Dos paradigmas de preferencia de lugar en tiempo real diferentes utilizando optogenética dentro del área tegmental ventral del ratón

Summary

Aquí presentamos dos protocolos paso a paso fáciles de seguir para los paradigmas de preferencia de lugar utilizando optogenética en ratones. Usando estas dos configuraciones diferentes, los comportamientos de preferencia y evitación se pueden evaluar sólidamente dentro del mismo aparato con alta selectividad espacial y temporal, y de una manera directa.

Abstract

Entender cómo la activación neuronal conduce a una salida conductual específica es fundamental para la neurociencia moderna. La combinación de optogenética en roedores con pruebas conductuales en paradigmas validados permite medir las consecuencias conductuales tras la estimulación de neuronas distintas en tiempo real con alta selectividad espacial y temporal, y por lo tanto el establecimiento de relaciones causales entre la activación neuronal y el comportamiento. Aquí, describimos un protocolo paso a paso para un paradigma de preferencia de lugar en tiempo real (RT-PP), una versión modificada de la prueba clásica de preferencia de lugar acondicionado (CPP). El RT-PP se realiza en un aparato de tres compartimentos y se puede utilizar para responder si la estimulación optogenética de una población neuronal específica es gratificante o aversiva. También describimos una versión alternativa del protocolo RT-PP, el llamado protocolo de preferencia de compartimiento neutro (NCP), que se puede utilizar para confirmar la aversión. Los dos enfoques se basan en extensiones de metodología clásica originada a partir de la farmacología conductual y la reciente implementación de optogenética en el campo de la neurociencia. Además de medir la preferencia de lugar en tiempo real, estas configuraciones también pueden proporcionar información sobre el comportamiento condicionado. Proporcionamos protocolos paso a paso fáciles de seguir junto con ejemplos de nuestros propios datos y discutimos aspectos importantes a tener en cuenta al aplicar estos tipos de experimentos.

Introduction

La implementación de la optogenética, una herramienta experimental moderna de neurociencia en la que la luz se utiliza para controlar la actividad neuronal, ha llevado en los últimos años a grandes avances en la comprensión de cómo las poblaciones neuronales específicas afectan el comportamiento^1,2,3. La excepcional selectividad espacial y temporal de la optogenética permite establecer relaciones causales entre excitación o inhibición de grupos celulares de interés y salida conductual^2,3. La selectividad espacial en la optogenética se garantiza comúnmente a través del sistema Cre-Lox en el que la actividad de Cre recombinase conduce a la recombinación de cualquier secuencia de ADN presente entre los sitios de Lox, los llamados alelos floxed (flanqueados por sitios lox)⁴. El objetivo con el uso del sistema Cre-Lox en optogenética es lograr la expresión de alelos que codifican opsins optogenéticos en neuronas específicas de interés mientras dejan a las neuronas circundantes desprovistas de expresión. Las opsins son proteínas sensibles a la luz que, al invocar la luz, permiten un flujo de iones específico que afecta la excitabilidad neuronal o influyen en las funciones celulares mediante la modulación de las vías del efector aguas abajo. Nuevas variantes de opsins que difieren en acción (excitatoria, inhibitoria, modulatoria), mecanismo, activación por longitud de onda de luz y propiedades cinéticas⁵ se están desarrollando continuamente para satisfacer las necesidades de enfoques experimentales específicos. En cuanto a la excitabilidad, el uso de una opsin despolarizante o hiperpolarizadora dicta la actividad de las neuronas (excitación o inhibición, respectivamente) en la estimulación de la luz a una longitud de onda específica entregada en el cerebro³.

La actividad promotora selectiva dirige la expresión de Cre recombinase a las neuronas de interés. Mediante la implementación de un alelo floxed de la opsin de interés, la recombinación mediada por Cre asegurará que la opsin se expresa selectivamente en las neuronas que co-expresan Cre recombinase^3,6. Este uso de doble transgénico para dirigir la selectividad espacial ha demostrado ser muy eficiente en optogenética. Por lo tanto, mientras que la estimulación de la luz para activar las opsins se entrega ampliamente a través de una fibra óptica implantada intracerebralmente conectada a una fuente de luz (LED o láser)³, sólo las neuronas que expresan tanto Cre recombinase como el alelo opsin floxed responderán a esta estimulación. El sistema Cre-Lox en roedores se puede lograr de diferentes maneras utilizando sólo transgénicos (tanto Cre recombinase como la construcción de opsin floxed están codificados en animales transgénicos), sólo las inyecciones virales (construcciones de ADN para Cre recombinase y la opsin floxed se entregan a través de un portador viral), o una combinación de las dos (por ejemplo, Cre recombinase está codificado por un animal transgénico que se inyecta con un virus que lleva la construcción de opsin floxed)⁵. La construcción de ADN opsin floxed generalmente se clona en marco con un gen reportero para permitir la visualización de la recombinación mediada por Cre en secciones de tejido. Mientras que la optogenética también se puede realizar en ratas, los protocolos presentados se han generado para ratones. Para simplificar, los ratones que llevan tanto Cre recombinase como la opsina floxed se denominarán "ratones optogenéticos". En los protocolos descritos a continuación, los ratones optogenéticos han sido generados por un enfoque transgénico mixto (Cre recombinase bajo control de dos promotores diferentes) y viral (usando un virus asociado a adeno, AAV, para entregar el enfoque de ADN opsin floxed - en nuestro caso ChR2/H134R). La obtención y el mantenimiento de líneas de ratón transgénicas es una parte esencial de la metodología. Los ratones transgénicos cre-driver y floxed opsin pueden ser producidos para cada propósito, o comprados si están disponibles comercialmente, al igual que una gama de virus que llevan secuencias de ADN que codifican Cre recombinase y opsinas floxed en diferentes formas.

