Estimulación de nichos de células madre y regeneración de tejidos en piel de ratón mediante fotogeneración in situ dependiente de protoporfirina IX conmutable de especies reactivas de oxígeno

Resumen

El objetivo de este protocolo es inducir la producción transitoria in vivo de niveles no letales de especies reactivas de oxígeno (ROS) en la piel del ratón, promoviendo aún más las respuestas fisiológicas en el tejido.

Resumen

Aquí, describimos un protocolo para inducir la fotogeneración conmutable in vivo de especies endógenas reactivas de oxígeno (ROS) en la piel del ratón. Esta producción transitoria de ROS in situ activa eficientemente la proliferación celular en nichos de células madre y estimula la regeneración de tejidos, como se manifiesta fuertemente a través de la aceleración de los procesos de curación de quemaduras y crecimiento del folículo piloso. El protocolo se basa en un tratamiento fotodinámico regulable que trata el tejido con precursores del fotosensibilizador endógeno protoporfirina IX y posteriormente irradia el tejido con luz roja bajo parámetros fisicoquímicos estrictamente controlados. En general, este protocolo constituye una herramienta experimental interesante para analizar la biología de las ROS.

Introducción

Las especies reactivas de oxígeno (ROS) son el resultado de la reducción química del oxígeno molecular para formar agua, e incluyen oxígeno singlete, anión superóxido, peróxido de hidrógeno y el radical hidroxilo ^1,2,3. Las ROS tienen una vida útil muy corta debido a su naturaleza extremadamente reactiva químicamente. En los organismos aeróbicos, las ROS se forman incidentalmente dentro de las células como un subproducto permeable importante de la respiración aeróbica (cadena de transporte de electrones) en las mitocondrias. La acumulación transitoria de altos niveles de ROS ....

Protocolo

Todos los procedimientos de cría y experimentación de ratones deben llevarse a cabo de conformidad con la legislación local, nacional e internacional y las directrices sobre experimentación animal.

1. Inducción del crecimiento del cabello, inducción de quemaduras e identificación de LRC BrdU a largo plazo en el epitelio de la piel de la cola

NOTA: Utilice ratones C57BL/6 de 10 o 7 semanas de edad, preferiblemente compañeros de camada, para los diseños experimentales que se describen a continuación. En todos los procedimientos experimentales, los animales serán anestesiados por inhalación de isoflurano al 3% o eutan....

Resultados

La administración tópica del precursor mALA en la piel de la espalda y la cola del ratón da lugar a una acumulación significativa de PpIX en todo el tejido y, notablemente, en el folículo piloso, como lo demuestra la fluorescencia de color rosa rojizo de este compuesto bajo excitación con luz azul (407 nm) (Figura 2A,C). La irradiación posterior del tejido tratado con luz roja (636 nm) a una fluencia de 2,5−4 J/^cm2 promueve la producción transitoria de ROS en el t.......

Discusión

Aquí, presentamos una metodología que permite una activación transitoria de la producción endógena de ROS in vivo en la piel del ratón con efectos fisiológicos. La metodología se basa en un procedimiento fotodinámico para inducir una estimulación controlada y local del fotosensibilizador endógeno PpIX (Figura 1B). Este enfoque experimental es una herramienta interesante para estudiar la biología de las ROS en sistemas experimentales in vivo, constituyendo un avance significativo sobre las me.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
2′,7′-Diacetato de diclorofluorescina	Sigma Aldrich	D6883-50MG
5'-bromo-2'-deoxiuridina	Sigma Aldrich	B5002-500MG
Anti-Bromodeoxiuridina-Fluoresceína	Roche	11202693001
Crema depilatoria (p. ej., Veet)	Veet
Dihidroetidio	Sigma Aldrich	37291-25MG
Sistema de imagen in vivo, p. ej., IVIS Lumina 2	Perkin Elmer
mALA en forma de crema tópica, p. ej., METVIX Crema 160 mg/g Medidor de	Galderma
Power (p. ej., ThorLabs Modelo PM100D)	ThorLabs
Fuente de luz roja, p. ej., lámpara LED Aktilite de 636 nm	Photocure ASA

energía