Method Article

Diferenciación eficiente de las neuronas simpáticas postgangliónicas utilizando células madre pluripotentes humanas bajo condiciones de cultivo sin alimentador y definidas químicamente

DOI:

10.3791/60843

⸱

May 24th, 2020

 , 
1Center for Molecular Medicine, University of Georgia, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Franklin College of Arts and Sciences, University of Georgia, 3Department of Cellular Biology, Franklin College of Arts and Sciences, University of Georgia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En este protocolo, describimos una estrategia de diferenciación estable y altamente eficiente para la generación de neuronas simpáticas postgangliónicas a partir de células madre pluripotentes humanas. Este modelo hará que las neuronas estén disponibles para el uso de estudios de múltiples trastornos autonómicos.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las células madre pluripotentes humanas (hPSC) se han convertido en una poderosa herramienta para el modelado de enfermedades y el estudio del desarrollo embrionario humano in vitro. Anteriormente presentamos un protocolo de diferenciación para la derivación de neuronas autonómicas con carácter simpático que se ha aplicado a pacientes con neuropatía autonómica. Sin embargo, el protocolo se construyó sobre el reemplazo de suero Knock Out (KSR) y las condiciones de cultivo basadas en el alimentador, y para garantizar una alta eficiencia de diferenciación, la clasificación celular era necesaria. Estos factores causan alta variabilidad, alto costo y baja reproducibilidad. Además, no se han verificado las propiedades simpáticas maduras, incluida la actividad eléctrica. Aquí, presentamos un protocolo optimizado donde el cultivo y la diferenciación de PSC se realizan en condiciones de cultivo libres de alimentación y definidas químicamente. Se identifican marcadores genéticos que identifican la cresta neural del tronco. Una mayor diferenciación en las neuronas simpáticas postgangliónicas se logra después de 20 días sin la necesidad de clasificación celular. El registro electrofisiológico muestra aún más la identidad funcional de la neurona. El disparo detectado por nuestras neuronas diferenciadas puede ser mejorado por la nicotina y suprimido por el antagonista del receptor adrenérgico propranolol. Los progenitores neuronales simpáticos intermedios en este protocolo se pueden mantener como esferoides neuronales durante un máximo de 2 semanas, lo que permite la expansión de los cultivos. En resumen, nuestro protocolo actualizado de diferenciación de neuronas simpáticas muestra una alta eficiencia de diferenciación, mejor reproducibilidad, más flexibilidad y mejor maduración neuronal en comparación con la versión anterior. Este protocolo proporcionará a los investigadores las células necesarias para estudiar los trastornos humanos que afectan al sistema nervioso autónomo.

Introduction

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Las neuronas simpáticas postgangliónicas (simron) pertenecen al sistema nervioso autónomo (ANS) y tienen múltiples papeles importantes en la respuesta y regulación de la homeostasis del cuerpo independiente de la conciencia. Por ejemplo, el estrés estimula las sin, y evoca la respuesta de lucha o vuelo que conduce a un aumento de la frecuencia cardíaca, la presión arterial y la sudoración. Los SymN se ven afectados en múltiples trastornos humanos debido a la genética, toxicidad/lesión, o como compañeros de otras enfermedades. Un ejemplo de neuropatía genética es el trastorno infantil Disautonomia Familiar (FD), donde una severa desregulación de las simadoras causa cri....

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTA: La línea de reporteroh9 PHOX2B:GFP fue proporcionada por Oh et al.19. Algunas imprimaciones qPCR utilizadas en este artículo se obtuvieron de OriGene Technologies, mientras que algunas secuencias se obtienen de Frith et al.20,30.

1. Configuración para recubrimiento de platos, preparación de medios y mantenimiento de hPSC

  1. Recubrimiento de platos
    1. Recubrimiento vitronectina (VTN)
      1. Colocar los viales de VTN en un baño de agua a 37 oC hasta que esté completamente descongelado y, a continuación, mezcle bien.
        2. ....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En este protocolo, damos instrucciones sobre cómo generar symNs a partir de hPSCs. Las condiciones de cultivo que se han demostrado aquí se mejoraron de un protocolo publicado anteriormente23,24 (Figura 1A) a condiciones libres de alimentación y definidas químicamente(Figura 1B). Se proporcionan dos opciones, una en la que se realizan symN en un plazo de 20 días y otra en la que los CNC se pueden ampliar.......

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Recientemente publicamos dos reseñas, una discutiendo el uso de sínmNs derivados de hPSC para el modelado de enfermedades31, así como una comparación en profundidad de los protocolos de diferenciación disponibles22. Por lo tanto, aquí nos centramos en la solución de problemas del protocolo actual para ayudar al investigador interesado a tener éxito en la fabricación de symNs. Durante todo el proceso de diferenciación, con el fin de obtener datos consistentes, así como célul.......