La optogenética, junto con las pruebas conductuales, ha demostrado ser una herramienta valiosa para estudiar el papel de distintas regiones cerebrales, o poblaciones neuronales discretas, en determinados tipos de comportamiento. En el contexto de un comportamiento relacionado con la recompensa, la optogenética ha permitido la verificación de hallazgos anteriores en los campos de la farmacología conductual y la psicología experimental, y también ha permitido un nuevo nivel de disección relevante espacio-temporal mente sobre cómo ciertas neuronas afectan el comportamiento. Un método que se ha utilizado en varios estudios para evaluar el comportamiento relacionado con la recompensa es una versión modificada del método clásico conocido como Preferencia de Lugar Condicionado (CPP). CPP clásico se ha utilizado para evaluar las propiedades gratificantes o aversivas de las drogas de abuso a través de su capacidad para inducir asociaciones pavlovianas con señales del medio ambiente^7,8. En términos pavlovianos, la droga es un estímulo no condicionado ya que puede obtener enfoque o abstinencia si es gratificante o aversivo, respectivamente. Emparejamiento continuo de la droga con varios estímulos neutros, que ellos mismos no obtienen ninguna respuesta, puede conducir a la aproximación o abstinencia simplemente tras la presentación de la previamente neutral, pero después del emparejamiento, lo que se conoce estímulos condicionados ⁹. El análisis CPP se realiza generalmente en un aparato que contiene dos compartimentos del mismo tamaño, pero donde cada compartimiento se define por características distintas, como la textura del suelo, los patrones de pared y la iluminación (estímulos neutros). Los dos compartimentos están conectados por un pasillo o una abertura entre los compartimentos. Durante el acondicionamiento, el sujeto, generalmente un pequeño roedor, recibe inyecciones pasivas de un medicamento mientras está restringido a uno de los dos compartimentos principales y salina mientras está restringido al otro compartimiento. Los efectos gratificantes de la droga se evalúan posteriormente en una sesión libre de drogas cuando el sujeto se le permite explorar libremente todo el aparato. La cantidad de tiempo pasado en el compartimiento previamente emparejado con fármacos (la respuesta condicionada) se considera que refleja los mecanismos de aprendizaje Pavloviano mediados entre los efectos gratificantes de la droga y las señales del compartimiento asociado con su administración (estímulosacondicionados). Si el animal pasa más tiempo en el compartimiento emparejado con drogas, la droga ha inducido una preferencia de lugar condicionado que significa que tiene efectos gratificantes sobre el comportamiento. Por otro lado, si la droga se percibe como aversiva, el animal evitará el compartimiento emparejado con drogas y pasará más tiempo en el compartimiento emparejado con salina, lo que indica aversión al lugar condicionado (CPA)^8,9,10,11.

Dado que la optogenética se puede implementar para controlar la actividad neuronal en "tiempo real", el uso de un paradigma conductual similar, pero distinto de, la configuración de CPP permite la medición de la preferencia de lugar tras la activación neuronal directa. Por lo tanto, el análisis basado en optogenética según la preferencia por lugares se conoce a menudo como un paradigma de análisis de preferencia de lugar en tiempo real (RT-PP). En el paradigma RT-PP, la estimulación optogenética de neuronas distintas a través del sistema Cre-Lox reemplaza la administración sistémica de un fármaco realizado en el CPP clásico, de modo que el paradigma RT-PP en su lugar mide si la estimulación neuronal inducida optogenéticamente es percibido como gratificante o aversivo. La descripción actual se centrará en ratones optogenéticas, pero también las ratas optogenéticas se pueden probar utilizando protocolos similares.

En lugar de acondicionar a un compartimiento a la vez como en el paradigma Clásico de CPP, el ratón optogenético en el paradigma RT-PP se permite moverse libremente en todo el aparato y el comportamiento se registra a lo largo de la sesión. La entrada en uno de los compartimentos se combina con la estimulación de la luz intracraneal. Bajo los parámetros de estimulación de la luz apropiados, las neuronas que expresan una opsina excitatoria se activarán de este modo. Si la estimulación de la luz se percibe como gratificante, el ratón optogenético permanecerá en el compartimento emparejado, mientras que si la estimulación de la luz se percibe como aversiva, el ratón saldrá del compartimiento para escapar de la estimulación. Este tipo de análisis permite evaluar el aprendizaje contingente: El sujeto puede desencadenar la estimulación de la luz y, por lo tanto, la activación neuronal entrando en un compartimiento, y detener la estimulación saliendo del compartimiento, de forma similar al prensado de palanca durante una tarea instrumental. Además, los mecanismos de aprendizaje asociativo pueden evaluarse durante las sesiones posteriores en las que el tiempo que se pasa en cada compartimiento se mide en ausencia de estimulación. De esta manera, el investigador puede disociar entre los efectos inmediatamente gratificantes sobre la estimulación de las neuronas de interés y la formación de la memoria asociativa relacionada con ella¹².

En el estudio actual, describimos dos protocolos de configuración paso a paso para el comportamiento de preferencia de lugar impulsado por optogenéticades de ratones que se mueven libremente. El primer protocolo describe RT-PP dentro de un aparato de tres compartimentos y ha sido esbozado sobre la base de los protocolos presentados recientemente por Root y sus colegas¹³ y otros autores^{12,14,15,16,17,18}. El experimento consta de dos fases que comprenden varias sesiones diarias (que se muestran en la Figura 1A). Cada sesión está diseñada para diferentes propósitos y los parámetros de estimulación de acoplamiento con un compartimiento se cambian en consecuencia. La primera sesión, la"Prueba previa",se utiliza para evaluar la preferencia inicial del sujeto a cualquiera de los compartimentos. Mientras está conectado al cable de conexión, el sujeto puede explorar libremente el aparato en ausencia de estimulación durante 15 minutos. Si la preferencia inicial a cualquier compartimiento es superior al 80%, el ratón se excluye del análisis, ya que el sesgo lateral inicial podría sesgar el análisis. Después de la"Prueba previa", "Fase 1" comienza. La primera parte consta de dos sesiones consecutivas, diarias, de 30 minutos de "RT-PP". Durante"Fase 1",el ratón optogenético está conectado a la fuente láser a través del cordón del parche y se coloca en la arena para explorarlo libremente. El ratón recibe estimulación láser intracraneal al entrar en uno de los compartimentos principales. Se pueden realizar experimentos piloto para determinar qué compartimiento se asignará como emparejado con láser y cuáles como no emparejados. Si se demuestra que la estimulación es gratificante, el láser se acoplará al compartimento menos preferido durante la"Prueba previa"y al más preferido si la estimulación es aversiva. Por lo tanto, el protocolo RT-PP presentado sigue un diseño sesgado en el sentido de que la estimulación láser no se asigna aleatoriamente a ninguno de los dos compartimentos principales (diseño imparcial), sino que se elige para evitar cualquier preferencia inicial del ratón. La entrada en el otro compartimento principal o en el compartimento neutro que conecta los dos compartimentos principales no da lugar a la estimulación de la luz intracraneal y, por lo tanto, no están emparejados con la luz. Estas sesiones permiten una evaluación en tiempo real de las propiedades gratificantes o aversivas de la estimulación de poblaciones neuronales específicas. En el último día de"Fase 1",se lleva a cabo una sesión de 15 minutos sin ninguna estimulación. Esta sesión sirve para abordar las respuestas condicionadas ("CR") que resultan del aprendizaje asociativo entre la estimulación y el entorno donde se recibió. Al menos tres días después de"Fase 1",tiene lugar la "Fase deReversión"que sigue la misma estructura que "Fase 1", pero el compartimiento principal previamente no emparejado ahora está emparejado con estimulación de la luz. Como en el caso de"Fase 1",las dos sesiones de estimulación son seguidas por una sesión"CR". La"Fase de Reversión"se utiliza para confirmar que el comportamiento del ratón está supeditado a la estimulación optogenética y no está relacionado con parámetros aleatorios. Cada sesión del experimento RT-PP debe programarse por separado dentro del software de seguimiento. El protocolo actual describe tales ajustes dentro de un software específico, pero cualquier otro software de seguimiento capaz de enviar señales de modulación transistor-transistor-lógica (TTL) a la fuente de luz se puede utilizar.

