complejos.
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Artículo de método
La minería del genoma guiada por espectrometría de masas como herramienta para descubrir nuevos productos naturales
En este artículo
Resumen
Resumen
El espacio químico cubierto por productos naturales es inmenso y ampliamente no reconocido. Por lo tanto, se desean metodologías convenientes para realizar una evaluación amplia de sus funciones en la naturaleza y beneficios humanos potenciales (por ejemplo, para aplicaciones de descubrimiento de fármacos). Este protocolo describe la combinación de la minería del genoma (GM) y la red molecular (MN), dos enfoques contemporáneos que coinciden con las anotaciones codificadas por grupos genéticos en la secuenciación del genoma completo con las firmas de la estructura química de extractos metabólicos crudos. Este es el primer paso hacia el descubrimiento de nuevas entidades naturales. Estos conceptos, cuando se aplican juntos, se definen aquí como minería del genoma guiada por MS. En este método, los componentes principales se designan previamente (utilizando MN), y los nuevos candidatos relacionados estructuralmente se asocian con anotaciones de secuencia del genoma (mediante GM). La combinación de GM y MN es una estrategia rentable para apuntar a nuevas redes troncales de moléculas o cosechar perfiles metabólicos con el fin de identificar análogos de compuestos ya conocidos.
Introducción
Las investigaciones del metabolismo secundario a menudo consisten en el cribado de extractos crudos para actividades biológicas específicas seguidos de purificación, identificación y caracterización de los componentes pertenecientes a fracciones activas. Este proceso ha demostrado ser eficiente, promoviendo el aislamiento de varias entidades químicas. Sin embargo, hoy en día esto es visto como inviable, principalmente debido a las altas tasas de redescubrimiento. A medida que la industria farmacéutica revolucionó sin conocer las funciones y funciones de los metabolitos especializados, su identificación se llevó a cabo en condiciones de laboratorio que no representaban....
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Protocolo
1. Minería del genoma para grupos genéticos biosintéticos
- Realizar la secuenciación del genoma completo (WGS) como el primer paso para elegir un cúmulo de genes biosintéticos (BCG) para la minería del genoma guiado por EM. Todo el borrador del genoma de la cepa de interés (bacterias) se puede obtener mediante la tecnología Illumina MiSeq utilizando lo siguiente con ADN genómico de alta calidad: escopeta TruSeq PCR-Free library prep y Nextera Mate Pair Library Preparation Kit33.
NOTA: Después de la secuenciación, la biblioteca de escopetas Illumina y la biblioteca de pares de relaciones de posición De Illumina se pueden montar con e....
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Resultados
El protocolo se ejemplificó con éxito utilizando una combinación de minería del genoma, expresión hetróloga y enfoques guiados por MS/código para acceder a nuevas moléculas análogas especializadas en valinomicina. El flujo de trabajo genoma-molécula para el objetivo, valinomicina (VLM), se representa en la Figura 8. El genoma del borrador CBMAI 2042 se analizó en silico, y el grupo genético VLM fue identificado y transferido a un huésped hetrólogo. Las cepas de tipo heterologous y s.......
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Discusión
La mayor ventaja de este protocolo es su capacidad para desreplicar rápidamente los perfiles metabólicos y salvar la información genómica con datos de MS con el fin de dilucidar las estructuras de las nuevas moléculas, especialmente los análogos estructurales2. Sobre la base de información genómica, se pueden investigar diferentes productos naturales quimiotipos, tales como poliketidas (PK), péptidos nonribosomales (NRP) y productos naturales glucosilados (GNP), así como BGCcrígos crípticos. Por l.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
El apoyo financiero para este estudio fue proporcionado por la Fundación de Investigación de Sao Paulo - FAPESP (2019/10564-5, 2014/12727-5 y 2014/50249-8 a L.G.O; 2013/12598-8 y 2015/01013-4 a R.S.; y 2019/08853-9 a C.F.F.A). B.S.P, C.F.F.A. y L.G.O. recibieron becas del Consejo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico - CNPq (205729/2018-5, 162191/2015-4 y 313492/2017-4). L.G.O. también agradece el apoyo de la subvención proporcionado por el programa Para mujeres en la ciencia (2008, Edición Brasileña). Todos los autores reconocen capeS (Coordinación para la mejora del personal de educación superior) por apoyar los programas de post-graduación en Brasil.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Acetonitrilo | Tedia | AA1120-048 | |
| Agar | Oxoide | LP0011 | NA |
| Apramicina | Sigma Aldrich | A2024 | NA |
| Carbenicillina | Sigma Aldrich | C9231 | NA |
| Centrífuga | Eppendorf | NA | 5804 |
| Cloranfenicol | Sigma Aldrich | C3175 | NA |
| Columna C18 | Agilent Technologies | NA | ZORBAX RRHD Extend-C18, 80Å, 2,1 x 50 mm, 1,8 µ m, límite de presión de 1200 bar N/P 757700-902 |
| Kanamicina | Sigma Aldrich | K1377 | NA |
| Manitol P.A.- A.C.S. | Synth | NA | NA |
| Microcentrífuga | Eppendorf | NA | 5418 |
| Ácido nalidíxico | Sigma Aldrich | N4382 | NA |
| Phusion Flash PCR de alta fidelidad Master Mix | ThermoFisher Scientific | F548S | NA |
| Q-TOF espectrómetro de masas | Agilent technologies | NA | 6550 iFunnel Q-TOF LC/MS |
| Sacarose P.A.- A.C.S. | Synth | NA | NA |
| Shaker/Incubadora | Marconi | MA420 | NA |
| Cloruro de Sodio | Synth NA | P. A. - ACS | |
| Extracto de soja | NA | NA | NA |
| Sintetizador de sacarosa | NA | P. A. - ACS | |
| Ciclos Térmicos | Eppendorf | NA | Mastercycler Nexus Gradient |
| Thiostrepton | Sigma Aldrich | T8902 | NA |
| Triptona | Oxoid | LP0042 | NA |
| Triptona Caldo de Soja | Oxoid CM0129 | ||
| NA UPLC Agilent | Technologies | NA | 1290 Infinity LC System |
| Extracto de levadura | Oxoid | LP0021 | NA |
Referencias
- Davies, J. Specialized microbial metabolites: functions and origins. The Journal of Antibiotics. 66 (7), Tokyo. 361-364 (2013).
- Ziemert, N., Alanjary, M., Weber, T. The evolution of genome mining in microbes - a review. Natural Product Reports. 33 (8)....
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Reimpresiones y permisos
