Monitorización del conjunto eIF4F midiendo la interacción eIF4E-eIF4G en células vivas

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para medir la interacción eIF4E-eIF4G en células vivas que permitiría al usuario evaluar la perturbación inducida por fármacos de dinámicas complejas eIF4F en formatos de cribado.

Abstract

Se ha demostrado que la formación del complejo eIF4F es el nodo descendente clave para la convergencia de vías de señalización que a menudo se someten a activación oncogénica en humanos. eIF4F es un complejo de unión a la tapa que participa en la fase de reclutamiento del ARNm-ribosoma de iniciación de traducción. En muchos modelos celulares y preclínicos de cáncer, la desregulación del eIF4F conduce a una mayor traducción de subconjuntos específicos de ARNm que están involucrados en la proliferación y supervivencia del cáncer. eIF4F es un complejo hetero-trimérico construido a partir de la subunidad de unión a la tapa eIF4E, el eIF4A helicaso y el subunit de andamios eIF4G. Fundamental para el montaje de complejos activos eIF4F es la interacción proteína-proteína entre las proteínas eIF4E y eIF4G. En este artículo, describimos un protocolo para medir el ensamblado eIF4F que supervisa el estado de la interacción eIF4E-eIF4G en celdas vivas. El ensayo de interacción proteína-proteína basado en células eIF4e:4G también permite evaluar con precisión y fiabilidad los cambios inducidos por fármacos en la integridad compleja del fei4F. Vislumbramos que este método puede aplicarse para verificar la actividad de compuestos disponibles comercialmente o para un mayor cribado de nuevos compuestos o modalidades que interrumpan eficientemente la formación del complejo eIF4F.

Introduction

El control de la expresión génica desempeña un papel fundamental en la correcta ejecución de programas celulares como la proliferación del crecimiento y la diferenciación. Se puede ejercer un mecanismo de control reglamentario ya sea a nivel de transcripción genética o a nivel de traducción de ARNm. En la última década, se ha hecho cada vez más evidente que el control traslacional mediante la modulación del proceso de iniciación en lugar de los pasos posteriores de alargamiento y terminación puede regular finamente la síntesis de subconjuntos específicos de proteínas que desempeñan una amplia gama de funciones biológicas.

El aumento de la t....

Protocol

La línea celular HEK293 se utilizó para el protocolo y fue cultivada en el Medio águila modificada de Dulbecco complementado con 10% suero bovino fetal, 2 mM L-glutamina, y 100 penicilina U/mL/ estreptomicina. Las células se cultivaban a 37 °C con un 5% de CO₂ en un ambiente humidificado.

1. Evaluación cuantitativa de la interrupción compleja del fei4F a través de eIF4E:eIF4G^604-646 ensayo de complementación

1. Cultivo celular y transfección transitoria de eIF4E:eIF4G^604-646 ensayo de complementación
   1. Utilice células recién descongeladas con menos de 20 pasajes para todos los experimentos. El d....

Results

Con el fin de validar la sensibilidad del sistema de complementación eIF4E:eIF4G^604-646, se evaluó la inhibición mediada de 4EBP1 del conjunto complejo eIF4F mediante inhibidores de mTOR. Al inhibir la fosforilación dependiente de la quinasa mTORC1 de la familia de proteínas 4EBP, la inhibición del mTOR mejora la asociación 4EBP1 a eIF4E y, por lo tanto, el desmontaje eIF4F^15. Se probaron dos clases de inhibidor mecanicísticamente diferente de las quinas.......

Discussion

El método descrito en este artículo utiliza un ensayo de complementación basado en luciferasa para monitorear cuantitativamente el montaje complejo eIF4F a través de la medición directa de la interacción eIF4G-eIF4E en células vivas. Hemos proporcionado detalles para el uso del sistema de complementación eIF4E-eIF4G y también hemos demostrado que el sistema es extremadamente preciso en la medición de la disociación mediada por 4EBP1 inducida por fármacos de la interacción eIF4E-eIF4G¹⁶. Con el fin.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
293FT celdas	Thermo Fisher Scientific	R70007
Microplaca de cultivo celular de 96 pocillos, F-Bottom	Greiner bio-one	655083
Título de células Glo 2.0	PROMEGA	G9241
Envision Lector multietiqueta	PerkinElmer	no aplicable
Finnpipette F2 Pipetas multicanal 12 canales 30-300 ml	Thermo Fisher Scientific	4662070
Finnpipette F2 Pipetas multicanal 12 canales 5-50 ml	Thermo Fisher Scientific	4662050
FUGENE6	PROMEGA	E2692
Lipofectamine 3000	Thermo Fisher Scientific	L3000015
NanoBiT PPI Starter Systems	PROMEGA	N2014
Optimem I Suero Reducido Mediun, sin rojo fenol	Thermo Fisher Scientific	11058021
Agitador orbital	Eppendorf	no aplicable
γ-Aminofenil-m7GTP (C10-espaciador)-Agarosa	Jena Bioscience	AC-155S