El segundo protocolo describe una configuración novedosa que se denomina el paradigma neutral compartment Preference (NCP). Este protocolo modificado del RT-PP aprovecha el pequeño tamaño y la transparencia del corredor de conexión que es naturalmente evitado por el ratón debido a su composición estrecha y transparente. Al emparejar ambos compartimentos principales con estimulación de la luz y solo dejar el corredor libre de estimulación lumíntina, la configuración del PNC se puede utilizar para probar si la estimulación optogenética obligará al ratón a pasar más tiempo en el pasillo para evitar recibir estimulación optogenética. Al comparar el tiempo invertido en los dos compartimentos emparejados con la luz con el tiempo que pasa en el pasillo, se puede realizar una verificación de la aversión inducida por el optogenéticamente. El experimento NCP consiste en dos sesiones diarias consecutivas en las que los ratones optogenéticos reciben estimulación (30 min cada uno) para medir la preferencia en tiempo real, y una sesión sin láser (15 min) para evaluar respuestas condicionadas de manera similar a las del RT-PP Protocolo.

Los protocolos RT-PP y NCP proporcionados a continuación fueron validados recientemente en nuestro laboratorio en el estudio de cómo diferentes tipos de neuronas ubicadas en el área tegmental ventral (VTA) están involucrados en varios aspectos del comportamiento relacionado con la recompensa¹². Aquí, para ejemplificar la implementación de los protocolos RT-PP y NCP, transportador de dopamina (DAT)-Cre¹⁹ y transportador de glutamato vesicular 2 (VGLUT2)-Cre²⁰ ratones transgénicos fueron inyectados estereotácticamente con AAV llevando un ADN de canalrhopsin2 (ChR2) floxed en el VTA con lo cual se implantó una fibra óptica por encima del VTA. Las respuestas conductuales obtenidas tras el análisis de estos ratones utilizando los protocolos RT-PP y NCP proporcionados muestran cómo la activación de las neuronas dopaminérgicas y glutamatérgicas dentro del VTA conduce a diferentes respuestas conductuales(Figura 1).

Los protocolos paso a paso para paradigmas RT-PP y NCP se proporcionan con información que va desde el genotipado de ratones transgénicos, inyecciones virales estereopónicas y colocación de fibra óptica, hasta la programación de software de seguimiento para el control láser y el comportamiento Evaluación. Además, se discuten las sugerencias de modificación del protocolo en términos de parámetros de estimulación y aspectos experimentales que pueden afectar al resultado científico. Mientras que los protocolos se describen en el contexto de la VTA, se pueden aplicar a cualquier área cerebral o población neuronal, siempre que estén disponibles las herramientas de optogenética relevantes, como Cre-driver relevante y opsins floxed.

Protocol

Este estudio se ha llevado a cabo utilizando ratones heterocigotos DAT-Cre¹⁹ y VGLUT2-Cre²⁰ de ambos sexos, de edad >8 semanas y pesaje >20 g. Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con la Sueca (Ley de Bienestar Animal SFS 1998:56) y la Legislación de la Unión Europea (Convenio ETS 123 y Directiva 2010/63/UE) con permiso de los comités éticos animales locales.

1. Genotipado de ratones

1. Tome biopsias de oído utilizando un punzante para usar los oídos para el genotipado de los ratones transgénicos.
2. Prepare los punzones auditivos para realizar una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando imprimaciones hechas específicamente.
   NOTA: En este protocolo, se utilizaron imprimadores dirigidos por Cre.
   1. Añadir 75 l de tampón de lisis (buffer 1: 250 mM NaOH, 2 mM EDTA) en cada tubo de 1,5 ml que contenga un punzón auditivo.
   2. Incubar en un bloque de calefacción a 96oC durante 30 min.
   3. Deje que las muestras se enfríen durante 5 min y luego agreguen 75 s del búfer de neutralización (buffer 2: 400 mM Tris-HCl pH 8.0).
3. Realizar PCR de acuerdo con los procedimientos estándar^12,21 utilizando las imprimaciones apropiadas (aquí: Cre FW 5'-ACGAGTGATGAGGTTCGCAAGA-3', Cre REV 5'-ACCGACGATGAAGCATGTTTAG-3').
   ADVERTENCIA: Trabaje sobre hielo bajo una campana de PCR y preste atención a no contaminar los reactivos y las muestras.
   1. Prepare la mezcla maestra de PCR. Multiplique los siguientes volúmenes de acuerdo con el número de muestras que se van a analizar, incluidas las muestras de control adecuadas. Mezclar los reactivos para una sola reacción de volumen final de 25 l en el siguiente orden: agua destilada (18,9 l), tampón de 10x con MgCl₂ (2,5 l), mezcla dNTP de 10 ml (0,5 l), imprimación directa de 10 m (1 l), imprimación inversa de 10 ml (1 l), polimerasa de ADN de 5 U/L (0,1 l) y plantilla (1. se añadirán en los siguientes pasos).
      NOTA: Agregue siempre un control negativo, positivo y vacío (sin ADN de plantilla) para garantizar resultados válidos.
   2. Añadir 24 l de mezcla maestra en tubos PCR.
   3. Añadir 1 l de ADN de plantilla (procedente del punzón de oído de cada ratón) en cada tubo de PCR.
   4. Centrifugar brevemente los tubos PCR para asegurarse de que el ADN de la plantilla está dentro de la mezcla maestra.
   5. Realice pcR con un ciclor térmico utilizando el programa de ciclismo de la Tabla 1.
4. Preparar un gel de agarosa para ejecutar las muestras utilizando electroforesis.
   NOTA: El tamaño dependerá del número de muestras que deban analizarse.
   1. Añadir 1% p/v de agarosa en polvo de agarosa en 1 tampón Tris-acetate-EDTA (TAE) en una botella de vidrio. Calienta en el microondas hasta que la agarosa esté completamente disuelta, comprobando regularmente que no hierva.
      ADVERTENCIA: Tome precauciones para evitar quemaduras.
   2. Dejar enfriar el gel a aproximadamente 50 oC y añadir una mancha de gel de ácido nucleico (0,5 l/50 ml de gel).
   3. Vierta el gel en la bandeja de fundición que contenga peines de pozo y déjelo a temperatura ambiente hasta que se solidifique por completo. Retire los peines suavemente.
   4. Llene el tanque de electroforesis con 1 tampón TAE y coloque el gel en el tanque.
   5. Añadir 2 l de 1 x tinte de carga de ADN en cada una de las muestras de ADN.
   6. Cargar 4 l de escalera de ADN en el primer pozo del gel, luego proceder a cargar el volumen completo de las muestras en los pozos restantes.
   7. Ajuste la fuente de alimentación de la electroforesis a 140 V y funcione durante 25 a 30 minutos.
   8. Coloque el gel debajo de una fuente UV y tome una foto de los resultados.