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Disclosures

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Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nos gustaría dar las gracias a Heidi Ulrichs por la lectura crítica y la edición del manuscrito.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Placas de cultivo celular de 100 mmFalcon353003
tubos de cultivo de tejidos cónicos de 15 mlVWR/Corning89039-664
Placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos Falcon353047
Placas de fijación ultrabaja de 24 pocillosCorning07 200 601 y 07 200 602
5% CO2/20% O2 incubadora de cultivo de tejidosThermo Fisher/Life TecnologíasHeracell VIOS 160i
Tubos de cultivo de tejidos cónicos de 50 mlVWR/Corning89039-656
Placas de cultivo de tejidos de 6 pocillosCostar3516
AccutaseInnovación Cell TechnologiesAT104500Solución de disociación celular
Anticuerpo anti-AP2a AnticuerpoAbcamab108311Huésped: Conejo; dilución
1:400Anticuerpo anti-Ascl1BD Pharmingen556604Huésped: IgG1 de ratón; Dilución 1:200
Anticuerpo anti-CD49DBioLegend304313Huésped: IgG1 de ratón; 5 μ l/millón de células en 100 μ l volumen
Anticuerpo anti-CD49D (isotipo)BioLegend400125Huésped: IgG1 de ratón; 5 μ l/millón de células en 100 μ l volumen
Colorante DAPISigmaD9542Dilución 1:1000
Anticuerpo anti-DBHImmunostar22806Huésped: Conejo; Dilución 1:500
Anticuerpo anti-GFPAbcamab13970Huésped: Pollo; Dilución 1:1000
Anticuerpo anti-HOXC9Abcamab50839Huésped: Ratón; dilución 1:100
Anticuerpo Anti-NET1MabNET17-1Huésped: Ratón; dilución 1:1000
Anticuerpo anti-PRPHSanta Cruz BiotechnologySC-377093/H0112Huésped: Ratón IgG2a; dilución 1:200
Anticuerpo anti-SOX10Santa Cruz Biotechnologysc-365692Huésped: Ratón IgG1; dilución 1:100
Anticuerpo anti-THPel-FreezP40101- 150Huésped: Conejo; dilución 1:500
Ácido ascórbicoSigmaA8960-5GConcentración de existencias: 100 mM
B27 suplementoThermo Fisher/Life Technologies12587-010 Concentración deexistencias: 50x
BDNFR& D Systems248-BDConcentración de existencias: 10 μ g/mL
BMP4R& D Systems314-BPConcentración de existencias: 6 mM
Contador de celdasThermo Fisher/Life TechnologiesCountess II
Portaobjetos de la cámara de recuento de celdasInvitrogenC10312
CentrífugaEppendorf57021& 5424R
CHIR99021R& D Systems4423Concentración de existencias: 6 mM
Cryo-vialThermo Fisher/Life Technologies375353
dbcAMPSigmaD0627Concentración de existencias: 100 mM
DMEMThermo Fisher/Life Technologies10829-018 Concentración deexistencias: 1x
DMEM/F12Thermo Fisher/Life Technologies11330-057 Concentración deexistencias: 1x
DMSOThermo Fisher/Life TechnologiesBP231-100
E6gibcoA15165-01
E8gibcoA15169-01Concentración de stock: 1x
E8 suplementogibcoA15171-01Concentración de stock: 50x
EDTASigmaED2SSConcentración de stock: 0,5 M
Placas de electrofisiología (AXION cytoview MEA96)Axion BioSystemsM768-tMEA-96W
BeckmanCoulterCytoFLEX (para FACS)
Máquina FACSBeckman CoulterMoFlo Astrios EQ (para clasificación)
Tubos FACS (tapón de filtro azul)Tubos Falcon352235
FACS (tapón blanco)Falcon352063
Suero fetal bovino (FBS)Atlanta BiologicalsS11150
GDNFPeproTech450Concentración de stock: 10 μ g/mL
GeltrexInvitrogenA1413202Matriz de membrana basal; Concentración de existencias: 100x
hPSCsThomson et al., (1998)WA09
hPSCsOh et al. (2016)H9-PHOX2B::eGFP
Fibronectina humana (FN)VWR/Corning47743-654 Concentración deexistencias: 1 mg/mL
L-glutaminaThermo Fisher/Gibco25030-081 Concentración deexistencias: 200 mM
Tanque de LNSistemas Biogénicos PersonalizadosV-1500AB
Lector MEAAxion BioSystemsMaestro Pro
Mouse laminin I (LM)R& D Systems3400-010-01 Concentración deexistencias: 1 mg/mL
suplemento de N2Thermo Fisher/Life Technologies17502-048 Concentración deexistencias: 100x
Medio neurobasalgibco21103-049 Concentración deexistencias: 1x
NGFPeproTech450-01 Concentración deexistencias: 25 μ g/mL
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)Gibco14190-136Concentración de existencias: 1x
Hidrobromuro de poli-L-ornitina (PO)SigmaP3655Concentración de existencias: 15 mg/mL
Primocina (antibióticos)InvivoGenANTPM1Concentración de existencias: 50 mg/mL
Máquina de qPCRBio-Rad LaboratoriesC1000 Touch
Placas de qPCRBio-Rad LaboratoriesHSP9601
FGF2 recombinanteR& D Systems233-FB/CF Concentración deexistencias: 10 μ g/mL
Ácido retinoicoSigmaR2625Concentración de stock: 1 mM
SB431542Tocris/R& D Systems1614Concentración de existencias: 10 mM
Azul de tripánCorningMT-25-900-CI
Vitronectina (VTN)Thermo Fisher/Life TechnologiesA14700Concentración de existencias: 0,5 mg/mL
Baño de aguaVWR/Corning706308
Y27632 R& D Systems1254Concentración de existencias: 10 mM
medio medio Máquina FACS

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Norcliffe-Kaufmann, L., Slaugenhaupt, S. A., Kaufmann, H. Familial dysautonomia: History, genotype, phenotype and translational research. Progress in Neurobiology. 152, 131-148 (2017).
  2. Stone, J. B., DeAngelis, L. M. Cancer-treatment-ind....

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