2. Cirugía estereotaxica

1. Después del genotipado, los ratones separados mantienen los positivos para Cre. Espere hasta que tengan al menos 8 semanas de edad y pese >20 g para realizar la cirugía.
   1. Desinfectar el medio ambiente y esterilizar las herramientas quirúrgicas para realizar la cirugía en condiciones asépticas.
   2. Inyectar los ratones por vía subcutánea con analgésico de 30 minutos antes de la cirugía.
   3. Anestetizar a los ratones con isoflurano (2-3% en aire normal para la inducción y 1,5-2,0% para el mantenimiento de la anestesia). Asegurar que se alcance un nivel de anestesia adecuado probando la ausencia de reflejos del dolor pellizcando suavemente el dedo del ratón. Ajuste la entrega de isoflurano en consecuencia.
   4. Coloque el ratón sobre el aparato estereotaxico. Agregue lubricante para los ojos para prevenir lesiones oculares debido a la sequedad y aseque el cabello de la parte superior del cráneo. Utilice una almohadilla de calentamiento para mantener la temperatura del ratón estable.
   5. Inyectar 100 s de anestésico local debajo de la piel del cráneo y permitir que 5 minutos surtan efecto.
   6. Preparar el sitio de la incisión mediante tres aplicaciones circulares de alcohol o solución salina estéril alternando con yodo. Utilice una punta de algodón estéril e inicie la aplicación desde la línea de incisión, hacia afuera.
   7. Levante suavemente la piel con fórceps y haga una incisión de 1,5 cm a lo largo del eje rostrocaudal con tijeras quirúrgicas para revelar la superficie del cráneo.
   8. Con un palito de algodón, aplique la solución H₂O₂ para eliminar el periosteum.
   9. Enjuague el cráneo con solución salina estéril y séquelo con aplicadores estériles de punta de algodón.
   10. Localice el bregma y el lambda.
   11. Determinar la alineación plana del cráneo colocando la punta de la aguja de inyección, ajustada en el marco estereotaxico, en bregma y lambda. Mida las coordenadas ventrales para cada posición y compare. Cuando el cráneo es plano, la coordenada ventral para bregma y lambda son idénticas. Si no es así, ajuste la posición de la cabeza y vuelva a realizar las medidas.
   12. Buscar y marcar la posición (AP: -3.45 mm, ML: -0.2 mm de bregma según Franklin y Paxinos²²) donde la inyección del virus dependiente de Cre y la implantación de la fibra óptica tendrá lugar y hará un pequeño agujero utilizando un micro taladro.
   13. Cargue 400 nL de virus en la jeringa de 10 l montada en el aparato estereotaxico utilizando una bomba de precisión.
   14. Bajar la aguja (34 G, biselado) cuidadosamente e inyectar 300 nL de virus optogenético dependiente de Cre (AAV5-EF1a-DIO-ChR2(H134)-eYFP [5.6 x 10¹² vg/mL]) en el VTA (AP: -3.45 mm, ML: -0,2 mm de bregma y -4,4 mm de la superficie del cráneo, según Franklin y Paxinos²²) a una velocidad de inyección de 100 nL/min utilizando la bomba de precisión.
   15. Después de la inyección, deje la aguja en su lugar durante 10 minutos adicionales para permitir la difusión del virus(Figura 2A).
   16. Retraiga la aguja lentamente del lugar de inyección.
   17. Haga pequeños agujeros usando una microperforación para ajustar tornillos de anclaje que estabilizarán la fibra óptica y el complejo de cemento dental.
   18. Tome las coordenadas de bregma de nuevo e implante la fibra óptica (200 m de diámetro, 0,37 NA) a: AP: -3,45 mm, ML: -0,2 mm de bregma y -4,0 mm de la superficie del cráneo(Figura 2B)según Franklin y Paxinos²².
   19. Asegure la fibra en el cráneo usando cemento dental. Aplique suficiente cemento alrededor de la férula de fibra óptica para fijarlo al cráneo, pero preste atención a dejar 3 x 4 mm de la parte superior de la férula libre de cemento para permitir la conexión del cable de conexión(Figura 2C).
       NOTA: Preste atención a no llenar el agujero con cemento, ya que esto puede causar daño en el tejido cerebral. Se pueden añadir materiales hemostáticos en el agujero para evitar que esto suceda.
   20. Use pegamento tisular o suturas absorbibles para cerrar cualquier herida abierta y dejar que el animal se recupere durante al menos dos semanas. Dar una dosis adicional de analgésico de 12 a 24 h después de la cirugía.

3. Configuración del control de la fuente láser

1. Utilice microcontroladores de placa única para controlar la fuente láser. Escriba un script utilizando el software adecuado. Cargue el script en la placa del microcontrolador utilizando el cable de conexión adecuado al ordenador.
   NOTA: El script debe incluir modulación externa (entrada) procedente del software de seguimiento a través de una caja TTL y una salida al láser para controlar los parámetros de estimulación. Para una anchura de pulso de 10 ms a una frecuencia de 20 Hz, utilice el script que se encuentra en el archivo de codificación suplementario.
2. Conecte la placa al láser y a la caja TTL del hardware de seguimiento.
   1. Utilice un cable de red para conectar el cuadro TTL a la placa (pin 5 para el script proporcionado)(Figura 3A,C).
   2. Asegúrese de que el láser esté configurado para controlar mediante modulación externa y conecte el láser a la placa utilizando un cable FC/PC (pin 13 para el script dado)(Figura 3B,C).
   3. Conecte los pines apropiados a las partes de tierra de la placa.
3. Conecte la fuente láser a la fibra óptica.
   1. Conecte la fuente láser a una junta giratoria(Figura 3D).
   2. Conecte un cable de conexión(Figura 3E)a la junta giratoria.
   3. Estabilice la junta giratoria por encima del aparato pero fuera del área de grabación. Asegúrese de que la longitud del cable de conexión de fibra óptica es adecuada para permitir que el ratón se mueva sin dificultades en la arena(Figura 3F).

4. Configuración del experimento para el enfoque RT-PP dentro del software de seguimiento

1. Calibrar la configuración de la arena. Utilice una regla para medir una parte específica del aparato físico, dibuje una línea correspondiente a la parte medida en la imagen dentro del software bajo la pestaña Dibujar escala para calibrar e introduzca el valor ya conocido (paso 1 en la Figura 4).
2. Diseña la arena. Dibuje el área donde se registrará el movimiento de los ratones (paso 2 en la Figura 4).
3. Cree las zonas. Dibuje las zonas que finalmente se asignarán como emparejadas por láser, sin emparejar con láser y "neutrales" (paso 3 en la Figura 4).
4. Valide la configuración para confirmar que no hay parámetros en conflicto, por ejemplo zonas fuera de la arena (paso 4 en la figura 4)
5. Establezca los parámetros experimentales en la configuración del control de prueba de pestañas (paso 5 de la figura 4).
   1. Fije el tiempo de prueba tal y como se muestra en del paso 1 en el cuadro 5 para una sesión RT-PP de 30 minutos.
   2. Asegurándose de que el "control de hardware" esté activado, asigne un compartimiento como emparejado con láser en el que la entrada del ratón activará una señal TTL a través del software de seguimiento a la placa del microcontrolador. En la Figura 5 (paso 2) el compartimiento emparejado con láser es el compartimiento A. Para la fase de inversión, cambie los compartimentos para que el compartimiento B esté emparejado con láser y el compartimiento A no estará emparejado. Para ello, sustituya A por B y B por A en el software.

5. Modificación de la configuración para probar las propiedades aversivas de la estimulación utilizando el enfoque NCP

1. Siga los pasos 4.1 a 4.4 como se describió anteriormente.
2. Establezca la hora del experimento en 30 minutos a través de la opción "Repetir hasta" en la configuración del cuadro "Referencia" (paso 1 en la Figura 6).
3. Asigne las zonas A y B como emparejadas con láser (paso 2 en la Figura 6)agregando "cuando el punto central está en cualquiera de la zona A y la zona B" para el cuadro de condición relacionado con los ajustes de los compartimentos A y B. Tenga en cuenta que el láser se apagará cuando el animal se encuentre en el compartimento neutro.

6. Realizar un experimento con estimulación láser

1. Configure los ajustes de detección.
   1. Utilice un muñeco para parecerse al ratón con el fin de asegurar las configuraciones de detección apropiadas.
   2. Coloque el muñeco en un compartimiento del aparato y utilice la configuración automatizada con resta dinámica.
   3. Retire el muñeco y colóquelo en el compartimiento opuesto. Asegúrese de que el maniquí está completamente detectado y, si no, ajuste la configuración a través del software para lograr la detección adecuada.
      1. Durante este paso también compruebe si la estimulación funciona como se supone que debe hacerlo. Comience la adquisición utilizando los ajustes de control de prueba previamente configurados y coloque el muñeco en el compartimiento emparejado con láser y vea si la estimulación se activa como debería. A continuación, coloque el muñeco en el compartimento no emparejado y/o neutro y vea si la estimulación se detiene.
2. Utilice un medidor de potencia con un sensor para ajustar la potencia del láser a 10 mW utilizando la perilla del láser(Figura 3B). Realice este paso cada vez que se utilice estimulación láser.
   ADVERTENCIA: Utilice equipos oculares protectores, ya que la exposición directa a la luz láser puede causar daños permanentes en los ojos.
3. Coloque el ratón en el aparato.
   1. Saque suavemente el ratón de su jaula y conecte el implante de fibra óptica al cable de conexión de fibra óptica utilizando una funda de cerámica.
   2. Coloque el ratón suavemente en el compartimento neutro del aparato de tres compartimentos.
   3. Espere hasta que el software detecte el ratón.
   4. Retire las puertas correderas verticales que restringen el animal de entrar en los compartimentos principales.
   5. Permita que el animal explore libremente sin ninguna perturbación.
      NOTA: El mismo procedimiento se sigue cuando el animal no está recibiendo estimulación con la excepción de que el paso 6.2 no es necesario y que el láser está apagado todo el tiempo.

Results

El aparato de tres compartimentos(Figura 3F) es adecuado para abordar los efectos gratificantes de los fármacos y evaluar en tiempo real las propiedades gratificantes o aversivas de la estimulación directa de las neuronas utilizando la optogenética. Consta de dos compartimentos principales (20 cm [W] x 18 cm [L] x 25 cm [H]) y un compartimento de conexión más pequeño (20 cm [W] x 7 cm [L] x 25 cm [H]). Los compartimentos principales tienen una textura y patrones de pared y suelo distintos para facilitar el aprendizaje asociativo, mientras que el compartimento de conexión/neutro es estrecho y transparente para que los ratones pasen naturalmente menos tiempo en él. Como se describió anteriormente, el software de seguimiento se puede utilizar para registrar varios parámetros de comportamiento de los ratones, incluyendo el movimiento y el tiempo pasado en cada compartimiento, y para controlar la estimulación láser. Todo el experimento RT-PP se lleva a cabo a lo largo de 8 sesiones(Figura 1A) y permite tanto la evaluación de las propiedades gratificantes o aversivas de la estimulación directa (días 3, 4, 6 y 7) como la formación de asociaciones, positivas o negativas, en respuesta a la experiencia previa (días 5 y 8,"CR").

En primer lugar, probamos ratones DAT-Cre inyectados con virus AAV-ChR2-eYFP en el VTA para apuntar a las neuronas dopaminérgicas. De acuerdo con la literatura, observamos que los ratones preferían pasar tiempo en el compartimiento emparejado con la estimulación(Figura 1B, fase 1, días 3 y 4, círculos azules, medidas repetidas bidireccionales [RM] análisis de varianza [ANOVA], efecto del compartimiento F_(2,18) a 141, p < 0.001; efecto de la sesión x compartimiento F_(12,108) a 42,1, p < 0,001; Prueba post hoc de Tukey emparejada vs p < 0.001 no emparejada). La fase de reversión, donde se cambió el emparejamiento de los compartimentos con la estimulación láser, confirmó estas observaciones(Figura 1B,días 6 y 7, círculos azules, prueba post hoc de Tukey emparejado frente a compartimiento no emparejado p < 0.001) excluyendo así la posibilidad de que los resultados obtenidos de la fase 1 estuvieran relacionados con sesgos laterales o parámetros aleatorios. Promediando el tiempo invertido en cada compartimiento durante los cuatro días de RT-PP confirmó que los ratones pasaron en promedio alrededor del 70% de su tiempo en el compartimiento emparejado con láser en comparación con el no emparejado (20%) y el neutro (10 %) compartimentos(Gráficode barras de la Figura 1B, RM ANOVA unidireccional, efecto de la estimulación F_(2,6) a 139, p < 0.001, post de Tukey como emparejado sin emparejar y compartimentos neutros p < 0.001). Además, en ausencia de estimulación, en los días 5 y 8, los ratones pasaron significativamente más tiempo en el compartimiento previamente emparejado con estimulación láser (P < 0.001 post hoc de Tukey), lo que indica que la experiencia anterior fue suficiente para inducir comportamientos de aprendizaje asociativos reflejados como "buscando" la estimulación. Estos datos están de acuerdo con la literatura y demuestran que el método actual se puede utilizar de forma fiable para investigar los efectos gratificantes de la estimulación optogenética de poblaciones neuronales específicas en el VTA.

Luego probamos ratones VGLUT2-Cre inyectados con AAV-ChR2-eYFP en el VTA como arriba, para apuntar a las neuronas glutamatérgicas del VTA. En este experimento, observamos un fenotipo conductual opuesto al demostrado por los ratones DAT-Cre. Por lo tanto, los ratones evitaron el compartimiento emparejado con la estimulación y pasaron más tiempo en el no emparejado durante todos los días RT-PP(Figura 1C a la izquierda, RM ANOVA bidireccional, efecto del compartimiento F_(2,12) a 40,9, p < 0,001; efecto de la sesión x compartimiento F_(12,72) a 16,1, p < 0,001; Prueba post hoc de Tukey emparejada vs p < 0.001 no emparejada; Figura 1C derecha, efecto RM ANOVA unidireccional de la estimulación F_(2,6) a 162, p < 0.001, compartimientos post hoc emparejados de Tukey frente a compartimentos no emparejados y neutros p < 0.001). Curiosamente, durante los días 5 y 8 de la"CR"no mostraron una clara evitación del compartimiento previamente emparejado (no hay diferencias entre compartimentos emparejados y no emparejados). Es posible que la falta de respuesta condicionada se deba a un tiempo inadecuado en el compartimento emparejado con láser, lo que impidió la formación de asociaciones entre la activación por láser y el entorno particular donde tuvo lugar. Para explorar más a fondo este fenotipo de evitación, utilizamos un protocolo modificado que denominamos "preferencia de compartimiento neutro", abreviado NCP. En este experimento, ambos compartimentos principales se emparejaron con la estimulación y el compartimiento neutro permaneció libre de estimulación(Figura 7A). Hemos planteado la hipótesis de que, si la estimulación tiene propiedades aversivas, entonces el ratón se verá obligado a pasar tiempo en el compartimento más pequeño y neutro, para evitarlo. De hecho, en ambos días de estimulación (Stim1 y Stim2) los ratones pasaron la mayor parte del tiempo en el compartimento neutro (alrededor del 80%) en comparación con los compartimentos emparejados(Figura 7B,C; izquierda: efecto RM ANOVA bidireccional del compartimiento F_(2,8) a 70,9, p < 0.001; efecto de la sesión x compartimiento F_(4,16) a 6,9, p a 0,002, compartimiento neutro post hoc de Tukey "Estimulación 1" contra compartimiento 1 y 2 p < 0,01, compartimiento neutro "Estimulación 2" vs compartimiento 1 y 2 p < 0,001; derecha: unidireccional RM ANOVA, efecto de estimulación F_(2,2) 0.018, la prueba post hoc de Tukey empareje 1 y 2 vs neutral p < 0.05). Al igual que en el caso de los días"CR"durante la prueba RT-PP, los ratones no parecían formar asociaciones negativas entre los compartimentos y la estimulación; es decir, en ausencia de estimulación (CR), exploraron todos los compartimentos en el mismo grado(Figura 7B,no hay diferencias entre el tiempo pasado en compartimentos emparejados y el compartimento neutro). Los resultados de estos experimentos confirmaron el fenotipo conductual observado durante la configuración de RT-PP y así apoyar la implementación combinatoria de los paradigmas RT-PP y NCP.

Figura 1: Pruebas de comportamiento utilizando optogenética en el paradigma RT-PP. (A) Representación esquemática de la línea de tiempo de los experimentos. (B,C) Arriba a la izquierda: gráfico que representa el porcentaje de tiempo invertido en cada compartimiento a lo largo del experimento RT-PP para ratones DAT-Cre (N 10) y VGLUT2-Cre (N-7) inyectados con AAV-ChR2-eYFP. Círculos azules: compartimento emparejado con láser; blanco, círculos negros: compartimentos principales; círculos grises: compartimento neutro. Top right: porcentaje medio del tiempo empleado en cada compartimiento durante los días 3, 4, 6 y 7 (RT-PP). Parte inferior: mapas de calor representativos del tiempo invertido en cada compartimiento para un DAT-Cre y un ratón VGLUT2-Cre. Todos los datos se distribuyeron normalmente (prueba Shapiro-Wilk). Los resultados se presentan como medias : SEM. ***p < 0.001 emparejados vs no emparejados; •p < 0,05, p< 0,01, p< 0,001, compartimento emparejado vs neutro; •p < 0.01, p< 0,001 compartimiento no emparejado vs neutro. Esta cifra ha sido modificada de Bimpisidis et al.¹². Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Procedimiento quirúrgico para experimentos optogenéticos. (A) Inyección de vector viral dependiente de Cre en el VTA. (B) Implantación de la fibra óptica por encima del lugar de inyección. Tenga en cuenta los tornillos de anclaje utilizados para la estabilización. (C) Anclaje permanente de la fibra en el cráneo utilizando cemento dental. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Equipo utilizado en los experimentos de optogenética. (A) La casilla TTL utilizada en los estudios. Recibe la entrada del software de seguimiento y envía señales TTL a la placa del microcontrolador. (B) Vista frontal (superior) y trasera (inferior) de la fuente láser utilizada para los experimentos. (C) La placa de microcontrolador utilizada para controlar la estimulación láser. Observe las conexiones desde el cuadro TTL y a la fuente láser. (D) Junta giratoria. (E) Acorde de parche de fibra óptica utilizado en los experimentos. (F) El aparato de tres compartimentos utilizado para experimentos RT-PP y NCP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Diseño de arena y zonas dentro del software de seguimiento. Paso 1: Calibración de la configuración. Paso 2: Dibujo de toda la arena. Paso 3: Zonas de dibujo dentro de la arena. Paso 4: Configurar validación. Paso 5: Pestaña Configuración de Control de Prueba para configurar los parámetros de tiempo y estimulación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Configuración de los parámetros de tiempo y estimulación de un experimento RT-PP dentro del software de seguimiento. Adición de reglas específicas para la duración (paso 1) y las condiciones para la estimulación de la luz (paso 2). Las condiciones se pueden cambiar fácilmente para adaptarse a los requisitos de la fase de inversión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Configuración de los parámetros de tiempo y estimulación de los experimentos NCP dentro del software de seguimiento. La duración de las sesiones de estimulación (paso 1) es similar a las de RT-PP, pero las condiciones para la activación de la estimulación de la luz (paso 2) son diferentes. La entrada a cualquiera de los compartimentos principales (aquí denominada zona A y zona B) da como resultado una estimulación optogenética que se termina solo cuando el ratón entra en el compartimento neutro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Pruebas conductuales utilizando optogenética en el paradigma NCP. (A) Representación esquemática de la configuración experimental. (B) Izquierda: gráfico que representa el porcentaje de tiempo invertido en cada compartimiento durante los dos días de estimulación (Stim1 y Stim 2) y durante la sesión de respuesta condicionada (CR) para ratones VGLUT2-Cre inyectados con AAV-ChR2 en el VTA (N.o 5). Derecha: porcentaje medio del tiempo empleado en cada compartimiento durante los dos días de estimulación del PNC. (C) Mapa de calor representativo del tiempo empleado en cada compartimiento para un ratón VGLUT2-Cre durante uno de los días de estimulación. Normalmente se distribuían datos (prueba Shapiro-Wilk). Los resultados se presentan como media sin SEM. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 sin emparejar frente a 1 emparejado y 2 compartimentos emparejados. Esta cifra ha sido modificada de Bimpisidis et al.¹². Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Paso	Temperatura	Duración	Ciclos
1. Desnaturalización inicial	95 oC	4 min	1
2. Desnaturalización	95 oC	30 s	30
3. Recocido	55 oC	30 s
4. Extensión	72 oC	40 s
5. Extensión final	72 oC	6 min	1
6. Mantenga pulsado	4 oC	Hasta que el experimentador lo detuvo	1

Tabla 1: El programa de ciclismo PCR.

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Discussion

En el estudio actual, presentamos dos protocolos paso a paso de cómo realizar diferentes tipos de análisis de preferencias de lugar utilizando optogenética en ratones. Los protocolos descritos se utilizaron para evaluar los fenotipos conductuales gratificantes o aversivos de las neuronas VTA (Figura 1 y Figura 6)¹², pero se pueden utilizar para explorar el papel conductual de las neuronas en otras regiones del cerebro, así.

Varios estudios recientes han descrito paradigmas RT-PP en aparatos de dos compartimentos^23,24 y tres compartimentos^{13,14,15,16,17,18}. Los protocolos actuales describen configuraciones detalladas para los protocolos RT-PP y NCP en un aparato de tres compartimentos que se asemeja a los utilizados tradicionalmente en experimentos cPP para evaluar los efectos conductuales sobre la administración de drogas de abuso. Mientras que los resultados sólo se presentan aquí como el porcentaje de tiempo que el ratón pasó en cada compartimiento, el software de seguimiento permite el análisis de varios otros parámetros de comportamiento, tales como transiciones a zonas, velocidad, tiempo pasado inmóvil y más. El análisis de diferentes parámetros puede ser importante para la interpretación de los datos.

Los protocolos RT-PP actuales son flexibles y se pueden modificar para probar si diferentes tipos de patrones de estimulación tienen efectos gratificantes. Los parámetros del control láser se pueden cambiar fácilmente a través del script de la placa del microcontrolador o dentro del software de seguimiento, demostrando la versatilidad de la configuración. Sugerimos una frecuencia de estimulación de 20 Hz que esté dentro del rango, y a veces más baja, de frecuencias aplicadas en estudios anteriores utilizando la misma variante opsin (ChR2/H134R) para estudiar las neuronas dopaminérgicas y glutamatérgicas y sus terminales^{13,14,16,17,18,23,24,25,26,27}. Estudios recientes han demostrado que las frecuencias de estimulación más altas pueden tener los efectos opuestos en el comportamiento que las más bajas, y que estos efectos están mediados a través de un bloque de despolarización causado por frecuencias más altas^28. Del mismo modo, se han demostrado diferencias en la producción conductual al estimular las neuronas glutamatérgicas y GABAérgicas en el área preóptica lateral¹⁵. Estos estudios examinaron las neuronas de diferentes áreas que el VTA y los efectos más grandes se observaron en altas frecuencias de las neuronas no glutamatérgicas^15,28. Nuestra elección en 20 Hz se basa en estudios previos de neuronas glutamatérgicas y dopaminérgicas VTA que demuestran que por diferentes frecuencias de estimulación, la salida conductual relacionada con la recompensa no se altera significativamente^24,26.

Un parámetro adicional que se puede ajustar y que puede influir en el resultado experimental es la potencia de la fuente de luz. Mayor potencia láser puede aumentar el tamaño de la zona estimulada por la luz, que puede ser beneficioso en algunos tipos de experimentos, pero con el inconveniente de un aumento en la temperatura⁵. De hecho, un estudio reciente ha demostrado que los aumentos inducidos por láser en la temperatura pueden alterar la fisiología cerebral y afectar las mediciones conductuales²⁹. Estas observaciones ponen de relieve la importancia de incluir controles opsin negativos en el diseño experimental. En el protocolo actual, utilizamos una potencia láser de 10 mW similar y que ha demostrado anteriormente ser eficaz en la estimulación de neuronas dopaminérgicas y glutamatérgicas en el VTA^16,24,26. Al configurar experimentos, es importante prestar atención al tamaño del área en la que se encuentran las células de interés y las propiedades de fibra óptica y cable de conexión (apertura numérica, diámetro del núcleo). Estos parámetros son esenciales a tener en cuenta al realizar cálculos relacionados con la potencia láser. Para más detalles, se puede utilizar la calculadora desarrollada por el laboratorio de Karl Deisseroth (http://web.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php).

La verificación histológica de la recombinación de Cre-Lox es otro aspecto crítico a la hora de aplicar experimentos de optogenética. La validación de la eficiencia de la recombinación siempre debe tener lugar en una cohorte piloto antes del inicio de cualquier experimento conductual en un gran grupo de animales. Esto es importante por razones éticas, pero también para una producción experimental optimizada. Cada construcción viral puede mostrar especificidad variable para distintos tipos neuronales y en diferentes regiones^5,un parámetro que puede afectar a los experimentos de maneras impredecibles e incluso engañosas. Por ejemplo, hemos validado previamente el patrón de recombinación Cre-Lox de los virus AAV5 en el VTA de ratones DAT-Cre y encontramos que las inyecciones unilaterales eran suficientes para apuntar a la mayoría del área de interés. Cuando luego estudiamos subpoblaciones restringidas espacialmente dentro del VTA, como una caracterizada por la expresión NeuroD6, observamos que las inyecciones virales bilaterales eran más eficientes para apuntar a un mayor número de neuronas dando efectos conductuales más pronunciados sobre la estimulación de la luz optogenética^12. Además, el tiempo desde la cirugía hasta el inicio de experimentos conductuales tiene que ser abordado cuidadosamente. Dos semanas es tiempo suficiente para que una construcción de ADN ChR2 se exprese en los cuerpos celulares como mostramos aquí, pero podrían ser necesarios tiempos de espera más largos (8 semanas) si el investigador está probando el efecto de la estimulación en las áreas de proyección^13,14,15,17.

Vale la pena señalar que el volumen de virus inyectado (en nuestro caso 300 nL) podría ser adecuado al estudiar las neuronas en el VTA, pero el volumen y el rumbo deben ajustarse dependiendo de la eficiencia de la transducción y el tamaño de la estructura estudiada. Además, para las estructuras bilaterales situadas a una distancia del eje mediolateral, podría ser necesario realizar inyecciones bilaterales, y también implantar fibra óptica bilateralmente para garantizar la activación/inhibición en ambos hemisferios.

Por último, siempre es necesario realizar análisis histológicos post mortem para validar y confirmar la eficiencia de la recombinación de Cre-Lox y verificar el lugar de implantación correcto de la fibra óptica en el lugar previsto. La recombinación inesperada, excesivamente restringida o excesiva de Cre-Lox podría ocurrir debido a la distribución desconocida de neuronas que expresan Cre fuera de los límites de la zona prevista, o debido a diferencias en el serotipo del virus, mal manejo del virus, obstrucción de la jeringa para la administración de virus u otros problemas relacionados con la cirugía. La verificación de la recombinación satisfactoria de Cre-Lox y la correcta implantación de la fibra óptica deben realizarse para confirmar cualquier resultado estadístico de las evaluaciones del comportamiento con el fin de sacar conclusiones seguras.

En cuanto a los datos proporcionados aquí como ejemplos de cómo se pueden utilizar los dos paradigmas de comportamiento, se esperaba la preferencia significativa al lado emparejado por la luz obtenida por estimulación optogenética de neuronas dopaminérgicas en el VTA mediante el análisis de ratones DAT-Cre en el paradigma RT-PP basado en hallazgos anteriores^23,25,26,27 mientras que no se anticipó la evitación de este lado por los ratones V2Glut. Las neuronas VGLUT2 del VTA y sus proyecciones han demostrado estar involucradas tanto en la recompensa como en la aversión^{16,17,24,30,31}, y por lo tanto realizamos el análisis NCP para evaluar el comportamiento de evitación aparente observado en la configuración actual de RT-PP con más detalle. Mediante el uso del corredor estrecho y transparente como el único compartimento emparejado no ligero para confirmar las propiedades aversivas de la estimulación de las neuronas glutamatérgicas VTA, es evidente que en esta configuración particular de tres compartimentos, la activación optogenética de estas neuronas causa una respuesta aversiva. Estos experimentos, que se mostraron aquí para ejemplificar situaciones que podrían beneficiarse del uso de los protocolos RT-PP y NCP, formaban parte de un estudio publicado recientemente, y el conjunto de datos completo, así como las discusiones sobre estos hallazgos se pueden encontrar en esta publicación¹².

Además del NCP, las formas alternativas de confirmar la aversión incluyen la fuerte iluminación de un área dentro de un área de campo abierto mientras empareja el resto de la arena con la activación láser, o realizar una tarea de evitación activa en la que el ratón tiene que realizar un patrón específico de comportamiento para terminar la estimulación láser^15.

En resumen, los protocolos descritos proporcionan información crítica sobre cómo realizar con éxito el análisis RT-PP y NCP de la manera más eficiente con el fin de desentrañar el papel de la activación neuronal en la recompensa y la aversión. Dependiendo de la hipótesis científica, se puede analizar una serie de parámetros utilizando estos protocolos, y cada protocolo también se puede combinar con otros paradigmas validados para análisis de comportamiento optimizados que implementan optogenética para abordar el cerebro específico áreas y neuronas de interés.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Virus dependiente de AAV-Cre	UNC Vector Core	:	una gran variedad de virus para adaptarse a las necesidades de cualquier proyecto
Tampón Agarose	VWR Life Science	443666A
para PCR	KAPA BIOSYSTEMS	KB1003	10x, contiene 1,5 mM de MgCl2 en 1x
Bupivacaína (Marcaína)	Aspen	N01BB01	solución de 5 mg/ml, requiere receta médica
Carprofeno (Norocarpo)	N-Vet	27636	antiinflamatorio, analgésico; 50 mg/ml solución, requiere receta
médica dNTP set	Thermo Fisher Scientific	R0181	100mM, deben ser diluidos a 10mM y escalera de ADN mixto
	Thermo Fisher Scientific	SM0243	100 bp, 50 μ g Regla génica
Colorante de carga de ADN	Thermo Fisher Scientific	R0611	6x, diluir a 1x antes de usar
Perforador	de orejas AgnThos	AT7000	perforador de orejas para tomar muestras de tejido para PCR o para marcar animales
Latiguillos de fibra óptica	Lentes dóricas	MFP_200/240/900-0.22_1m_FC-ZF1.25
Fibra óptica implantable	Lentes dóricas	MFC_200/245-0.37_5mm_ZF1.25_FLT	Las propiedades de las fibras pueden cambiar dependiendo del experimento
Bomba de infusión para inyecciones de virus	AgnThos	Legato 130	contiene una bomba remota para asegurar la jeringa directamente en el marco de Stereotexi
Isoflurano (Forano)	Baxter	N01AB06	Anestésico volátil, requiere receta
médica Tornillos de joyería	AgnThos	MCS1x2
Fuente láser	Placa de microcontrolador Marwell Laser Systems	CNI MBL-III-473-100mW
placa	Arduino	"Uno"	se puede pedir a varias empresas
Microdrill	AgnThos	1474	se puede pedir con o sin soporte estereotáxico
Aguja (34G)	World Precision Instruments	NF36BV
Tinción de gel de ácido nucleico - GelRed	Biotium	41003-T
Tubos de PCR	Axygen	PCR-0208-CP-C
Medidor de potencia	Thorlabs	PM100D
Aparato de preferencia de lugar	Panlab	76-0278
Junta rotativa	Lentes dóricas	Manguitos FRJ_1x1_FC-FC
Lentes	dóricas	SLEEVE_ZR_1-25	Manguito de acoplamiento para conectar el latiguillo con la óptica implantada fibra
Cemento estabilizador	Ivoclar Vivadent	Tetric EvoFlow
Jeringa (10ul)	World Precision Instruments	NanoFil
Taq polimerasa	KAPA BIOSYSTEMS	KE1000	500U
Tampón TAE	Omega BIO-TEK	SKU:	concentración de 50x, debe diluirse antes de usar
Termociclador	BIO-RAD S1000	1852148	necesario para realizar reacciones de PCR
Pegamento tisular	AgnThos	Vetbond
Software de seguimiento	Noldus	Ethovision XT
Caja TTL	Noldus		USB-IO Noldus
Transiluminador UV		c200	Azure Biosystems